‘南林895杨’遗传转化体系的优化
转Bt基因南林895杨抗虫性及对土壤微生物影响分析
收稿 日期 ：２ １ －３１ ０ ２０ —５ 基金项 目：国家 “６ ” ８３ 高技术研究发展计划项 目“ 杨树分子育种与品种创 制” ２ １Ａ ０ ２ １ ； （０ １ Ａ１０ ０ ） 国家林 业公益性 行业科研专项 “ 杨树产 业资源材培育及新产 品开发关键技术研究（ ０ ０４ ０ ） 部分 内容 ２ １Ｏ ０ ” ４ 作者简介 ：张 雁 （９ Ｏ ） 男 ， １８ 一 ， 安徽合肥人 ， 博士研究生 ， 主要从事林 木分子育种研究 ． 通讯作者 ：教授 ， 博士生导师 ， 主要从事杨树遗传改 良 究． — ａ ： ｚ ｇ＠ｎ ｕ ｅ ｕ ｃ 研 Ｅ ｍ ｉ ｑｈ ｅ ｊ ．ｄ ．ａ ｌ ｕ ｆ
Ａｂｓｒ ｃ ｔ ａ ｔ：Ｄｕ ｉｇ ｔ ｒ ｗｉｇ ｓ ａ ｏ ｆ２ ｈ ｅ ｖ ｓｏ ｏ ｒＢｔｔａ ｓ ｅ ｉ ｌ ｎ ｓ Ｂ１，Ｂ ｒｎ ｈｅ ｇ ｏ ｎ ｅ ｓ ｎ ｏ ０１ １，ｔ ｅ ｌ ａ ｅ ｆｆｕ ｒ ｎ ｇ ｎ ｃ ｃｏ ｅ ４，Ｂ１ ｎ ｆＰｏ — ７ ａ ｄ Ｂ２１ ｏ ｐ ｕ ｕ ｅｔｉ ｅ × Ｐ． ｅ ｒ ｌｓ ｄ ｌｏｄ ｓ ｕ ａｍｅｉａ ａ Ｃ ． ‘ ｎ ｉ ８ ５’ｗｅｅ ｅ ｐ ｓ ｄ ｔ ｈ ａ ｇ ｔｐｅ ｔｌｌ ｅ ｏ ｉｒ ｍｅａｌｐ ｒ ｇ ． ｒｃ ｎ Ｖ Ｎａ ｌｎ ９ ｒ ｘ ｏ ｅ ｏ ｔ ｅ ｔｒ ｅ ｓ ａｇａ ｆＭ ｃ ｏ ｌ ｏ ｈａ ｔｏ １
转 基 因杨树对土壤微 生物 的影 响 ， 对转 基因杨树株系及对照进行 了根际土壤微 生物可培 养类群 的分析 ， 初步 结果显示 ： 成 基 因杨树根 际土壤微生物 中细菌、 转 真菌 、 放线菌的数量与对照 比较无显著差异。 关键词 ： 林 ８ ５杨 ；ｔ 因； 虫性 ； 南 ９ Ｂ基 抗 土壤微生物
南林895杨适应性生长监测
林业科技情报2019Vol.51No.1南林895杨适应性生长监测王克林（湖北省鄂州市不动产登记中心，湖北鄂州436000）［摘要］南林895杨是南京林业大学所选育出的新品种，有着速生、优质、高产等诸多特点。
为了更好的推广改良品种，并取得良好的经济效益，对南林895杨适应性生长监测结果进行了分析，更好的了解了南林895杨适应性，也因其特点显著，对其进行了监测及监测分析。
［关键词］南林895杨；适应性；监测Monitoring of Adaptive Growth of Nanjing ForestryUniversity895Populus L．Wang Kelin（Hubei EzhouＲeal EstateＲegistration Center，Ezhou，Hubei436000）Abstract：895Populus L．is a new breed bred by Nanjing Forestry University，which has many characteristics such as fast growth，perfect quality and high yield．In order to popularize improved breed and achieve good economic benefits，the results of adaptive growth monitoring of Nanjing Forestry University895Populus L．were analyzed．Be-cause of its remarkable characteristice，it was monitored and analyzed．Key words：Nanjing Forestry University895Populus L．；adaptability；monitor南林895杨是南京林业大学“九五”科技攻关选育出的新品种，具有速生、优质、高产等特点，2002年通过国家林木良种审定，是国家林业局重点推广的杨树新品种，适宜在黄淮平原、江淮平原及长江中下游平原生长。
农杆菌介导棉花遗传转化体系优化
农杆菌介导棉花遗传转化体系优化棉花纤维是纺织工业的重要原料,利用基因工程的方法遗传改良棉花纤维品质是棉花分子育种的重要方向。
GbMYB2基因cDNA是从海岛棉中克隆出一段长度为747bp的开放读码框,本实验室前期的研究结果证实:在拟南芥中过量表达GbMYB2基因能够能够增加表皮毛的数目、根的长度。
为了进一步研究GbMYB2基因在棉花中的功能,本研究在完善棉花遗传转化体系的同时,利用农杆菌遗传转化的方法将其转入棉花获得转基因的植株。
农杆菌介导的棉花遗传转化体系通常以下胚轴为外植体,经历愈伤组织、胚性愈伤组织、体胚胎发生等过程获得再生植株。
但该遗传转化体系通常受到基因型限制、转化周期长、成胚率低等因素的限制。
为了解决上述有关问题,本文在前人的工作基础上对体系进行优化,分别从两个方面(以胚性愈伤为受体的转化体系和以茎尖为受体)对农杆菌的遗传转化体系进行了探讨,结果如下:1.对以下胚轴为受体的遗传转化体系进行了优化:首先,针对棉花遗传转化体系的面临的转化效率低的问题,对外植体、农杆菌浓度、共培养时间、农杆菌菌株、C源以及凝固剂等进行研究和对比,结果显示:50mg/L卡纳霉素可以有效筛选抗性愈伤组织;下胚轴是该转化体系的最佳外植体;LBA4405和EHA105均可作为该转化体系的工程菌菌株;农杆菌浓度控制在OD600为0.5左右;最佳共培养时间为48h；以葡萄糖为C源可减少褐化。
其次，针对转化体系中转化周期长和工作量大的问题，对继代次数以及不同形态的非胚性愈伤组织产胚能力以及生长速度等进行了分析，结果显示：MSB5培养基继代次数两次；绿色和灰色相间的颗粒状非胚性愈伤组织生长速度和产胚能力最高；对非胚性愈伤及时进行分化培养可缩短转化周期；最后，针对转化体系中畸形胚发生率高的问题，对转化程序进行了优化，结果显示：应在加有滤纸的分化培养基上诱导产生胚后及时转入营养物质充足在的未加滤纸的培养基中进一步培养，并及时转接。
农杆菌介导的辣椒遗传转化体系优化及Chi和Glu基因转化植株的鉴定
农杆菌介导的辣椒遗传转化体系优化及Chi和Glu基因转化植株的鉴定专业品质权威编制人：______________审核人：______________审批人：______________编制单位：____________编制时间：____________序言下载提示：该文档是本团队精心编制而成，期望大家下载或复制使用后，能够解决实际问题。
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《三倍体毛白杨遗传转化体系的建立及分子鉴定》
《三倍体毛白杨遗传转化体系的建立及分子鉴定》一、引言三倍体毛白杨作为一种重要的林木资源，其遗传转化体系的建立对于林木遗传育种、基因功能研究以及林木生物技术发展具有重要意义。
本文旨在介绍三倍体毛白杨遗传转化体系的建立过程，并对其分子鉴定进行详细阐述。
二、材料与方法1. 材料（1）植物材料：三倍体毛白杨；（2）分子生物学试剂与仪器：各种限制性内切酶、连接酶、PCR试剂等，电击转化仪、PCR仪、凝胶成像系统等。
2. 方法（1）遗传转化体系的建立：包括选择适宜的外植体、建立农杆菌介导的遗传转化体系等；（2）分子鉴定：包括基因组DNA的提取、PCR扩增、酶切鉴定、测序等。
三、三倍体毛白杨遗传转化体系的建立1. 外植体的选择与处理选择生长健壮、无病虫害的三倍体毛白杨作为外植体。
将外植体进行消毒处理，去除表面杂质及微生物，为后续的遗传转化做好准备。
2. 农杆菌介导的遗传转化采用农杆菌介导的方法，将目的基因与载体连接后转入农杆菌中。
将处理好的外植体与农杆菌共培养，使目的基因转入三倍体毛白杨的基因组中。
3. 转化体的筛选与鉴定通过PCR扩增、酶切鉴定等方法，对转化体进行初步筛选。
将筛选得到的阳性转化体进行分子水平的鉴定，确认目的基因是否已成功转入三倍体毛白杨的基因组中。
四、分子鉴定1. 基因组DNA的提取采用适当的DNA提取方法，提取三倍体毛白杨的基因组DNA。
确保DNA的质量和纯度，为后续的分子鉴定提供可靠的样品。
2. PCR扩增与酶切鉴定以提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。
通过酶切鉴定等方法，对PCR产物进行初步鉴定。
若PCR产物与预期的目的片段大小相符，则可初步确定目的基因已成功转入三倍体毛白杨的基因组中。
3. 测序与分析将PCR产物进行测序，将测序结果与已知的目的基因序列进行比对。
通过比对结果，可以进一步确认目的基因的插入位置、插入方向以及是否存在突变等情况。
同时，还可以对目的基因的表达情况进行初步分析。
转双Bt基因杨树生长变异机制及抗虫性解析
针对转双bt基因杨树的基因污染和潜 在风险，需要加强安全管理，确保其 不会对人类健康和生态环境造成危害 。
03
需要解决抗虫谱狭窄 问题
为了更好地满足实际需求，需要解决 转双bt基因杨树抗虫谱狭窄的问题， 提高其对更多害虫的抵抗能力。
05
研究展望与未来发展趋势
加强转基因杨树的分子机制研究
总结词
好地了解转基因杨树的生长发育规律和抗性 机制。
02
转双bt基因杨树的抗虫性主要针对鳞翅目和鞘翅目害虫，对其
他害虫的抵抗能力较弱。
长期影响未知
03
转双bt基因杨树的长期影响尚不明确，可能存在潜在的风险和
问题。
转双bt基因杨树的发展前景及挑战
01
发展前景广阔
02
需要加强安全管理
随着生物技术的不断进步和人们对转 基因技术的认识和接受程度的提高， 转双bt基因杨树具有广阔的发展前景 。
材质改善
转双bt基因杨树的材质更加致密、坚韧，不易受虫害 ，适合制作高档木材。
转基因杨树的变异特征
形态变异
转双bt基因杨树的形态可能会出现变异，如树 高、直径、枝条形态等。
生理变异
转双bt基因杨树的生理特性也可能出现变化， 如光合作用、水分吸收和养分利用等。
遗传稳定性
转双bt基因杨树的遗传稳定性需要经过验证，以确保不会对下一代造成不可预 测的影响。
转双bt基因杨树生长变异机 制及抗虫性解析
2023-11-08
目 录
• 转基因杨树概述 • 转双bt基因杨树生长变异机制 • 转双bt基因杨树抗虫性解析 • 转双bt基因杨树的优缺点及前景展望 • 研究展望与未来发展趋势
01
转基因杨树概述
转基因杨树的概念
中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol25 No9 2005
中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(9):94～98植物遗传转化新技术和新方法*陈英黄敏仁**王明庥（南京林业大学林木遗传和基因工程重点实验室南京210037）摘要目前通过遗传转化技术获得了许多植物的转基因植株，一些重要农作物转基因新品种已进入产业化阶段，展现出极好的应用前景。
但随着研究的不断深入，在如何提高遗传转化效率和转基因安全性等方面，一些新的技术和方法不断出现并得到应用，如胚状体再生系统、叶绿体转化系统、超声波辅助农杆菌介导法、位点特异重组MAT vector系统、正选择系统以及新的转基因分子检测方法，使遗传转化技术向高效、安全方向发展，新一代的转基因植物也将会更适应人们和生态环境的需求。
关键词植物基因工程遗传转化效率转基因安全性收稿日期：2005 04 28修回日期：2005 06 09*江苏省高技术研究项目（BG2003304）和校高学历人才基金项目** 通讯作者，电子信箱：mrhuang@随着植物遗传转化技术的不断改进，越来越多的植物获得了转基因植株，一些重要的农作物，如棉花、玉米、番茄等，通过转基因技术培育的优良新品种，已得到大面积推广，获得了可观的经济效益。
近年来，在进一步提高转基因效率，外源基因定点、定量、稳定地转移到植物基因组，外源基因在转基因植物及后代中的遗传和表达等方面进行了深入地研究。
而同时，基于公众对转基因植物的安全性产生的疑虑和争议，促使人们继续探索和发现新的更为安全和有效的转化体系，如叶绿体转化研究和无选择标记研究也取得了重要进展，引起人们的普遍关注。
本文就目前应用于植物遗传转化领域的新技术和新方法进行综述。
1新的遗传转化受体系统——胚状体再生系统成功的遗传转化首先依赖于良好的植物受体系统。
胚状体再生系统是最理想的基因转化受体系统：体细胞胚是由具有卵细胞特性的胚性细胞发育而来，接受外源DNA的能力强，是理想的基因转化感受态细胞；体胚发生多为单细胞起源，转基因植株嵌合体少；体胚具有两极性，在发育过程中可同时分化出芽和根，形成完整植株；体细胞胚个体间遗传背景一致，无性系变异小；体胚发生繁殖效率高、可通过生物反应器进行大规模生产。
杨树抗逆转录因子基因遗传转化与功能验证
杨树抗逆转录因子基因遗传转化与功能验证林木作为重要的可再生资源,对维持和保护生态环境具有重要作用,随着目前生态系统退化情况加剧情况的加剧,林木的产量和质量及森林生产力受到严重影响。
因此培育抗逆林木新品种,改良利用干旱、半干旱及盐碱荒地,推动土地资源的开发利用,改善环境资源,已经成为当前研究热点。
基因工程技术可以从基因水平上改良林木的目的性状,为林木遗传改良育种开辟新的途径。
本研究以杨树新品种凌丰2号杨（Populus×euramericana cl.?Lingfeng 2‘）为受体材料,采用农杆菌介导法首次进行三个抗逆转录因子基因——茉莉酸乙烯应答元件基因（JERF36）、锌指蛋白基因（ZxZF）、ABA响应元件结合蛋白基因（ckAREB）多组合遗传转化研究。
通过室内抗性生理测定,根系Na<sup>+</sup>、K<sup>+</sup>、H<sup>+</sup>离子流测定,定量抗逆相关基因表达,进行转基因杨树抗逆能力测定,获得抗性效果显著的转基因杨树。
本研究对多组合转录因子导入改良杨树抗性作用机制的探讨及转录因子基因在林木育种中的应用,培育高效林木基因工程新品种具有一定的理论指导意义。
论文主要研究结果如下:1.成功构建抗逆转录因子双基因载体和三基因植物表达载体。
首次将来源于强旱生灌木霸王（Zygophyllum xanthoxylum）的锌指蛋白基因（ZxZF）和柠条（Caragana Korshinskii）的ABA响应元件结合蛋白基因（ckAREB）及来源于草本植物番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）的茉莉酸乙烯应答元件基因（JERF36）三个不同调控途径转录因子以多种组合方式构建到同一植物表达载体上,成功构建JERF36-ckAREB双基因植物表达载体（pBIJEAR）及ZxZF–ckAREB-JERF36三基因植物表达载体（pMDCZXARJE）,实现多抗逆调控基因相对稳定串联。
发根农杆菌介导的闽楠遗传转化体系构建与优化
核农学报2023，37（8）：1516~1522Journal of Nuclear Agricultural Sciences发根农杆菌介导的闽楠遗传转化体系构建与优化吴梦洁1洪家都1李芳燕1周生财2林二培1程龙军1， *（1浙江农林大学林业与生物技术学院/亚热带森林培育国家重点实验室，浙江杭州311300；2丽水职业技术学院，浙江丽水323000）摘要：闽楠［Phoebe bournei（Hemsl.） Yang］为我国重要的珍贵树种。
为建立闽楠遗传转化体系，以闽楠幼苗为材料，利用pCAMBIA1300-GFP质粒转化的发根农杆菌介导植株转化。
在比较注射和菌液浸泡两种侵染方式侵染效率的基础上，进一步利用正交［L9（33）］试验从菌株种类、菌液侵染浓度和侵染植株苗龄三个方面优化了遗传转化体系。
另外，对不同光强影响闽楠毛状根诱导及转化率情况进行了分析。
结果表明，注射法的毛状根诱导率和遗传转化率分别为80.0%、66.7%；而菌液浸泡法的诱导率和遗传转化率分别为41.2%、35.3%。
正交试验中，影响闽楠毛状根诱导率和遗传转化率的主要因素为菌株种类。
最大诱导率和转化效率分别达到了87.5%、70.6%。
该体系的最优组合为：K599菌株在菌液浓度OD600=1.2条件下注射侵染三叶期的闽楠幼苗。
此外，较弱光强（50 µmol·m-2·s-1）的培养条件比较强光照（100 µmol·m-2·s-1）更有利于闽楠幼苗的生长和遗传转化。
本研究创建并优化了一套高效、稳定的闽楠遗传转化体系，成功获得了具有转基因毛状根的闽楠植株，为闽楠重要基因挖掘、新种质创建和遗传改良奠定了基础。
关键词：闽楠；遗传转化；发根农杆菌DOI：10.11869/j.issn.1000‑8551.2023.08.1516闽楠属于樟科（Lauraceae）楠属（Phoebe）植物，是我国重要的珍贵树种［1］。
《兴安落叶松UGPase基因在84K杨遗传改良中的应用》范文
《兴安落叶松UGPase基因在84K杨遗传改良中的应用》篇一一、引言遗传改良是林业发展的关键环节，能够提升树种的生产效率和适应各种生长环境。
随着生物科技的快速发展，越来越多的基因技术被应用到林业遗传改良中。
兴安落叶松（Larix gmelinii）作为一种重要的林木资源，其UGPase（尿苷二磷酸葡萄糖磷酸化酶）基因在植物代谢中扮演着重要角色。
本文将探讨兴安落叶松UGPase基因在84K杨遗传改良中的应用，以期为林业的可持续发展提供新的思路。
二、兴安落叶松UGPase基因简介UGPase是一种重要的酶，参与植物细胞中糖代谢的调节。
它通过催化尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）与磷酸形成尿苷二磷酸葡萄糖磷酸（UDPG-P）的转化，对植物的生长和发育产生重要影响。
兴安落叶松作为典型的北方针叶树种，其UGPase基因的表达特性对植物的抗逆性、光合作用等具有重要作用。
三、84K杨的遗传改良背景84K杨是我国自主选育的一种优良杨树品种，具有生长迅速、抗逆性强等特点。
然而，为了进一步提高其生长效率和适应性，需要对其进行遗传改良。
通过将其他优良树种的基因导入84K杨，可以增强其抗病性、抗虫性以及适应性等。
而兴安落叶松UGPase基因的引入，将为84K杨的遗传改良提供新的方向。
四、兴安落叶松UGPase基因在84K杨遗传改良中的应用1. 抗逆性增强：通过克隆兴安落叶松UGPase基因并转入84K杨，可以提高其在逆境条件下的生存能力。
例如，在干旱、低温等条件下，该基因的表达可以增强植物的抗逆性，从而提高其适应性。
2. 生长速度提升：UGPase基因的导入可以改善植物的光合作用效率，提高光合产物的积累和分配，从而促进植物的生长速度。
通过将兴安落叶松UGPase基因与84K杨的遗传体系相结合，可以进一步加快其生长速度，提高其生物量。
3. 优化代谢途径：通过调控UGPase基因的表达，可以影响植物细胞中糖代谢的途径和速率。
这有助于优化植物的营养分配和代谢过程，提高其整体生长效率和品质。
马铃薯高效再生及遗传转化体系的优化
接分化再生体系的存在
[16-18]
,导致马铃薯试验所需试验条件
及培养基组成等差异明显。 笔者研究了不同激素配比对马
作者简介 张薇(1980—) ,女,湖北武汉人,副教授,硕士,从事蔬菜生
产、职业教育研究。
收稿日期 2023-02-07
表 1 不同激素浓度配比对愈伤组织诱导及芽分化的影响
Table 1 Effect of different hormone concentration ratio on callus induction and bud differentiation
梯度
Gradient
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
比为 2. 5 mg / L ZR+1. 0 mg / L IAA+0. 2 mg / L GA3(表 1 10 号
rate were great different under the ratio of different hormone concentration. The hormone ratio of 2. 0 mg / L ZR and 0. 1 mg / L IAA could regenerate the buds efficiently, the germination rate was as high as 100%, and the bud growth was strong. By constructing expression vector
种薯
[7-8]
。
许多国内外研究者[9-12] 对马铃薯再生体系进行了研究,
84K杨再生和遗传转化体系的优化
第35卷 第7期西北农林科技大学学报(自然科学版)Vol.35No.7 2007年7月Journal of Northwest A&F University(Nat.Sci.Ed.)J ul.2007384K杨再生和遗传转化体系的优化李科友,樊军锋,赵 忠,周永学,高建社(西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100)[摘 要] 为了优化84K杨的再生和遗传转化体系,以84K杨树叶片为外植体,采用正交试验研究了不同培养基和激素配比对芽和芽苗生根的影响,并从预培养时间、浸染菌液浓度、浸染时间、共培养时间及添加AS(乙酰丁香酮)5个方面,以卡那霉素抗性苗频率为衡量指标,研究了各因素对84K杨遗传转化率的影响。
结果表明,84K杨叶片最适的芽诱导培养基及激素配比为MS+62BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L,芽苗最适诱导生根培养基及激素配比为1/2MS+NAA0.05mg/L+IBA0.05mg/L;优化筛选的最适转化体系为:农杆菌活化菌液用MS液体培养基稀释10倍,浸染5min,共培养4d。
采用上述优化的再生和遗传转化体系,84K杨每片叶平均生芽数可达20个,芽苗生根率可达99%,生根数为6条,叶盘转化率可达35%。
[关键词] 84K杨;再生系统;遗传转化;转化率[中图分类号] S792.119.04[文献标识码] A[文章编号] 167129387(2007)0720090207Prioritization of the system of regeneration and genetictransformation of Populus84KL I Ke2you,FAN J un2feng,ZHAO Zhong,ZHOU Y ong2Xue,GAO Jian2she(College of Forest ry,N ort hwest A&F Universit y,Yangling,S haanx i712100,China) Abstract:To p rioritize t he system of regeneration and genetic t ransformation of Pop ulus84K,influ2 ences of different medium and p roportion of hormone on bud and root of leaf2explant were st udied by or2 t hogonal designing.The impact of five aspect s(pre2cult ure time,t he concent ration of agro2infection,infect time,co2cult ure time and addition of AS)on genetic t ransformation f requency of Pop ulus84K was st ud2 ied,wit h t he rate of kanamycin resistance seedling as t he measure index.The result s demonst rated t hat t he optimal differentiation medium and proportio n of hormone for leaf2explant was MS+BA0.5mg/L+NAA 0.05mg/L,and t he optimal rooting medium and p roportion of hormone for shoot was1/2MS+NAA0.05 mg/L+IBA0.05mg/L.The optimal prioritization optimal system was as follows:to use MS dilute activa2 ted agro2infection for10times,to infect5minutes and to co2cult ure for4days.By adopting above prioriti2 zation system of regeneration and genetic t ransformatio n,every leaf of pop ulus84K could be induced20 buds on average,rooting rate achieved99%,rooting number was6,and transforming rate of leaf disc was 35%.K ey w ords:Pop ulus84K;regeneration system;genetic transformation;t ransforming rate 84K杨(银腺杨,Pop ul us alba×Pop ul us gl an d ulosa)是南韩培育成功的一个著名白杨派内3[收稿日期] 2006212212[基金项目] 科技部国家转基因植物研究与产业化专项(J Y032B226202)[作者简介] 李科友(1962-),男,陕西武功人,副教授,主要从事林木生物技术和植物化学研究。
雄性二倍体毛白杨再生体系的构建和遗传转化的研究
第４６卷㊀第１期２０２２年１月南京林业大学学报（自然科学版）ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＥｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．４６，Ｎｏ．１Ｊａｎ．，２０２２ＤＯＩ：１０．１２３０２／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－２００６．２０２０１２０２９㊀收稿日期Ｒｅｃｅｉｖｅｄ：２０２０⁃１２⁃１９㊀㊀㊀㊀修回日期Ａｃｃｅｐｔｅｄ：２０２１⁃０４⁃１４㊀基金项目：江苏省自然科学基金面上项目（ＢＫ２０１６１５２５）；国家重点研发计划（２０１６ＹＦＤ０６００１０１）㊂㊀第一作者：俞子承（ｙｕｚｃ１０２０＠１６３．ｃｏｍ），博士生㊂∗通信作者：李小平（ｘｐｌｉ＠ｎｊｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ），副教授㊂㊀引文格式：俞子承，凌聪，陈赢男，等．雄性二倍体毛白杨再生体系的构建和遗传转化的研究［Ｊ］．南京林业大学学报（自然科学版），２０２２，４６（１）：１８７－１９６．ＹＵＺＣ，ＬＩＮＧＣ，ＣＨＥＮＹＮ，ｅｔａｌ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍａｎｄｓｔｕｄｙｏｎｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａ⁃ｔｉｏｎｆｏｒｍａｌｅｄｉｐｌｏｉｄＰｏｐｕｌｕｓｔｏｍｅｎｔｏｓａ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＥｄｉｔｉｏｎ），２０２２，４６（１）：１８７－１９６．ＤＯＩ：１０．１２３０２／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－２００６．２０２０１２０２９．雄性二倍体毛白杨再生体系的构建和遗传转化的研究俞子承，凌㊀聪，陈赢男，李淑娴，尹佟明，李小平∗（南京林业大学林学院，南方现代林业协同创新中心，江苏㊀南京㊀２１００３７）摘要：ʌ目的ɔ建立雄性二倍体毛白杨再生体系，构建稳定的遗传转化方法，为进一步研究毛白杨基因功能提供试验平台㊂ʌ方法ɔ以雄性二倍体毛白杨的幼嫩茎段和叶片为外植体，１／２ＭＳ为基本培养基，通过调整６⁃ＢＡ㊁ＩＡＡ和ＴＤＺ激素浓度进行再生体系筛选；采用农杆菌ＥＨＡ１０５介导叶盘法，控制预培养时间㊁菌液浓度㊁侵染时间㊁共培养时间和卡那霉素筛选浓度，进行遗传转化；以幼嫩叶片原生质体为受体细胞，ＰＥＧ介导转化荧光标记基因ＥＧＦＰ，进行瞬时表达㊂ʌ结果ɔ雄性二倍体毛白杨再生过程包括继代㊁芽伸长和生根３个阶段，其培养基组分分别为１／２ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌ６⁃ＢＡ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．００５ｍｇ／ＬＴＤＺ㊁１／２ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌ６⁃ＢＡ＋０．３ｍｇ／ＬＮＡＡ和１／２ＭＳ＋０．３ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．５ｍｇ／ＬＩＢＡ，该条件下生根率为９６．７％，增殖系数为４．４７㊂遗传转化过程包括预培养㊁农杆菌侵染㊁共培养㊁抗性筛选和生根５个阶段，其中预培养为１２ｈ㊁农杆菌浓度ＯＤ６００为０．４㊁侵染时间为２０ｍｉｎ㊁共培养时间为２４ｈ㊁卡那霉素（３０ｍｇ／Ｌ）筛选４５ｄ和抗性苗生根２０ｄ㊂试验共获得８６株抗性植株，其中１４株分子鉴定结果为阳性㊂在４０％ＰＥＧ４０００的介导下，ＥＧＦＰ基因瞬间转化效率为５０％㊂ʌ结论ɔ雄性二倍体毛白杨再生周期短㊁遗传转化稳定，是杨树基础研究的理想材料㊂本研究拓宽了杨树遗传转化体系，为杨树分子辅助育种提供了新途径㊂关键词：二倍体毛白杨；再生体系；遗传转化；瞬时表达中图分类号：Ｓ７９２．１１７㊀㊀㊀㊀㊀文献标志码：Ａ开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：文章编号：１０００－２００６（２０２２）０１－０１８７－１０ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍａｎｄｓｔｕｄｙｏｎｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｆｏｒｍａｌｅｄｉｐｌｏｉｄＰｏｐｕｌｕｓｔｏｍｅｎｔｏｓａＹＵＺｉｃｈｅｎｇ，ＬＩＮＧＣｏｎｇ，ＣＨＥＮＹｉｎｇｎａｎ，ＬＩＳｈｕｘｉａｎ，ＹＩＮＴｏｎｇｍｉｎｇ，ＬＩＸｉａｏｐｉｎｇ∗（Ｃｏ⁃ＩｎｎｏｖａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｆｏｒｔｈｅＳｕｓｔａｉｎａｂｌｅＦｏｒｅｓｔｒｙｉｎＳｏｕｔｈｅｒｎＣｈｉｎａ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００３７，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ʌＯｂｊｅｃｔｉｖｅɔＴｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍａｎｄｔｈｅｓｔａｂｌｅｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｆｍａｌｅｄｉｐｌｏｉｄＰｏｐｕｌｕｓｔｏｍｅｎｔｏｓａｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅａｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎ．ʌＭｅｔｈｏｄɔＴｈｅｉｎｆａｎｃｙｓｔｅｍｓｅｇｍｅｎｔｓａｎｄｌｅａｖｅｓｏｆｍａｌｅｄｉｐｌｏｉｄＰ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｓｅｘｐｌａｎｔｓａｎｄｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆ６⁃ＢＡ，ＩＡＡａｎｄＴＤＺ，ｂａｓｅｄｏｎ１／２ＭＳｂａｓｉｃｍｅｄｉｕｍ．ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＥＨＡ１０５ｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｖｉａｔｈｅｌｅａｆｄｉｓｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ；ｉｔｗａｓｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｐｒｅ⁃ｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅ，ｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｔｉｍｅ，ｃｏ⁃ｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅ，ａｎｄｔｈｅｋａｎａｍｙｃｉｎｓｃｒｅｅｎｉｎｇｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓｏｆｙｏｕｎｇｌｅａｖｅｓｗｅｒｅｕｓｅｄａｓｒｅｃｅｐｔｏｒｃｅｌｌｓａｎｄｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｍａｒｋｅｒｇｅｎｅ，ＥＧＦＰ，ｕｓｉｎｇｔｈｅｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｔｈｏｄ．ʌＲｅｓｕｌｔɔＴｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｍａｌｅｄｉｐｌｏｉｄＰ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａｉｎｖｏｌｖｅｓｔｈｒｅｅｓｔａｇｅｓ：ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ，ｂｕｄｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ，ａｎｄｒｏｏｔｉｎｇ．Ｔｈｅｍｅｄｉｕｍｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｗｅｒｅ：１／２ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌ６⁃ＢＡ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．００５ｍｇ／ＬＴＤＺ１／２ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌ６⁃ＢＡ＋０．３ｍｇ／ＬＮＡＡａｎｄ１／２ＭＳ＋０．３ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．５ｍｇ／ＬＩＢＡ；ｔｈｅｒｏｏｔｉｎｇｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｗａｓ９６．７％ａｎｄｔｈｅｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｗａｓ４．４７．Ｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｇｅｎｅｔｉｃ. All Rights Reserved.南京林业大学学报（自然科学版）第４６卷ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｖｏｌｖｅｄｆｉｖｅｓｔａｇｅｓ：ｐｒｅ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ，ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｃｏ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ，ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｓｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄｒｏｏｔｉｎｇ．Ｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｌａｎｗａｓｐｒｅ⁃ｃｕｌｔｕｒｅｆｏｒ１２ｈ，ｗｉｔｈａｎａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＯＤ６００ａｓ０．４，ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ⁃ｔｉｍｅｏｆ２０ｍｉｎ，ｃｏ⁃ｃｕｌｔｕｒｅｔｉｍｅｏｆ２４ｈ，ｋａｎａｍｙｃｉｎ（３０ｍｇ／Ｌ）ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｏｒ４５ｄ，ａｎｄｒｅｓｉｓｔａｎｔｓｅｅｄｌｉｎｇｓｒｏｏｔｉｎｇｆｏｒ２０ｄ．Ａｔｏｔａｌｏｆ８６ｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ；ａｍｏｎｇｔｈｅｍｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ１４ｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｓｔａｂｌｅ．ＴｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｔｈｅＥＧＦＰｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｗａｓ５０％ｕｎｄｅｒｔｈｅｇｕｉｄａｎｃｅｏｆ４０％ＰＥＧ４０００．ʌＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎɔＴｈｅｍａｌｅｄｉｐｌｏｉｄＰ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａｗａｓｒａｐｉｄｌｙｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄａｎｄｅｘｈｉｂｉｔｅｄｇｏｏｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ；ｉｔｗａｓｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄａｎｉｄｅａｌｍａｔｅｒｉａｌｆｏｒｂａｓｉｃｐｏｌａｒｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｔｈｉｓｓｔｕｄｙｂｒｏａｄｅｎｅｄｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆｐｏｐｌａｒａｎｄｐｒｏｖｉｄｅｄａｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒａｓｓｉｓｔｅｄｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆｐｏｐｌａｒ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄｉｐｌｏｉｄＰｏｐｕｌｕｓｔｏｍｅｎｔｏｓａ；ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ；ｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ㊀㊀毛白杨（Ｐｏｐｕｌｕｓｔｏｍｅｎｔｏｓａ）原产于中国，具有生长快速㊁轮作周期短㊁材质优良㊁环境适应性强等特点，不仅是常见的速生用材和造林树种，也广泛应用于庭园和道路绿化，同时还是理论研究和遗传改良的理想材料［１－２］㊂自然条件下毛白杨为野生三倍体，通常伴随雄蕊异常㊁花药萎缩㊁花粉败育消失等育性现象，制约了杂交育种的开展㊂此外，三倍体植株拥有额外一组染色体，增加了遗传背景的复杂度，给基因功能的解析㊁测序片段的拼接和基因编辑位点的选择带来困扰，阻碍了组学测序及基因编辑等新技术的应用㊂因此，为了进一步开展毛白杨速生生长㊁性别发育相关等功能基因的研究，选用二倍体优良植株进行遗传转化体系的构建显得尤为重要㊂南京林业大学林木遗传育种重点实验室杨树课题组早先对我国南方毛白杨自然种质资源进行了收集，并利用流式细胞仪对其染色体倍性进行测定，发现多株长势良好的二倍体雄株，给毛白杨基因功能的研究带来了契机㊂近年来，基因工程技术因其目的性强㊁可靠性高㊁育种周期短等优势，在世代周期长㊁遗传背景复杂的木本植物中广泛应用［３］㊂毛白杨的遗传转化主要选用农杆菌介导的叶盘法，植物材料㊁菌株类型㊁质粒载体等诸多因素协同影响整个进程［４］㊂现有的遗传转化研究大多选用三倍体植株为试验材料，其余所用材料也是倍性不明，鲜有二倍体材料的研究报道㊂此外，基于不同毛白杨植物材料构建优化的遗传转化体系各不相同，菌液浓度㊁侵染时间以及共培养时间等关键试验条件相差较大㊂龙萃等［５］对转化体系优化后发现，侵染液在６００ｎｍ波长的吸光值为０．３ ０．５时，对应的转化率为９．３８％；而Ｄｕ等［６］和Ｊｉａ等［７］则选用了６００ｎｍ波长时吸光值为０．８的侵染液，作为最优侵染条件㊂因此，针对选用的植物材料进行试验条件的筛选显得十分重要［８－９］㊂现阶段，缺乏稳定的再生体系是毛白杨遗传转化的主要障碍［９－１１］㊂从外源基因整合受体基因组，到脱分化形成完整独立再生植株，组织培养再生体系贯穿了整个遗传转化试验流程［１２］㊂再生体系的发展离不开植物激素的分离和使用，外源激素有效促进了生长发育，提高了繁殖效率，缩短了再生周期［１３］㊂杨属植物组织培养技术比较成熟，主要选用６⁃苄氨基嘌呤（６⁃ＢＡ）和萘乙酸（ＮＡＡ）等作为外源激素，近年来有学者在再生体系中添加苯基噻二唑基脲（ＴＤＺ），有效提高了植株的繁殖系数［１４－１７］㊂本研究选用优良单株雄性二倍体毛白杨为材料，对组织培养的激素组合及农杆菌介导遗传转化的主要试验条件进行筛选，建立并优化二倍体毛白杨再生体系和遗传转化体系，以期为其他木本植物遗传转化研究提供参考，并为后期分子辅助育种奠定基础㊂１㊀材料与方法１．１㊀试验材料试验材料采集于江苏省南京市玄武湖公园，选取优良基因型雄性二倍体毛白杨幼嫩含芽的茎段与枝条作为外植体㊂通过再生体系培育扩繁，获得无性系㊂选择优质组培苗移栽并存放于南京林业大学林木遗传育种系温室㊂１．２㊀试验方法１．２．１㊀雄性二倍体毛白杨确定采用流式细胞仪对选取的雄性二倍体毛白杨样品单细胞的ＤＮＡ大小进行检测，通过与标准品番茄样品的比较，确定选取植株的倍性㊂１．２．２㊀雄性二倍体毛白杨外植体消毒采集枝条上包含嫩芽的茎段，清除表面灰尘，流水冲洗１ ２ｈ㊂使用７０％（体积分数）乙醇与１０％（质量分数）次氯酸钠溶液分别对毛白杨茎段消毒，消毒时间各设置３个水平（７０％乙醇消毒２０㊁３０和４０ｓ；次氯酸钠消毒５㊁１０和１５ｍｉｎ），共９个处理㊂消毒期间用无菌水多次冲洗，最后接种于相应培养基㊂每个处理接种５０个茎段㊂７ｄ后统计染菌率㊁褐化率以及死亡率㊂８８１. All Rights Reserved.㊀第１期俞子承，等：雄性二倍体毛白杨再生体系的构建和遗传转化的研究１．２．３㊀雄性二倍体毛白杨各阶段培养基筛选基本培养基筛选：分别配置１／４ＭＳ㊁１／２ＭＳ㊁ＭＳ培养基与ＷＰＭ培养基，每种培养基中分别接种３０个外植体顶芽㊂分别于１０ｄ与２０ｄ时统计不同培养基中顶芽的生长情况㊂生根培养基筛选：在外植体培养中选择生长阶段相近的顶芽，去除多余叶片后插入基本培养基中，同时添加不同浓度的激素ＮＡＡ与ＩＢＡ㊂两种外源激素各设置３个水平（０．３㊁０．５和０．７ｍｇ／Ｌ），共９个处理㊂每个生长瓶中接种１个顶芽，每个处理１０瓶，２０ｄ后观察生根情况㊂继代培养基筛选：选取生长旺盛的无菌苗叶片进行增殖继代培养㊂３种外源激素各设置３个水平（６⁃ＢＡ设置０．３㊁０．５和０．７ｍｇ／Ｌ；ＮＡＡ设置０．３㊁０．５和０．７ｍｇ／Ｌ；ＴＤＺ设置０．００５㊁０．０１０和０．０１５ｍｇ／Ｌ），按照３因素３水平正交表设计试验㊂叶片均匀切成１ｃｍˑ１ｃｍ大小的叶盘，放置于不同激素处理的培养基中，每个处理各接种３０片叶盘，每１４ｄ更换培养基，统计增殖系数㊂芽伸长培养基筛选：选择继代培养基中生长状态相似的不定芽进行试验㊂两种外源激素各设置３个水平（６⁃ＢＡ为０ １㊁０ ３和０ ５ｍｇ／Ｌ；ＮＡＡ为０ １㊁０ ３和０ ５ｍｇ／Ｌ），共９个处理㊂每个处理接种３０个不定芽，每２０ｄ更换培养基，清除死亡或褐化的材料，于４０ｄ后统计不定芽生长长度㊂１．２．４㊀二倍体毛白杨转化体系的构建采用叶盘转化法，选择含有ＧＵＳ报告基因的植物表达载体ｐＢＩ１２１和根癌农杆菌菌株ＥＨＡ１０５进行试验㊂植物材料为生长４５ ６０ｄ的二倍体毛白杨无性系组培苗㊂试验过程中对影响毛白杨转化效率的因素进行筛选㊂预培养时间筛选：将叶盘接种于不含外源激素的愈伤分化培养基中，分别在无光环境中培养不同时间㊂预培养时间设置为０㊁１２㊁２４和４８ｈ（０ｈ为对照组）㊂每个处理接种１００个叶盘，观察不同处理下叶盘的分化情况，统计产生抗性芽的叶盘数㊂侵染液浓度与侵染时间筛选：选择不同的侵染液浓度和侵染时间进行试验㊂菌液在６００ｎｍ波长的吸光值梯度设定为０ ２㊁０．４㊁０．６和０．８；侵染时间为１０㊁２０和３０ｍｉｎ㊂每个处理接种５０个叶盘，观察分化情况，统计产生抗性芽的叶盘数㊂共培养时间筛选：叶盘完成侵染后，擦干表面多余菌液，转移至最优分化培养基中，于黑暗环境中共培养不同时间㊂共培养时间梯度设定为：８㊁１６㊁２４㊁３２㊁４０㊁４８和５６ｈ㊂每个处理接种５０个叶盘，统计产生抗性芽的叶盘数㊂卡那霉素浓度筛选：将叶盘接种在含有不同卡那霉素的最优分化培养基上，添加Ｈｙｇ１０ｍｇ／Ｌ＋Ｃｅｆ２００ｍｇ／Ｌ＋Ｔｉｍ２００ｍｇ／Ｌ作为抑菌抗生素，卡那霉素的质量浓度梯度设置为０㊁１０㊁２０㊁３０㊁４０和５０ｍｇ／Ｌ㊂每个处理接种３０个叶盘，２０ｄ后观察叶盘生长状况㊂阳性植株的鉴定：分别摘取抗性植株和对照植株的叶片放入配置好的ＧＵＳ染液进行快速检测，观察叶片变色情况㊂提取抗性植株叶片ＤＮＡ，根据质粒载体ｐＢＩ１２１序列设计引物进行ＰＣＲ验证，观察是否存在对应条带㊂引物使用Ｐｒｉｍｉｅｒ６软件设计，交由南京金斯瑞公司合成㊂上游引物序列为ＴＴＴＣＣＴＴＧＡＴＣＴ⁃ＧＣＴＧＣＴＴＣＧ，下游引物序列为ＡＴＴＴＣＣＧＣＧ⁃ＣＡＧＡＣＧＡＴＧＡＣＧ，目的片段大小为２０５８ｂｐ㊂１．２．５㊀二倍体毛白杨瞬时表达体系构建选用生长４ ６周的二倍体毛白杨，取１０片叶子切成叶条，避光酶解３ ５ｈ，镜检确认原生质体成功分离后，去除杂质，过滤重悬，获得毛白杨原生质体溶液㊂随后将含有ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏ⁃ｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）基因的ｐ２ＧＷＦ７质粒与制备的毛白杨原生质体溶液混匀，室温孵育１５ｈ，检测荧光蛋白（ＥＧＦＰ）的瞬时表达情况㊂１．３㊀数据处理使用ＩＢＭＳＰＳＳＳｔａｔｉｓｔｉｃｓ（Ｖｅｒｓｉｏｎ２０）中的单因素ＡＮＯＶＡ模型㊁一般线性模型等工具对组培苗测定数据进行方差分析和差异显著性分析㊂图１㊀流式细胞仪检测结果Ｆｉｇ．１㊀Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓ２㊀结果与分析２．１㊀雄性毛白杨外植体材料的倍性测定结果通过流式细胞技术（ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）对毛白杨样品单细胞的ＤＮＡ大小进行检测结果见图１㊂二倍体供试番茄与二倍体毛白杨基因组大小分别为９８１. All Rights Reserved.南京林业大学学报（自然科学版）第４６卷９００Ｍｂ与４８０Ｍｂ［１８－１９］，比值为１．８７５㊂标准品番茄与待测毛白杨样品比值约为１．８１８，与基因组大小比值相近，表明供试雄性毛白杨样品为二倍体㊂２．２㊀二倍体毛白杨再生体系构建与优化基于前期研究，本试验选用７０％（体积分数）乙醇与１０％（质量分数）次氯酸钠作为消毒剂进行外植体消毒㊂筛选结果显示，不同消毒处理的植株死亡率差异很大，随着消毒时间的延长，毛白杨外植体死亡率上升明显㊂综合９个消毒方案的统计结果，处理４（７０％乙醇３０ｓ，次氯酸钠５ｍｉｎ）的外植体污染数最少，褐化率与死亡率相对较低，为最优方案（表１）㊂基本培养基筛选结果显示，１／２ＭＳ培养基中外植体的生长速度最快，ＷＰＭ培养基与ＭＳ培养基生长状况相似，１／４ＭＳ培养基生长速度最慢（表２）㊂因此选择１／２ＭＳ作为基本培养基，进行再生体系的构建㊂将生长相近的外植体顶芽转入不同激素组合的基本培养基，统计其生根率作为生根培养基筛选的依据㊂在所有的９个组合中，处理２（ＮＡＡ０．３ｍｇ／Ｌ，ＩＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ）的毛白杨生根情况最好，平均生根率达到了９６．７％（表３），且植株根系粗壮，并伴生大量侧根，为最优激素组合（图２）㊂值得注意的是，随着激素浓度的升高，植株生根率逐渐下降㊂在处理８与处理９中，ＮＡＡ质量浓度达到０．７ｍｇ／Ｌ时，毛白杨的生根率大幅下降，出现植株死亡的现象㊂二倍体雄性毛白杨植株再生过程见图３㊂表１㊀外植体消毒筛选试验结果Ｔａｂｌｅ１㊀Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆｅｘｐｌａｎｔｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ处理ｔｒｅａｔｍｅｎｔ消毒时间ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｔｉｍｅ７０％乙醇／ｓ７０％ｅｔｈａｎｏｌ次氯酸钠／ｍｉｎｓｏｄｉｕｍｈｙｐｏｃｈｌｏｒｉｔｅ种植数ｐｌａｎｔｉｎｇｎｕｍｂｅｒ污染数ｐｏｌｌｕｔｉｏｎｎｕｍｂｅｒ污染率ｐｏｌｌｕｔｉｏｎｒａｔｅ褐化率ｂｒｏｗｎｉｎｇｒａｔｅ死亡率ｄｅａｔｈｒａｔｅ显著性分析ｓｉｇ．１２０５５０４６０．９２０．５５０．３４ａ２２０１０５０４３０．８６０．６２０．２５ｂ３２０１５５０３９０．７８０．７２０．３６ａｃ４３０５５０２２０．４４０．５４０．３７ａｃ５３０１０５０２８０．５６０．５５０．４４ｄ６３０１５５０２８０．５６０．４８０．８６ｅ７４０５５０３７０．７４０．５００．７０ｆ８４０１０５０３３０．６６０．５２０．６２ｇ９４０１５５０３００．６００．５３０．７７ｈ㊀㊀注：基于死亡率进行显著性差异分析㊂不同小写字母表示在０．０５水平差异显著㊂下同㊂Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｂａｓｅｄｏｎｍｏｒｔａｌｉｔｙ．Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｌｅｔｔｅｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ０．０５ｌｅｖｅｌｓ．Ｔｈｅｓａｍｅｂｅｌｏｗ．Ａ－Ｂ．消毒ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；Ａ．正常外植体ｎｏｒｍａｌｅｘｐｌａｎｔｓ；Ｂ．消毒后死亡的外植体ｅｘｐｌａｎｔｓｄｅａｄａｆｔｅｒｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ；Ｃ－Ｄ．叶盘分化情况ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ⁃ｔｉｏｎｏｆｌｅａｆｄｉｓｃｓ；Ｃ．正常分化的叶盘ｎｏｒｍａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｌｅａｆｄｉｓｃｓ；Ｄ．褐化死亡的叶盘ｂｒｏｗｎｉｎｇｌｅａｆｄｉｓｃｓ；Ｅ－Ｇ．不同激素下的生根情况ｒｏｏ⁃ｔｉｎｇｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈｏｒｍｏｎｅｓ；Ｅ．仅添加ＩＢＡ；Ｆ．仅添加ＮＡＡｏｎｌｙＮＡＡａｄｄｅｄ；Ｇ．同时添加了ＩＢＡ与ＮＡＡＩＢＡａｎｄＮＡＡｂｏｔｈａｄｄｅｄ㊂图２㊀雄性二倍体毛白杨外植体消毒㊁叶盘分化以及不同激素处理下的生根情况Ｆｉｇ．２㊀Ｅｘｐｌａｎｔｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｌｅａｆｄｉｓｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎａｎｄｒｏｏｔｉｎｇｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｈｏｒｍｏｎｅｓｏｆｄｉｐｌｏｉｄｍａｌｅＰ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ０９１. All Rights Reserved.㊀第１期俞子承，等：雄性二倍体毛白杨再生体系的构建和遗传转化的研究表２㊀基本培养基筛选试验结果Ｔａｂｌｅ２㊀Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆｂａｓｉｃｍｅｄｉｕｍ培养基ｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ顶芽生长情况ｔｈｅｇｒｏｗｔｈｒａｔｅｏｆｂｕｄ１０ｄ２０ｄ１／４ＭＳ生长速度与ＷＰＭ相似生长速度最慢１／２ＭＳ生长速度最快生长速度最快ＭＳ生长速度最慢生长速度与ＷＰＭ相似ＷＰＭ生长速度与１／４ＭＳ相似生长速度与ＭＳ相似表３㊀生根培养基筛选试验结果Ｔａｂｌｅ３㊀Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆｒｏｏｔｉｎｇｃｕｌｔｕｒｅ处理ｔｒｅａｔｍｅｎｔ外源激素／（ｍｇ㊃Ｌ－１）ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｈｏｒｍｏｎｅＮＡＡＩＢＡ平均生根率／％ａｖｅｒａｇｅｒｏｏｔｉｎｇｒａｔｅ显著性分析ｓｉｇ．１０．３０．３５３．３ｂｃ２０．３０．５９６．７ａ３０．３０．７７０．０ｂ４０．５０．３５６．７ｂ５０．５０．５６６．７ｂ６０．５０．７６３．３ｂ７０．７０．３３６．７ｃ８０．７０．５１６．７ｄ９０．７０．７３．３ｄ㊀㊀将均匀处理后的叶盘放置于不同激素处理的培养基中，统计产生的不定芽，计算增殖系数，作为评价各个继代培养方案的标准㊂结果显示，增殖系数平均值最高的是处理５（６⁃ＢＡ的０．５ｍｇ／Ｌ，ＮＡＡ的０．５ｍｇ／Ｌ，ＴＤＺ的０ ００５ｍｇ／Ｌ），其平均增殖系数达到６．６３；其次是处理４的４．４７，处理８的４ １０以及处理９的４．０３（表４）㊂增殖继代过程中，不适宜的激素组合会促使叶盘出现褐化死亡的现象㊂对９个处理增殖系数的多重对比分析指出，处理５与其他处理间存在显著性差异，因此毛白杨最佳增殖继代培养基为：１／２ＭＳ＋０．５ｍｇ／Ｌ６⁃ＢＡ＋０．５ｍｇ／ＬＮＡＡ＋０．００５ｍｇ／ＬＴＤＺ㊂芽伸长培养是建立再生体系的必要步骤㊂叶盘增殖出的不定芽需要转入对应的芽伸长培养基中，待新生芽逐步伸长且茎基粗壮后，再转入生根培养基，以保证植株的生根率和成活率㊂研究表明，ＴＤＺ能够促进不定芽基部产生大量愈伤组织，但是高浓度的ＴＤＺ又会阻碍不定芽的生长，出现玻璃化现象［２０－２１］㊂所以本研究在对芽伸长培养基进行筛选时，仅保留６⁃ＢＡ与ＮＡＡ两种激素，同时尽可能降低筛选所用的浓度㊂以培养３０ｄ后不定芽平均生长长度为标准，其中处理８（６⁃ＢＡ０．５ｍｇ／Ｌ，ＮＡＡ０．３ｍｇ／Ｌ）达到了２６．３ｍｍ，为最优组合（表５）㊂此外，６⁃ＢＡ与ＮＡＡ均对芽的生长有促进作用㊂芽伸长培养基对ＮＡＡ的依赖性相对较低，不定芽伸长的速度受ＮＡＡ影响不大㊂图３㊀二倍体雄性毛白杨植株再生过程Ｆｉｇ．３㊀ＴｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｄｉｐｌｏｉｄｍａｌｅＰ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ表４㊀激素配比对增殖继代培养的影响Ｔａｂｌｅ４㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｈｏｒｍｏｎｅｒａｔｉｏｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ处理ｔｒｅａｔｍｅｎｔ外源激素／（ｍｇ㊃Ｌ－１）ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｈｏｒｍｏｎｅ６⁃ＢＡＮＡＡＴＤＺ平均增殖系数ａｖｅｒａｇｅｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ显著性分析ｓｉｇ．１０．３０．３０．００５１．６０ｃ２０．３０．５０．０１０２．１０ｃ３０．３０．７０．０１５２．７０ｃ４０．５０．３０．０１５４．４７ａｂｃ５０．５０．５０．００５６．６３ａ６０．５０．７０．０１０３．００ａｂ７０．７０．３０．０１０３．４３ｂｃ８０．７０．５０．０１５４．１０ａｂｃ９０．７０．７０．００５４．０３ａｂｃ１９１. All Rights Reserved.南京林业大学学报（自然科学版）第４６卷表５㊀芽伸长培养筛选试验结果Ｔａｂｌｅ５㊀Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｒｅｓｕｌｔｓｏｆｂｕｄｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ处理ｔｒｅａｔｍｅｎｔ外源激素／（ｍｇ㊃Ｌ－１）ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｈｏｒｍｏｎｅ６⁃ＢＡＮＡＡ３０ｄ芽平均生长长度／ｍｍａｖｅｒａｇｅｇｒｏｗｔｈｌｅｎｇｔｈｏｆｂｕｄｉｎ３０ｄ１０．１０．１１６．０２０．１０．３１８．０３０．１０．５１９．０４０．３０．１１５．０５０．３０．３２０．０６０．３０．５２４．０７０．５０．１２３．０８０．５０．３２６．３９０．５０．５２３．３２．３㊀二倍体毛白杨转化体系的构建与优化本研究采用叶盘转化法，选择含有ＧＵＳ报告基因的植物表达载体ｐＢＩ１２１和根癌农杆菌菌株ＥＨＡ１０５进行试验㊂借助试验过程，对二倍体毛白杨转化体系进行探索与优化㊂预培养在植物遗传转化过程中起调节植物细胞状态的作用，能够加快叶片伤口处细胞增殖分化，促使叶片在侵染过程中与外源ＤＮＡ接触，进而提高转化效率㊂在预设的４组对照试验中，毛白杨叶片在预培养１２ｈ的情况下，获得的含抗性芽叶盘比例最高，达到９％㊂当预培养时间达到２４ｈ时，其分化能力大幅度下降㊂而预培养时间达４８ｈ时，毛白杨叶盘失去形成不定芽的能力，抗性芽获得率为０㊂与对照组相比，１２ｈ的预培养能小幅提高毛白杨的转化效率，但不宜超过１２ｈ（表６）㊂表６㊀预培养和共培养时间对毛白杨产生抗性芽的影响Ｔａｂｌｅ６㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｐｒｅ⁃ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｃｏ⁃ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓｏｆＰ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ处理ｔｒｅａｔｍｅｎｔ时间／ｈｔｉｍｅ接种数／个ｐｌａｎｔｓｎｕｍｂｅｒ产生抗性芽叶盘数／个ｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓｎｕｍｂｅｒ抗性芽获得率／％ｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓｒａｔｅ显著性分析ｓｉｇ．预培养ｐｒｅ⁃ｃｕｌｔｕｒｅ０１００７７ａ１２１００８９ｂ２４１００２２ｃ４８１００００ｄ共培养ｃｏ⁃ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ８５０００ａ１６５０２４ａ２４５０３６ｂ３２５０１２ａ４０５０００ａ４８５０１２ａ５６５０００ａ㊀㊀在转化过程中，侵染菌液浓度和侵染时间是影响转化成功率的关键因素㊂侵染能力过强，容易导致菌液对叶盘造成不可逆伤害，导致受侵染植株大量死亡；而侵染不足，又会影响植物转化效率，无法获得抗性植株㊂合适的侵染液浓度和侵染时间在既可以保证高转化率㊁又能减少农杆菌对植物体的损害方面显得尤为重要㊂试验结果显示，毛白杨对菌液浓度以及侵染时间的变化非常敏感㊂当菌液浓度［以６００ｎｍ波长吸光值（ＯＤ６００）表示，下同］高于０．６时，叶片受侵害严重，无法正常生长；在菌液浓度低于０．２时，农杆菌与叶片伤口接触减少，转化效率低，难以产生抗性芽㊂同样，侵染时间对抗性芽的获得率也有着一定影响㊂当菌液浓度小于０．４时，抗性芽叶盘的获得率与侵染时间呈现正相关㊂当菌液浓度达到０．４时，随着侵染时间的增长，抗性芽的获得率先上升后下降㊂综上所述，菌液浓度０．４，侵染２０ｍｉｎ，为二倍体雄性毛白杨转化效率最高的组合（表７）㊂表７㊀侵染菌液浓度㊁侵染时间对毛白杨抗性芽的影响Ｔａｂｌｅ７㊀Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｉｍｅｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓｏｆＰ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ菌液浓度ＯＤ６００侵染时间／ｍｉｎｉｎｆｅｃｔｉｏｎｔｉｍｅ叶盘数ｐｌａｎｔｓｎｕｍｂｅｒ产生抗性芽的叶盘数ｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓｎｕｍｂｅｒ抗性芽获得率／％ｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓｒａｔｅ显著性分析ｓｉｇ．０．２１０４５００ａ２０４８１２ａｂ３０４０２５ｂ０．４１０４８４８ｃ２０４７５１１ｃ３０４８２４ｂ０．６１０４８００ａ２０４８００ａ３０４８００ａ０．８１０４４００ａ２０４２００ａ３０４８００ａ㊀㊀㊀㊀避光条件下的共培养，可以促进植物细胞脱分化产生愈伤组织，同时诱导农杆菌携带的外源ＤＮＡ整合到植物染色体上㊂试验结果显示，共培养时间为８ｈ时，农杆菌中的外源ＤＮＡ未完成转移与整合，无法获得抗性芽㊂共培养时间为１６ ２４ｈ时，叶盘产生抗性芽，在时间为２４ｈ时，抗性芽比例达到最高㊂其后，随着共培养时间的继续增加，叶盘生长受到农杆菌抑制，抗性芽比例下降㊂当共培养时间超过４０ｈ，大量叶盘染菌死亡㊂综上，筛选出的最佳共培养时间为２４ｈ（表６）㊂２９１. All Rights Reserved.㊀第１期俞子承，等：雄性二倍体毛白杨再生体系的构建和遗传转化的研究本研究通过遗传转化试验，共获得８６株抗性植株（图４），并通过ＧＵＳ染色和ＰＣＲ的方法进行分子鉴定，获得１４株阳性结果（图５）㊂Ａ．成功转化的叶盘ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｌｅａｆｄｉｓｃｓ；Ｂ．死亡的叶盘ｄｅａｄｌｅａｆｄｉｓｃｓ；Ｃ．获得的抗性苗ｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓ；Ｄ．阳性植株ｐｏｓｉｔｉｖｅｐｌａｎｔ㊂图４㊀转化后的叶盘㊁抗性芽和阳性植株Ｆｉｇ．４㊀Ｌｅａｆｄｉｓｃｓ，ｒｅｓｉｓｔａｎｔｂｕｄｓａｎｄｐｏｓｉｔｉｖｅｐｌａｎｔｓａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ卡那霉素（ｋａｎａｍｙｃｉｎ，Ｋａｎ）通过干扰植物细胞叶绿体及线粒体蛋白质的合成，抑制植物细胞组织的生长发育，最终使植物细胞黄化死亡［２２］㊂梯Ａ．对照植株毛白杨叶片ＧＵＳ染色ｇｕｓｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｃｏｎｔｒｏｌｐｌａｎｔｏｆＰ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａｌｅａｖｅｓ；Ｂ．阳性植株毛白杨叶片ＧＵＳ染色ｇｕｓｓｔａｉｎｉｎｇｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｐｌａｎｔｌｅａｖｅｓｏｆＰ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ；Ｃ．ＰＣＲ检测结果ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓ；Ｍ．２０００ｂｐｍａｒｋｅｒ；ＣＫ＋．阳性对照ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；ＣＫ－．阴性对照ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；泳道１ １５．样本１ １５ｓａｍｐｌｅ１－１５㊂图５㊀ＧＵＳ染色结果及ＤＮＡＰＣＲ检测结果Ｆｉｇ．５㊀ＲｅｓｕｌｔｓｏｆｌｅａｖｅｓＧＵＳｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄＤＮＡＰＣＲ度试验结果表明，随着卡那霉素浓度的上升，毛白杨叶盘的分化能力逐渐降低，生长速度逐渐下降㊂在卡那霉素质量浓度达到３０ｍｇ／Ｌ时，叶盘无法产生不定芽；在抗生素质量浓度大于４０ｍｇ／Ｌ，叶盘无法生长，且短时间内完全死亡（图６）㊂图６㊀不同浓度卡那霉素条件下叶盘的生长情况Ｆｉｇ．６㊀Ｇｒｏｗｔｈｏｆｌｅａｆｄｉｓｃｕｎｄｅｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｋａｎａｍｙｃｉｎ２．４㊀二倍体毛白杨瞬时表达体系借鉴现有的原生质体分离方法［２３］，选择生长时间在４ ６周的毛白杨，切成叶条后酶解３ ５ｈ，溶解细胞壁，直至酶解液呈现绿色，原生质体完全释放㊂镜检图片显示，制备的原生质体呈现游离状态，数量平均达到了１ˑ１０６个／ｍＬ，且获得的原生质体大小一致，状态良好，可以进行后续瞬时表达试验㊂３９１. All Rights Reserved.南京林业大学学报（自然科学版）第４６卷本研究将分离出的毛白杨原生质体与ｐ２ＧＷＦ７质粒混匀，在室温下孵育１５ｈ后检测报告基因的瞬时表达情况㊂在ＺｅｉｓｓＬＳＭ７１０激光共聚焦显微镜下，视野中出现同时包含ＥＧＦＰ绿色荧光信号以及红色叶绿体自发荧光的毛白杨原生质体㊂表明携带ＥＧＦＰ报告基因的质粒成功转入毛白杨的原生质体，并在原生质体中稳定表达（图７）Ａ．分离出的毛白杨原生质体ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＰ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ；Ｂ．ＥＧＦＰ荧光ＥＧＦＰｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；Ｃ．叶绿体自发荧光ｃｈｌｏｒｏ⁃ｐｌａｓｔａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ；Ｄ．ＥＧＦＰ荧光与自发荧光叠加ｓｕｐｅｒｐｏｓｉｔｉｏｎｏｆＥＧＦＰｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎｄｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｅｒｇｅ；Ｅ．明场ｂｒｉｇｈｔｆｉｅｌｄ㊂图７㊀毛白杨原生质体细胞瞬时表达Ｆｉｇ．７㊀ＴｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｃｅｌｌｓｏｆＰ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ３㊀讨㊀论参考大多数木本植物的消毒策略，本试验选用对植株伤害较小的酒精和次氯酸钠作为毛白杨外植体消毒剂，用以替代传统消毒剂氯化汞㊂外植体的消毒效果主要受到消毒剂和消毒时间的影响［２４］㊂本研究不同消毒条件试验组的外植体染菌率差距明显，最低为４４％，最高达９２％㊂研究发现，酒精消毒时间不宜超过３０ｍｉｎ，否则外植体死亡率明显上升；次氯酸钠最佳消毒时间为１０ｍｉｎ，此时植株染菌率和致死率均相对较低㊂毛白杨嫩芽对消毒剂的敏感性较强，消毒剂极易造成外植体受损，导致死亡㊂此外，消毒过程中外植体植株出现较为严重的褐化，而褐化主要是由伤口破损处渗出的酚类物质与培养基中蛋白质聚合产生［２５］㊂后续试验中，在培养基中添加适量硝酸银和活性炭，褐化情况得到明显缓解㊂值得注意的是，外植体材料自身携带的内生真菌难以通过表面消毒的方式去除，导致部分批次外植体植株出现染菌情况㊂本试验通过使用含有抗生素的无菌水浸泡冲洗和控制外植体采集时间的方法，有效降低了内生真菌的影响［２６］㊂基于前期的筛选工作，本试验选择ＩＢＡ㊁ＮＡＡ㊁６⁃ＢＡ㊁ＴＤＺ４种外源激素进行二倍体毛白杨再生体系的构建㊂在生根阶段，外源激素的浓度对毛白杨植株生根率影响很大，最适激素条件下，生根率高达９６．７％；随着激素浓度的上升，植株生根率骤降㊂值得关注的是，ＩＢＡ和ＮＡＡ两种激素对于二倍体毛白杨的生根均非常重要，仅保留１种激素进行的对照试验中，植株生根缓慢甚至无法生根㊂在不定芽增殖阶段，适宜的激素配比使毛白杨增殖系数达到６．６３，与李慧等［２７］获得的增殖系数相近（６．２８），略低于鲁好君［１６］的研究结果（７．９８）㊂在芽伸长阶段，植株对６⁃ＢＡ激素的浓度变化较为敏感，对ＮＡＡ依赖性相对不高㊂借助构建优化的再生体系，毛白杨外植体顶芽仅需要７０ｄ即可快速生长成为完整健壮的植株，大大缩短了无性系培育扩繁的时间㊂在后续遗传转化阶段，本研究构建优化的再生体系同样表现出较高的增殖效率㊂与其他毛白杨材料的研究结果不同，本研究发现预培养并不能显著提高雄性二倍体毛白杨的转化效率，预培养超过１２ｈ，叶盘的分化能力明显降低，与李春利［１５］的筛选结果相似㊂在转化阶段，侵染菌液浓度和侵染的时间是影响转化效率的关键因素［８］㊂现有研究中，毛白杨转化体系的侵染条件和获得的转化效率差异较大㊂在本研究中，菌液浓度（ＯＤ６００条件）下为０．４，侵染２０ｍｉｎ时雄性二倍体毛白杨转化效率最高，含有抗性芽叶盘的获取比例为１１％㊂通过在侵染过程中控制农杆菌和叶盘的接触，能够有效减少农杆菌爆发，同时降低频４９１. All Rights Reserved.㊀第１期俞子承，等：雄性二倍体毛白杨再生体系的构建和遗传转化的研究繁洗菌对叶盘的伤害㊂毛白杨抗性筛选阶段通常使用３０ ５０ｍｇ／Ｌ的工作浓度进行一次或者梯度抗性筛选［６－７，１５，２８－２９］㊂基于抗生素梯度筛选试验的结果，本研究选择３０ｍｇ／Ｌ的抗生素进行一次抗性筛选，未成功转化的叶盘迅速白化死亡㊂分子鉴定结果表明，获得的８６株抗性植株中有１４株分子检测为阳性，占比１６．３％㊂假阳性比例偏高的现象在植物转基因试验中普遍存在㊂由于嵌合体芽的存在，一些植株没有受到抗生素的影响，得以正常生长，是形成假阳性植株的因素之一㊂此外，较短的共培养时间和偏低的抗生素筛选浓度也会造成假阳性植株比例的偏高［１６］㊂雄性二倍体毛白杨遗传转化较为困难，本试验中酌情下调了抗生素的工作浓度，以期减少植株承受的筛选压力㊂获得的所有抗性植株都会通过分子检测的方法进行筛选验证，排除假阳性的干扰，保证结果的可靠性㊂后续可通过提高抗生素工作浓度或选用其他高效抗生素进行筛选，以达到更高的区分效率㊂现阶段毛白杨研究大多选择拟南芥㊁烟草等异源原生质体作为材料进行瞬时表达，鲜有转化至叶肉细胞原生质体的报道㊂本研究基于现有的杨属植物原生质体分离方法，制备了雄性二倍体毛白杨原生质体，数量平均达到了１ˑ１０６个／ｍＬ，略低于Ｔａｎ等［３０］以毛果杨为材料制备的叶肉细胞原生质体数量㊂研究验证了在雄性二倍体毛白杨原生质体同源转化的可行性，并成功表达了报告蛋白，为后续基因功能的鉴定与研究提供了重要实验平台㊂与现有的三倍体毛白杨体系相比，本研究在保证再生效率的前提下，有效缩短了无性系培育的时间，并在此基础上成功进行了遗传转化和原生质体瞬时表达㊂相较于三倍体植株，二倍体植物材料只有两套染色单体，在测序数据组装和基因编辑靶点选择等方面更具优势，有着广阔的应用前景和科研价值㊂杨树是木本植物基础研究和遗传改良的模式植物，雄性二倍体毛白杨再生体系和遗传转化平台的构建，补充了毛白杨基础理论研究资料，为分子辅助品种选育奠定了基础，也为其他木本植物遗传转化研究提供了参考㊂参考文献（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）：［１］ＺＨＵＺＴ，ＺＨＡＮＧＺＹ．Ｔｈｅｓｔａｔｕｓａｎｄａｄｖａｎｃｅｓｏｆｇｅｎｅｔｉｃｉｍ⁃ｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆＰｏｐｕｌｕｓｔｏｍｅｎｔｏｓａＣａｒｒ．［Ｊ］．ＪＢｅｉｊｉｎｇＦｏｒＵｎｉｖ（ＥｎｇｌＥｄ），１９９７，６（１）：１－７．［２］ＺＨＵＺＴ．Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄｂｒｅｅｄｉｎｇｓｔｕｄｉｅｓｏｆｇｅｎｅｒｅｓｏｕｒｃｅｓｏｆＰｏｐｕｌｕｓｔｏｍｅｎｔｏｓａｉｎＣｈｉｎａ［Ｃ］／／ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＰｏｐｌａｒＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎ．Ｂｅｉｊｉｎｇ：ＡｄＨｏｃＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆＰｏｐｌａｒａｎｄＷｉｌｌｏｗＢｒｅｅｄｉｎｇ，１９８８：５－８．［３］李少锋，苏晓华，张冰玉．林木基因克隆研究进展［Ｊ］．植物学报，２０１１，４６（１）：７９－１０７．ＬＩＳＦ，ＳＵＸＨ，ＺＨＡＮＧＢＹ．Ｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎｇｅｎｅｃｌｏｎｉｎｇｉｎｆｏｒｅｓｔｔｒｅｅｓ［Ｊ］．ＢｕｌｌＢｏｔ，２０１１，４６（１）：７９－１０７．ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１２５９．２０１１．０００７９．［４］ＭＯＶＡＨＥＤＩＡ，ＺＨＡＮＧＪ，ＡＭＩＲＩＡＮＲ，ｅｔａｌ．ＡｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｆｏｒｐｏｐｌａｒ［Ｊ］．ＩｎｔＪＭｏｌＳｃｉ，２０１４，１５（６）：１０７８０－１０７９３．ＤＯＩ：１０．３３９０／ｉｊｍｓ１５０６１０７８０．［５］龙萃，庞晓明，曹冠琳，等．ＭｄＳＰＤＳ１基因导入毛白杨的遗传转化体系优化研究［Ｊ］．北京林业大学学报，２０１０，３２（５）：２１－２６．ＬＯＮＧＣ，ＰＡＮＧＸＭ，ＣＡＯＧＬ，ｅｔａｌ．ＡｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｔｐｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇＭｄＳＰＤＳ１ｇｅｎｅｉｎｔｏＰｏｐｕｌｕｓｔｏｍｅｎｔｏｓａＣａｒｒ［Ｊ］．ＪＢｅｉｊｉｎｇＦｏｒＵｎｉｖ，２０１０，３２（５）：２１－２６．ＤＯＩ：１０．１３３３２／ｊ．１０００－１５２２．２０１０．０５．０１３．［６］ＤＵＮＸ，ＬＩＵＸ，ＬＩＹ，ｅｔａｌ．ＧｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＰｏｐｕｌｕｓｔｏ⁃ｍｅｎｔｏｓａｔｏｉｍｐｒｏｖｅｓａｌｔｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＴｉｓｓｕｅＯｒｇａｎＣｕｌｔ（ＰＣＴＯＣ），２０１２，１０８（２）：１８１－１８９．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１１２４０－０１１－００２６－４．［７］ＪＩＡＺ，ＧＯＵＪ，ＳＵＮＹ，ｅｔａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｆｕｎｇａｌｐａｔｈｏ⁃ｇｅｎｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＰｏｐｕｌｕｓｔｏｍｅｎｔｏｓａＣａｒｒ．ｂｙｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｎｎｓＬＴＰ⁃ｌｉｋｅａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅｆｒｏｍｍｏｔｈｅｒｗｏｒｔ（Ｌｅｏｎｕｒｕｓｊａｐｏｎｉｃｕｓ）［Ｊ］．ＴｒｅｅＰｈｙｓｉｏｌ，２０１０，３０（１２）：１５９９－１６０５．ＤＯＩ：１０．１０９３／ｔｒｅｅｐｈｙｓ／ｔｐｑ０９３．［８］ＺＥＬＡＳＣＯＳ，ＲＥＳＳＥＧＯＴＴＩＶ，ＣＯＮＦＡＬＯＮＩＥＲＩＭ，ｅｔａｌ．Ｅｖａｌｕａ⁃ｔｉｏｎｏｆＭＡＴ⁃ｖｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍｉｎｗｈｉｔｅｐｏｐｌａｒ（ＰｏｐｕｌｕｓａｌｂａＬ．）ａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｉｐｔｍａｒｋｅｒ⁃ｆｒｅｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｂｙ ｓｉｎｇｌｅ⁃ｓｔｅｐｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＴｉｓｓｕｅＯｒｇａｎＣｕｌｔ，２００７，９１（１）：６１－７２．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１１２４０－００７－９２７８－４．［９］杜晓艳．三种杨树再生体系的建立及青海青杨遗传转化的研究［Ｄ］．重庆：西南大学，２０１０．ＤＵＸＹ．Ｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｒｅ⁃ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｓｏｆｔｈｒｅｅＰｏｐｕｌｕｓａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈｏｆｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓ⁃ｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆＰｏｐｕｌｕｓｃａｔｈａｙａｎａＲｅｈｄ．ｖａｒ．Ｑｉｎｇｈａｉ［Ｄ］．Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ：ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０．［１０］ＣＳＥＫＥＬＪ，ＣＳＥＫＥＳＢ，ＰＯＤＩＬＡＧＫ．Ｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｐｏｐｌａｒｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ，２００７，２６（９）：１５２９－１５３８．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ００２９９－００７－０３６５－０．［１１］ＹＥＶＴＵＳＨＥＮＫＯＤＰ，ＭＩＳＲＡＳ．ＥｆｆｉｃｉｅｎｔＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｈｙｂｒｉｄｐｏｐｌａｒＰｏｐｕｌｕｓｎｉｇｒａＬ．ˑＰ．ｍａｘｉｍｏｗｉｃｚｉｉＡ．Ｈｅｎｒｙ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ，２０１０，２９（３）：２１１－２２１．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ００２９９－００９－０８０６－ｚ．［１２］ＤＥＮＧＷ，ＬＵＯＫＭ，ＬＩＺＧ，ｅｔａｌ．Ａｎｏｖｅｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｖｉａｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＳｃｉ，２００９，１７７（１）：４３－４８．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｐｌａｎｔｓｃｉ．２００９．０３．００９．［１３］ＭＯＨＡＮＪＳ．Ｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅ⁃ｄｅｒｉｖｅｄｖａｒｉａｔｉｏｎｉｎｃｒｏｐｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ，２００１，１１８（２）：１５３－１６６．ＤＯＩ：１０．１０２３／Ａ：１００４１２４５１９４７９．［１４］王富刚，张静．三倍体毛白杨的组织培养试验研究［Ｊ］．现代农业科技，２０１０（１３）：２２２，２２４．ＷＡＮＧＦＧ，ＺＨＡＮＧＪ．ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｙｏｎｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｏｆｔｒｉｐｌｏｉｄＰｏｐｕｌｕｓｔｏｍｅｎｔｏｓａ［Ｊ］．ＭｏｄＡｇｒｉｃＳｃｉＴｅｃｈｎｏｌ，２０１０（１３）：２２２，２２４．ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００７－５７３９．２０１０．１３．１５０．［１５］李春利．毛白杨遗传转化体系的优化和ＡｔＰＡＰ２的转基因研究［Ｄ］．南京：南京农业大学，２０１５．ＬＩＣＬ．ＴｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｔｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍａｎｄｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｅｓｅａｒｃｈｏｆＡｔ⁃ＰＡＰ２ｉｎＰｏｐｕｌｏｕｓｔｏｍｅｎｔｏｓａ［Ｄ］．Ｎａｎｊｉｎｇ：ＮａｎｊｉｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１５．［１６］鲁好君．毛白杨遗传转化体系的建立及ＧＯＣ高光效转基因植５９１. All Rights Reserved.。
遗传转化KN1基因促进毛果杨外植体再生
研究报告A Letter遗传转化KN1 基因促进毛果杨外植体再生车小红1,2李岩1,2,3 赵德刚1,2,3*1 贵州大学贵州省农业生物工程重点实验室, 贵阳, 550025;2 贵州大学生命科学学院基因工程实验室, 贵阳, 550025;3 贵州大学教育部绿色农药与农业生物工程重点实验室, 贵阳, 550025* 通讯作者,****************摘要已有研究表明玉米同源异形盒(home obox)基因K notted1 (KN1)超量表达会导致转基因烟草、拟南芥和番茄等植物中细胞分裂素含量增加，提高转化效率。
由于木本植物遗传转化困难，且毛果杨可作为木本植物研究的模式植物，因此，本研究利用农杆菌介导法，将35S 启动子驱动的玉米K N1 (35S::KN1)基因导入毛果杨，并分析K N1 基因表达对毛果杨再生率的影响。
研究结果表明，经GUS 组织化学染色及PCR 分子鉴定，K N1 基因已经成功导入毛果杨幼苗；K N1 基因对毛果杨外植体愈伤诱导率影响不明显，但单个外植体芽诱导率比对照高0.96 倍，毛果杨的再生频率明显提高；与移栽成活的野生对照植株相比，转化K N1 基因植株出现叶片变小，叶色变深，在叶片边缘产生裂片，分枝增加，无顶端优势等特殊表型。
本研究中K N1 基因引起转化植株表型变化，因此在毛果杨的遗传转化中，可作为一种有效的正向选择标记基因。
关键词K N1 基因, 遗传转化, 毛果杨Promotion on Regeneration of Explants with Genetic Transformation of KN1 Gene in P o pu l u s t r i ch o c ar paChe Xiaohong 1,2Li Yan 1,2,3Zhao Degang 1,2,3*1 Guizhou Key Lab of Ag ro-Bioengineering, Guizhou University, Guiyang, 550025;2 Lab of Gene Engineering, C ollege of Life Sciences of Guizhou University, Guiyang, 550025;3 Key L aboratory o f Green Pesticide and Agricultu ral Biological Engineering, Ministry of Education, Guiyang, 550025* C orresponding au thor,****************DOI: 10.3969/gab.029.000653Ab s t ra ct The finished studies have shown that overexpression of homeobox gene Knotted1(K N1) of maize could increase cytokinins content in transgenic tobacco, Arabidopsis, tomato and other plants and also improved the transformation efficiency. Because there were a lot of difficulties on genetic transformation of xylophyta plant and P op u l u s t r i c h oc arpa was as a model xylophyta plant, we transformed 35S::K N1into P op u l u s t r i ch oc arpa via A原gr ob ac te r i u m-mediated method and analyzed the influence of KN1 gene expression on the explant of Po p u l u s t r i原chocarpa regeneration rate. The results of GUS histochemical stainning and PCR molecular analysis showed that K N1 gene was already transformed into P op u l u s t r i c h oc ar p a, and KN1 gene expression didn't show a significant ef- fect on the induction rate of explant callus, however, the induction rate of buds was 0.96 times higher than the con- trol. Therefore, the expression of KN1 gene obviously improved the regeneration rate. Compared to the wild con- trol plants, KN1 transformed plants showed special characteristics such as smaller leaves, denser leaf color, both-ridium at the edge of leaves, increased branches and no apical dominance, and so on. The results suggested that K N1 gene could be used as an effective positive selectable marker gene in P op u l u s t r i ch oc arpa genetic transforma- tion due to the phenotypic variation caused by KN1 expression.Keywords KN1 gene, Genetic transformation, Po p u l u s t r i c h oc ar p a/doi/10.3969/gab.029.000653基金项目：本研究由贵州小油桐生物柴油产业化关键技术研究与应用((2007) 6004)、贵州省优秀科技教育人才成长专项资金项目((2005)351)和国家转基因新品种培育重大专项-安全转基因技术研究(2008ZX08010-003)共同资助基因组学与应用生物学Genomics and Applied Biology DOI: 10.3969/gab.029.000653654利用植物基因工程技术打破种属间的界限，可 以在短期内达到改良植物品种的目的。
东海县南林895杨的选育
东海县南林895杨的选育摘要阐述了南林985杨的育种目标、特征特性选择、无性系选择和区域化试验,以期为南林985杨在东海县的推广种植提供参考。
关键词南林985杨;选育;江苏东海1育种目标杨树新无性系南林895杨由美洲黑杨与欧美杨杂交后代群体中选育,其育种目标是根据单板类人造板材的要求,选育产量高、干形通直圆满、材质好、抗性强的杨树优良无性系,用于黄淮、江淮及长江中下游等平原地区生产造林。
2特征特性选择杂交母本为美洲黑杨I-69杨,原产于美国伊利诺斯州,生长快,抗褐斑病,但生根力弱,干形欠佳,抗寒性差;父本为欧美杨I-45杨,为美洲黑杨和欧洲黑杨杂交种,来源于意大利杨树所,干形通直圆满,生根力强,造林成活率高,抗寒性好,但生长速度不如I-69杨,且易感褐斑病。
根据南林1981年春在泗阳进行杂交,种子采收后播种,共获得幼苗4 100多株。
经过3次选择,第1次于1982年春将感病株、弱小株淘汰,选留健壮株;第2次在1984年底根据二年生苗生长情况及生根力测定结果进行选择;经前2次选择后淘汰60%的植株,余下的单株于1988年春在东海山左口林场进行造林试验,1990年从中选出34个无性系,用于苗期测定和无性系对比试验造林。
3无性系选择3.1苗期测定参加苗期测定的无性系为美洲黑杨I-69杨×欧美杨I-45杨杂种后代中初选出的34个无性系,对照(CK)为其父母本I-69杨和I-45杨,共计36个无性系,在东海林场苗圃等开展苗期测定试验。
观测性状主要包括苗高、基径、扦插成活率、抗病虫害能力、年生长周期等。
苗期34个无性系试验结果表明,苗高、基径和扦插成活率等性状在各无性系间存在显著差异,生长性状苗高和基径有85%的无性系超过对照I-69杨和I-45杨,扦插成活率介于上2个对照之间。
3.2无性系对比试验1990~2001年在东海林场开展34个无性系对比试验,造林对照(CK)为亲本I-69杨和I-45杨,每小区4株,试验林四周保护行采用I-69杨。
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在 生根 阶段 的 筛选浓度为 １ ０ ｍ ｇ ／ Ｌ ， 头孢 霉素浓度为 １ ０ ０ ｍｇ ／ Ｌ 。优 化 了 ‘ 南林 ８ ９ ５杨 ’ 遗 传转化体 系， 为利 用转基 因技 术开展 杨树 的遗传改 良研 究奠定 了基础 。
关 键词 ： ‘ 南林 ８ ９ ５杨 ’ ； 遗传转化 ； 体 系优 化 ； 农 杆 菌介 导
ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｍｅ ｄ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ ｗ ｅ ｒ ｅ ｓ ｅ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｅ ｄ ｂ ｙ ｕ ｓ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈ ｅ ｏ ｒ ｔ ｈ ｏ ｇ ｏ ｎ ａ ｌ ｄ ｅ ｓ ｉ ｇ ｎ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ．Ｔ ｈ ｅ ｓ ｔ ａ ｔ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ ａ ｎ ａ ｌ ｙ —
了筛选比较 。并利用 Ｇ Ｕ Ｓ染色对转化效果进行统计分析 ， 发现 南林 ８ ９ ５杨 ’ 合 适的遗传 转化体 系为 ： 预 培养３ ｄ ， 菌液浓度 ０ Ｄ ６ ０ ０ 值为０ ． ８ ， 侵染 ８ ｍ ｉ ｎ ， 共培 养 ３ ｄ 。通过抗性 筛选确定卡 那霉素在 分化 阶段 的 筛选浓度 为２ ０ ｍｇ ／ Ｌ ，
Ｔｈ ｅ ｏ ｐｔ ｉ ｍｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｎ ａ ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｏ ｒ ｍａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｙｓ ｔ ｅ ｍ ｆ ｏ ｒ Ｐｏ ｐｕ ｌ ｕ ｓ ｄ ｅ ｌ ｔ ｏ ｉ ｄ ｅ ｓ × Ｐ．
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‘ 南林 ８ ９ ５杨 ’ 遗传 转化 体 系的优 化
孙伟博 ， 于娟 ， 潘 惠新 ， 诸葛 强
（ 南京林业 大学林 木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室 ， 南京 ２ １ ０ ０ ３ ７ ） 摘 要 ： 以‘ 南林 ８ ９ ５杨’ 为研究材料 ， 采用正交设计方法 ， 对以农杆 菌介 导法转基 因过 程 中的几个 关键 因素 进行
Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ（ ０ Ｄ ６ ０ ０ ＝ ０ ． Ｃ Ｏ — ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ．Ｔ ｈ ｅ ｍ ｅ ｄ ｉ ｅ ａ ａ ｄ ｄ ｅ ｄ ｗ ｉ ｔ ｈ ２ ０ ｍ ｇ ／ Ｌ ｋ ａ ｎ ａ ｍｙ ｃ ｉ ｎ ｗ ａ ｓ ｂ ｅ ｔ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ