四种外植体遗传转化体系的探究

较大突破。
目的意义
• 本研究旨在对国内常用的几种大豆外植体遗传转
化体系进行系统研究，通过研究在农杆菌介导下，
不同类型外植体在不定芽诱导Baidu Nhomakorabea、植株再生率、 除草剂敏感性及基因转化效率等方面的差异，以 期获得抗除草剂大豆转基因植株并建立一种相对 稳定、高效的的大豆转化体系，为进一步研究改
进提供参考，为大豆的转基因育种提供技术支撑。
实验进度及安排
• 2013-05～2013-08 胚尖遗传转化体系的优化及
T1代检测
• 2013-09～2013-12 整理实验数据，补充实验 • 2014-01～2014-03 开始论文撰写工作 • 2014-04～2014-05 种植种子，进行分子检测 • 2014-06 论文的撰写及答辩
• 农杆菌介导的大豆遗传转化是国内外应用最为成
熟、操作简便的转化方法。至今，研究者们已经
利用大豆子叶节、成熟胚、胚尖、下胚轴、未成
熟子叶、初生叶、花絮等获得了转基因大豆再生 植株，但不同外植体的转化效率各不相同。其中，
尤以子叶节、胚尖两种外植体研究较为深入，子
叶节的遗传转化体系最为成熟，但转化效率没有
评价指标：
▫ 不定芽诱导率、不定芽长
研究内容
不同外植体除草剂筛选浓度的探究 大豆胚尖遗传转化体系的优化 生长点非离体微创转化体系的探究 大豆四种外植体遗传转化体系的探究
胚尖遗传转化体系优化
基因型：黑农37、合丰35 优化条件
超声波辅助转化
时间：0、2、4、6、8、10min
预培养时间
农杆菌介导的不同大豆外植体遗 传转化体系的研究
导 学 师：王 罡教授 生：钟 影
时间：2012年11月15日
• 1 研究背景及目的意义
• 2 研究内容
• 3 技术路线
• 4 目前工作进展
• 5 实验进度及安排
研究背景
• 大豆[Glycine max( L.) Merrill］是世界上最重要 的油料作物和高蛋白粮食作物之一，也是人类植 物性蛋白和油脂的重要来源并在维持地球生物圈 氮循环具有重要的作用。 • 草甘膦（Glyphosate），学名N-(膦酰基甲基)氨 基乙酸，只有极少数的杂草对它具有抗性，成为 世界上生产使用量最大的除草剂品种。草甘膦作 用机理是抑制植物体中5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽 草酸合成酶（EPSPS）的活性，使植物体芳香族 氨基酸合成受阻，致使植物死亡。
四种外植体遗传转化体系的探究
• 载体：带有 EPSPS、Bar基因的PSOY20载体 • 基因型
• 黑农37、合丰35
• 外植体 • 子叶节、胚尖、下胚轴、半种子 • 评价标准 • 不定芽诱导率、植株再生率、除草剂敏感性及
基因遗传转化效率
总体技术路线
挑选大豆 氯气消毒 挑取农杆菌单菌落接种于YEP中，28℃ 摇床过夜培养 1:10扩大培养，至OD600=0.5~0.6左右
▫ 成熟胚培养时间
2、3、4、5d(根据胚轴伸长情况而定)
▫ 重悬液种类
无菌水、1/2MS盐、1/10MS盐、MS盐
▫ 转化位点
植株每个位节做PCR检测，为T1代检测做基础
• 评价标准
▫ 转化率、再生率
研究内容
不同外植体除草剂筛选浓度的探究 大豆胚尖遗传转化体系的优化 生长点非离体微创转化体系的探究 大豆四种外植体遗传转化体系的探究
成苗
生根
微创法（等待T0代种子，T1代检测）
现阶段
实验进度及安排
• 2012-03～2012-05 试验材料准备及农杆菌验证
• 2012-06 ～2012-08 除草剂浓度梯度筛选
• 2012-09 ～2012-11 黑农37四种外植体的转化及 微创法实验 • 2012-12～2013-04 基因型合丰35四种外植体的 转化及T0代播种
研究内容
不同外植体除草剂筛选浓度的探究 大豆胚尖遗传转化体系的优化 生长点非离体微创转化体系的探究 大豆四种外植体遗传转化体系的探究
除草剂筛选浓度探究
基因型：黑农37、合丰35 外植体：子叶节、胚尖、下胚轴 预期浓度梯度：
▫ 胚 尖：0、2.5、5、7.5、10、12.5mg/L ▫ 子叶节：0、3、6、9、12、15、20mg/L ▫ 下胚轴：0、2.5、5、7.5、10、12.5、15mg/L
外植体制备
侵染
收集菌体制备重悬液
共培养
筛选、培养
分子鉴定
子叶节转化过程
胚尖转化过程
下胚轴转化流程
生长点非离体微创转化体系的研究
种子萌发
共培养
光照预培养
植入蛭石
目前工作进展
黑农37（已经完成）
从上到下，从左至右，草甘膦浓度依次为：0、2.5、5、7.5、10、12.5mg/L
胚尖遗传体系优化及转化（进入检测阶段）
梯度：0、1、2、3d
抗氧化剂
DTT、硫代硫酸钠、L-cys、硝酸银
评价指标
不定芽诱导率、基因转化效率、褐化率
研究内容
不同外植体除草剂筛选浓度的探究 大豆胚尖遗传转化体系的优化 生长点非离体微创转化体系的探究 大豆四种外植体遗传转化体系的探究
生长点非离体微创转化体系的探究
• 基因型：黑农37、合丰35 • 探究因素：