无菌检查法方法验证(妥布霉素滴眼液)

妥布霉素滴眼液无菌检查法方法验证

一、验证目的

根据中国药典2010年版（二部）附录XI H 无菌检查法方法验证，对妥布霉素滴眼液无菌检查方法进行验证，确定在设定的条件下能满足该产品的无菌检查需求，保证检验结果的可靠性。

二、供试品

妥布霉素滴眼液规格：0.4ml/支。批号：

三、培养基

硫乙醇酸盐流体培养基批号：中国药品生物制品检定所改良马丁培养基批号：中国药品生物制品检定所营养肉汤培养基批号：中国药品生物制品检定所改良马丁琼脂培养基批号：中国药品生物制品检定所营养琼脂培养基批号：中国药品生物制品检定所玫瑰红钠琼脂培养基批号：中国药品生物制品检定所营养琼脂对照培养基批号：中国药品生物制品检定所玫瑰红钠琼脂对照培养基批号：中国药品生物制品检定所四、试剂：

蛋白胨批号：

氯化钠（AR）批号：

磷酸二氢钾（AR）批号：

磷酸氢二钠（AR）批号：

聚山梨酯80 批号：

五、仪器

HTY-2000A型集菌仪，一次性使用全封闭集菌培养器型号KDGB330

批号20100602 均由杭州泰林生物技术设备有限公司。

立式压力蒸汽灭菌器：YXQ-LS-50SII，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；

霉菌培养箱：MJX-160B-Z型，上海博迅实业有限公司

生化培养箱：MJX-160B-Z型，上海博迅实业有限公司

电热恒温鼓风干燥箱：GZX-9076 MBE，上海博讯实业有限公司医疗设备厂百级超净工作台：SW-CJ-1F，苏州佳宝净化工程设备有限公司

六、冲洗液

pH7.0 无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，自制，根据《中国药典》2010版二部附录XI H 稀释液，冲洗液配置方法：取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微热溶解，滤清，分装，灭菌。灭菌条件：121°C高压蒸汽灭菌20min。

七、缓冲液

0.9%无菌氯化钠溶液，自制，根据《中国药典》2010版二部附录XIH 稀释液，冲洗液配置方法：取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装，灭菌。灭菌条件：121℃高压蒸汽灭菌20min。

八、菌种：

金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】第代

大肠埃希菌【CMCC（B）44102】第代

枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】第代

生孢梭菌【CMCC（B）64941】第代

白色念珠菌【CMCC（B）98001】第代

黑曲霉【CMCC（B）98003】第代

九、实验操作

1，菌液制备

1.1接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物至10ml

营养肉汤培养基中，置30-35°C培养18-24小时，分别取上述培养物1ml

加入9ml0.9%的无菌氯化钠溶液中，10倍递增稀释制成每1ml含菌数约

50-100CFU的菌悬液。

1.2接种生孢梭菌的新鲜培养物至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中，30-35°C

培养18-24小时，取上述培养物1ml加入9ml0.9%的无菌氯化钠溶液中，10倍递增稀释制成每1ml含菌数约50-100CFU的菌悬液。

1.3接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，置23-28°C

培养24-48小时，取上述培养物1ml加入9ml0.9%的无菌氯化钠溶液中，10倍递增稀释制成每1ml含菌数约50-100CFU的菌悬液。

1.4接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，置23-28°C培

养5-7天，使大量孢子的形成。用5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的

0.9%的无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，用接种环将菌苔刮下，振摇后用无

菌吸管吸取菌液加入蒙有纱布的无菌试管中作为原液。取1ml原液加入

含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的9ml0.9%的无菌氯化钠溶液中，制成每

1ml含孢子数约50-100CFU的孢子悬液。

2，菌落计数

分别取上述制备的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液各1ml加入无菌平板，平行2份，与营养琼脂培养基混匀后倒置于33-35℃培养48-72小时计数，取生孢梭菌菌液1ml加入硫乙醇酸盐流体培养基中，密闭后置于培养箱33-35℃培养24-48小时计数，取白色念珠菌、黑曲霉菌液各1ml加入无菌平板，平行2份，与玫瑰红钠琼脂培养基混匀后倒置于23-25℃培养72小时计数，结果如表1

表1

结论：

3，计数培养基的适用性检查

用相应的对照培养基代替上述营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基进行上述计数实验（除生孢梭菌），其结果如表2

结论：

4，培养基的无菌性检查

分别取经过121℃，,20min湿热灭菌后的硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各100ml置于集菌培养器中培养14天，另取灭菌后的硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各100ml分别加入50-100CFU的金黄色葡萄球菌和白色念珠菌置于培养器中培养14天作为阳性对照，逐日观察结果。并做如表3

5，供试品取样量

一次验证试验取样60支（四次试验取样240支），每30支用100ml的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液溶解，作为一组。

6，验证试验----薄膜过滤法

6.1实验组：

（1）安装KDGB 330集菌培养器，用50ml pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液润湿滤膜。

（2）过滤一组供试液，使每一滤筒即每张滤膜上的药载量为10支。

（3）两付KDGB330集菌培养器（六个滤筒）作为一个梯度，共准备四个梯度即八付集菌培养器，每个梯度分别用相对应的100ml，200ml，300ml，400ml 的pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗，调节泵速100rpm，边冲洗边振摇。（4）分别在相应的细菌培养器内加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，在相应的真菌培养器内加入100ml改良马丁培养基。

（5）分别用1ml的无菌注射器抽取小于100CFU的金黄色葡萄球菌的菌悬液1ml、大肠埃希菌的菌悬液1ml、枯草芽孢杆菌的菌悬液1ml、生孢梭菌的菌悬液1ml分别加入到硫乙醇酸盐流体培养基中，抽取白色念珠菌的菌悬液1ml、黑曲霉的菌悬液加入到改良马丁培养基中。

6.2对照组：

取KDGB330集菌培养器二付，其中4个滤筒分别加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，再依次加入1ml的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌的菌悬液。2个滤筒加入100ml改良马丁培养基，并分别加入1ml的白色念珠菌、黑曲霉的菌悬液。

细菌于30-35°C培养3天，真菌于23-28°C培养5天。每天观察并记录实验结果。其结果见表4