五种滴眼液无菌检查方法的建立

五种滴眼液无菌检查方法的建立

p中国药典2010年版二部将滴眼液的微生物限度检查项目修订为无菌检查项目，根据中国药典2010年版二部的规定[1]，当建立药品的无菌检查方法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适用于该药品的无菌检查。为了保证五种滴眼液的无菌检查结果的可靠性，对五种滴眼液无菌检查方法进行了验证，建立了各品种的无菌检查方法。

1、资料与方法

1.1 资料

妥布霉素滴眼液，规格：（8ml：24mg）/支；批号：3100608；氯霉素滴眼液，规格：（5ml：12.5mg）/支；批号：3100607；色甘酸钠滴眼液，规格：（8ml：0.16g）/支；批号：3100609，；牛磺酸滴眼液，规格：（8ml：0.4g）/支；批号：3100119；马来酸噻吗洛尔滴眼液，规格：（5ml：12.5mg）/支；批号：3100310；样品来源：市售。验证试验用菌种：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌六种阳性对照试验菌，菌种都来源于中检所。

1.2 方法

（1）菌液制备。按中国药典2010年版二部附录XI H进行。

（2）供试液制备。取样品至少60ml，都加置pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液450ml制成供试液，供三株阳性对照试验菌实验；另取同法制得的供试液进行另三株阳性对照试验菌实验。

（3）薄膜过滤法。取一次性全封闭集菌三联培养器，先用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液少量润湿滤膜。将供试液通过三联培养器，供试液全部过滤完毕后，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗，冲洗时充分振摇、荡洗筒壁，细菌每筒分别冲洗0ml、150ml、300ml、400ml，前四次每次冲洗50ml，以后每次冲洗100ml；真菌每筒分别冲洗0 ml、150ml，每次50ml，冲洗三次，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的各阳性对照试验菌，过滤，每筒培养器中加入100ml相应的硫乙醇酸盐流体培养基或改良马丁培养基，作为试验筒。另取已湿润的全封闭集菌培养器加入等量的相应培养基和阳性对照试验菌，作为阳性对照筒。再取两联全封闭集菌培养器，取相应的的溶剂和稀释剂同法操作，但不加入阳性对照菌，作为阴性对照筒。按规定温度培养3～5天，观察不同冲洗量对6株阳性对照试验菌的影响。

2、结果

逐天观察6株阳性对照试验菌在其相应的各培养基管中的生长情况，马来酸噻吗洛尔滴眼液、牛磺酸滴眼液、色甘酸钠滴眼液各试验筒冲洗150ml，6株阳性对照试验菌都生长良好；冲洗0ml，有个别阳性对照试验菌生长缓慢。妥布霉素滴眼液、氯霉素滴眼液各细菌试验筒分别冲洗400ml、300ml，真菌各试验筒冲洗150ml，6株阳性对照试验菌都生长良好；妥布霉素滴眼液细菌试验筒冲洗300ml，枯草芽孢杆菌生长极弱，表明妥布霉素对枯草芽孢杆菌较敏感，此试验条件下对枯草芽孢杆菌有抑菌作用；氯霉素滴眼液细菌试验筒冲洗150ml，枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌生长极弱，表明氯霉素对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌有抑菌作用。因此马来酸噻吗洛尔滴眼液、牛磺酸滴眼液、色甘酸钠滴眼液需氧菌、厌氧菌、真菌分别以150ml/筒的冲洗量检查；氯霉素滴眼液、妥布霉素

滴眼液需氧菌、厌氧菌分别以300ml/筒、400ml/筒，真菌分别以150ml/筒冲洗量检查，采用上述方法对其样品进行无菌检查，结果都符合规定。

3、讨论

五种滴眼液对真菌几无抑制作用，但由于滴眼液中含有羟苯乙酯、硫柳汞或苯扎溴铵等防腐剂，因此白色念珠菌及黑曲霉菌验证也要进行适当的冲洗，才能保证对其无抑菌作用。

玻璃酸钠（透明质酸钠）对眼部的刺激性小，能增加滴眼液的运动黏度，延长药物在泪液中的滞留时间，提高药物的疗效。大部分的滴眼液品种中都含有玻璃酸钠，无菌检查方法采用薄膜过滤法时，为利于样品过滤，减小滤膜对样品中药物的吸附特别是有抑菌或杀菌作用的药物如抗生素，要尽量减小供试液的黏度，因此比较了样品60ml分别加置pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液0ml、100ml、250ml、450ml制成供试液，薄膜过滤，试验结果表明取样品溶液直接过滤，样品溶液本身的黏度大，过滤速度缓慢，冲洗次数及冲洗量明显增加，才能保证得到较好的冲洗效果；稀释剂pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液250ml、450ml制成的供试液，溶液黏度小，过滤速度快些，冲洗量也适当。

参考文献

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010，附录：103～107.