米曲霉培养及蛋白酶分析

米曲霉培养及蛋白酶的分析

•实验目的及要求：通过固态三角瓶培养米曲霉，掌握固态培养微生物原理和技术，并掌握蛋白酶活性的分析方法。

•实验原理：

固态培养方法（ solid state cultivation ）：主要有散曲法和块曲法。部分黄酒用曲，红酒及酱油米曲霉培养属散曲法，而黄酒用曲及白酒用曲一般采用块曲法。

固态制曲设备：实验室主要采用三角瓶或茄子瓶培养；种子扩大培养可将蒸热的物料置于竹匾中，接种后在温度和湿度都有控制的培养室进行培养；工业上目前主要是厚层通风池制曲；转式圆盘式固态培养装置正在试验推广之中。

固态培养微生物，主要用于霉菌的培养，但细菌和酵母也可采用此法。其主要优点是节能，无废水污染。单位体积的生产效率教高。

米曲霉（ Aspergillus oryzae ）属于曲霉菌（ Aspergillus ）。菌落初为白色，黄色，既而变为黄褐色至淡绿褐色，反面无色。

•实验过程：

•米曲霉菌种的纯化，制成斜面，将斜面菌种接入 250ml 三角瓶培养成种曲，再将种曲扩大培养

（ 500ml ）三角瓶。培养物经过水溶液萃取，制得粗酶制剂，取粗酶制剂进行蛋白酶活性测定。

•米曲霉培养：本实验分为斜面培养和三角瓶培养两个阶段。三角瓶培养物在工厂中作为一级种子。试管斜面培养基：豆饼浸出汁： 100 克豆饼，加水 500ml ，浸泡 4 小时，煮沸 3-4 小时，纱布自然过滤，取液，调整至 5 波美度。没 100ml 豆汁加入可溶性淀粉 2 克，磷酸二氢钾 0.1 克，硫酸镁 0.05 克，硫酸铵 0.05 克，琼脂 2 克，自然 pH 。

或采用马铃薯培养基：马铃薯 200 克，葡萄糖 20 克，琼脂 15-20 克，加水至 1000ml ，自然 pH 。三角瓶培养基制备：

米曲霉的培养基： 1 ：麸皮 40 克，面粉（或小麦） 10 克，水 40ml 。

2 ：豆粕粉 40 克，麸皮 36 克，水 44ml 。

装料厚度： 1cm 左右；

灭菌：120 ℃，30min；

接种及米曲霉的培养条件：米曲霉固态培养主要控制条件：温度，湿度，装料量，基质水分含量。固态培养前，原料的蒸熟及灭菌是同时进行的，实验室一般是在高压灭菌锅中进行；但在工厂中则是原料的煮熟和灭菌与发酵分别在不同的设备中进行。这点与液态发酵是不同的。 28-30℃，培养20小时后，菌丝应布满培养基，第一次摇瓶，使培养基松散；每隔8小时检查一次，并摇瓶。培养时间一般为72小时。

3. 实验仪器、设备很材料

恒温培养箱或者固态培养室，负压式超净工作台，显微镜，水浴锅，分光光度计，试管，茄子瓶，平板和 500ml 三角瓶等。

4. 实验分析项目和方法

米曲霉蛋白酶活力的测定方法

（ 1 ）称取充分研细的成曲 5g ，加入 100ml 蒸馏水，40 ℃水浴不间断搅拌20分钟，使其充分溶解。然后用干纱布过滤。吸取滤液1ml，用适当的缓冲液（0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液）稀释一定的倍数（如10、20、或者30倍）。

（ 2）绘制标准曲线

A、取试管7支，编号，按照下表加入试剂。单位：ml

B 、摇匀，置于40 ℃恒温水浴中显色20分钟。

C、用分光光度计在波长为660nm处测定OD值。

D、以光吸收值为纵坐标，以酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。

（ 3 ）蛋白酶活性的测定

A 、取试管三支，编号，每管中加入酶样品稀释液 1ml ，40 ℃水浴锅中预热2分钟，再加入同样预热的

1.0%酪蛋白1ml，精确保温10分钟，立即加入0.4mol/L的三氯乙酸2ml，以终止反应，继续保温20分钟，使残余蛋白质沉淀后过滤。

B、同时另做一对照试管，取酶样品稀释液1ml，三氯乙酸2ml，摇匀，然后再加入1.0%酪蛋白1ml，保温十分钟，保温放置20分钟，过滤。

C、然后另取三支试管，编号，每管内加入滤液1ml，再加入0.4mol/L的碳酸钠5ml，以中和剩余的三氯乙酸，已稀释的福林试剂1ml摇匀，40℃保温发色20分钟，用分光光度计测定OD值（波长660nm）。同时另取两管做B滤液对照和蒸馏水空白对照。

（ 4）计算

在40℃下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为一个酶活力单位。样品蛋白酶活力

单位（湿基）=( A×4n) /(10×5)

A：由样品测定OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数；

4 ： 4ml 反应液取出 1ml 测定；

n ：稀释倍数；

10 ：反应十分钟。

•实验数据处理及图表绘制：

（ 1 ）标准曲线数据：

试管号0 1 2 3 4 5 6

浓度（μg /ml ）0 10/7 20/7 30/7 40/7 50/7 60/7

OD 值 0 0.065 0.166 0.269 0.392 0.450 0.606

（ 2 ）样品数据：

（ 3 ）标准曲线：