实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR技术
千里之行，始于足下。
Real-time PCR for mRNA quantitation一、原理实时荧光定量PCR技术是通过检测PCR产物中荧光讯号强度来达到定量PCR产物的目的，目前该技术已在动植物基因工程，微生物和医学领域中得到广泛应用。
实时定量PCR 包括探针法和染料法两种，探针法是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增强，特异性高，如Taq Man TM技术；染料法则是利用染料来指示扩增的增强，特异性相对较低，但简便易行。
染料法的原理是在PCR 反应体系中，参加过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增强与PCR产物的增强彻低同步。
荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA 产量成正比，检测PCR 过程中的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度，从而达到定量目的。
目前染料法实时荧光定量PCR主要使用的是美国Molecular Probes 公司的SYBR Green 1 和SYBR Gold 染料。
二、实验步骤一）、单链cDNA 摸板的合成（参照相关资料）二）、Real-time PCR操作主意(TIANGEN 公司RealMasterMix(SYBR Green) PCR Kit)1、20×SYBR Green solution 在室温下平衡并彻底混匀。
2、将125μL 20×SYBR Green solution 参加至1.0 ml 2.5×ReaMasterMix 中并轻轻混匀。
3、照表1决定多个PCR反应混合物并分装到各个PCR管中。
4、将PCR管放入热循环仪并启动循环程序（表2）。
三、计算在定量PCR中，需要经过数个循环后荧光信号才干够被检测到。
荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。
在实际操作中普通以前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。
荧光定量PCR中一个关键的数据是“Ct（threshold cycle）值”，其中“t”是Threshold ，即PCR管内荧光超过本底（达到可检测水平）时的临界数值；第 1 页/共 3 页朽木易折，金石可镂。
实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用PPT课件
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
它利用荧光染料或荧光探针标记特异性引物，在PCR反应过 程中，随着DNA或RNA的扩增，荧光信号被逐渐释放，通过 检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA或RNA的扩增量。
实时荧光定量PCR的原理概述
实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，这些荧光物质 与DNA或RNA结合后，在特定波长光的激发下产生荧光信号。
环介导等温扩增技术
在恒温条件下进行核酸扩增，具有快速、特异性强和灵敏度高等优 点。
纳米材料与PCR的结合
利用纳米材料的特性，提高PCR的检测效率和灵敏度。
提高检测灵敏度与特异性
信号放大技术
通过使用信号放大系统，提高检测信号，从而提高检测灵 敏度。
特异性引物和探针的设计
针对目标基因设计特异性引物和探针，降低非特异性扩增 和交叉污染的风险。
选择合适的内参基因
选择稳定的内参基因
01
内参基因应具有稳定的表达水平，不受实验处理的影响。
验证内参基因的稳定性
02
通过实时荧光定量PCR技术，对候选内参基因进行稳定性评估。
使用多个内参基因参基因进行数据校正。
数据解读与报告
标准化处理
对原始数据进行标准化处理，消 除不同样本间的差异。
样本处理
对样本进行破碎、离心、 提取核酸等处理，以获得 待测的DNA或RNA。
浓度和纯度测定
使用紫外分光光度计等设 备测定核酸浓度和纯度， 确保符合实验要求。
引物设计与选择
引物设计
根据目标基因序列，利用 引物设计软件进行引物设 计。
引物筛选
根据实验需求，筛选出特 异性好、扩增效率高的引 物。
实时荧光定量pcr的原理
实时荧光定量pcr的原理实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是一种用于测定DNA或RNA在样本中的数量的技术。
它可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号，从而实现对目标序列的定量分析。
实时荧光定量PCR在生物医学研究、临床诊断、环境监测等领域具有广泛的应用价值。
实时荧光定量PCR的原理基于PCR技术，但在PCR反应过程中引入了荧光探针，使得PCR过程中的荧光信号与目标序列的数量成正比。
下面将详细介绍实时荧光定量PCR的原理。
首先，实时荧光定量PCR需要使用一种荧光探针，通常有两种类型，双标记探针和DNA间接染料。
双标记探针是一种含有荧光素和荧光淬灭剂的探针，当它与目标序列结合时，荧光素和淬灭剂之间的距离被拉大，从而导致荧光信号的增加。
DNA间接染料则是一种无需特定探针的染料，它可以与PCR产物结合并发出荧光信号。
其次，实时荧光定量PCR需要使用一种特殊的PCR仪器，称为实时荧光定量PCR仪。
这种仪器可以在PCR反应过程中实时监测荧光信号的强度，并将其转化为目标序列的数量。
实时荧光定量PCR仪器通常配备了特定的软件，可以自动分析荧光信号的强度，并计算出目标序列的起始数量。
最后，实时荧光定量PCR的原理是基于荧光信号与目标序列数量成正比的关系。
在PCR反应过程中，荧光信号的强度随着PCR产物的增加而增加，从而可以通过监测荧光信号的动态变化来实现对目标序列的定量分析。
实时荧光定量PCR可以实现高灵敏度、高特异性和高准确性的目标序列定量分析，因此在科学研究和临床诊断中得到了广泛的应用。
总之，实时荧光定量PCR是一种基于PCR技术的定量分析方法，它利用荧光探针和实时监测荧光信号的PCR仪器，可以实现对DNA或RNA目标序列的高灵敏度、高特异性和高准确性的定量分析。
实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断和环境监测等领域具有广泛的应用前景。
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量PCR具体实验步骤
实时荧光定量（Real Time quantitative PCR）是检测RNA或DNA的一种常用技术，通过检测特定目标的增加（或减少），可以用来测定RNA 或DNA的表达水平，或者基因等的转录水平。
下面我们就对实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的实验步骤进行具体介绍。
1.搭建实验
第一步是搭建实验，即准备实验所需的干燥试剂，第二步是准备RNA 样本，第三步是准备标准曲线，最后是根据实验需要准备实验板和实验试管。
2、RNA样品提取
在实验中，会使用到多种RNAs，一般情况下使用TRIzol或Phenol 抽提方法进行RNA抽提，不同的细胞、组织中RNA的杂质含量不一样，因此需要根据实验需求进行适当调整抽提浓度。
3、RT-qPCR反转录
在RT-qPCR反转录之前，首先要准备反转录试剂，一般采用qPCR反转录试剂盒，这种试剂盒含有足够的反转录荧光探针以及反转录引物，它可以有效帮助反转录过程。
反转录过程通过复制DNA片段的过程完成，最终转录出的cDNA存在细胞核中。
4、qPCR扩增实验
qPCR扩增实验是在反转录完成后进行，一般来说，这个步骤可以采用qPCR扩增试剂盒，该试剂盒中包含所需的扩增物质如DNA聚合酶、前驱核苷酸、dNTPs，检测细胞核中的cDNA。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
实时荧光定量PCR
制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板 • • • • • • • • • 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 反应物 10× PCR缓冲液 MgCl2 溶液 上游引物F 下游引物R dNTP混合液 Taq聚合酶 cDNA 加水至总体积为 剂量 2.5 ul 1.5 ul 0.5 ul 0.5 ul 3 ul 1 ul 1 ul 25ul
• PCR扩增过 程中，扩增 产物的荧光 信号达到设 定的阈值时 所经过的扩 增循环次数
平台期
Rn（ 荧光强度） Rn（荧光强度）
指数期 Ct值
基线期
Cycle（循环数） （循环数）
Ct值与模板起始量的关系
• 模板DNA量越多，荧光
达到域值的循环数越少， 即Ct值越小。
扩增效率
• 扩增效率与标准曲线的斜率相关，计算方 程为：扩增效率E＝10-1/斜率。理论上，在 每个指数扩增循环中，PCR产物的量加倍 • 一般说来，扩增效率接近100％是优化的重 复性好实验的最好标志，实际操作时，反 应的扩增效率应该在90％－105％之间。
实时定量荧光PCR仪
荧光PCR的定义 荧光PCR的标记 荧光PCR的简介 荧光PCR特点
实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR是通过荧光染料或荧 光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记 跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应 软件可以对产物进行分析，从而精确定量 计算待测样品的初始模板量的方法。
管家基因反应体系 • • • • • • • • • 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 反应物 SYBR Green 1 染料 内参照上游引物F 内参照下游引物R dNTP Taq酶 待测样品cDNA ddH2O 总体积 剂量 10µl 0.5µl 0.5µl 0.5µl 1µl 5µl 32.5µl 50µl
实时荧光定量PCR(RT-qPCR)完全手册
实时荧光定量PCR（RT-qPCR）完全手册所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
RT-qPCR是由三个步骤组成 RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint)关键词：荧光实时实时荧光定量PCRRT-qPCRRT-PCR反转录定量PCRQRT-PCR方法简介所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
RT-qPCR是由三个步骤组成:1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;2. 扩增:用PCR的方法扩增cDNA;3.检测:实时检测和定量扩增的产物.RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint):1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。
对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。
存在的问题由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞3.总RNA或者mRNA4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略5.不同的酶以及酶的不同组合6.变异系数、灵敏度7. 多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。
qpcr三步法
qpcr三步法引言实时荧光定量聚合酶链反应（qpcr）是一种广泛应用于生物学、医学等领域的技术。
它能够快速、准确地测量DNA或RNA样本中的特定序列的数量。
qpcr三步法是进行实时荧光定量PCR的常用步骤。
本文将详细介绍qpcr三步法的原理和操作过程。
原理qpcr三步法基于传统PCR技术，但在反应过程中引入了荧光探针。
这种探针被设计成与待测的特定DNA或RNA序列相互作用，并在PCR反应过程中释放出荧光信号。
通过监测荧光信号的增加，可以确定目标序列的数量。
具体来说，qpcr三步法包括以下步骤：1. 反应混合物的制备首先，需要制备反应混合物，其中包括待测样本的DNA或RNA、引物（用于扩增目标序列的特定DNA序列）和荧光探针（用于检测PCR扩增的目标序列）。
反应混合物还需要包含PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和盐溶液等。
2. PCR扩增反应将反应混合物加入PCR反应管中，并进行PCR扩增反应。
这一步需要将反应管置于热循环设备中，按照特定的温度和时间程序进行PCR扩增。
通常包括初始变性、循环变性、扩增和延伸等步骤。
在每个循环的扩增步骤中，PCR反应管中的目标序列被放大，并产生荧光信号。
3. 荧光信号检测与数据分析在PCR反应过程中，荧光信号会随着PCR扩增产物的积累而增加。
这种荧光信号可以通过qPCR仪器进行实时监测。
qPCR仪器可以定量测量荧光强度，并将其转换为目标序列的初始数量。
通过计算PCR循环阈值（Ct值），可以确定目标序列的初始数量。
Ct值定义为荧光信号达到预设阈值的PCR循环数。
Ct值越低，说明目标序列的初始数量越多。
通过比较待测样本和对照样本的Ct值，可以进一步分析目标序列的表达情况或检测样本中的病原体等。
结论qpcr三步法是一种准确、敏感且快速的DNA或RNA定量技术。
它在生物学、医学等领域具有广泛的应用。
通过实时监测PCR扩增过程中的荧光信号，并进行数据分析，可以定量测量待测样本中的目标序列的数量。
实时荧光定量PCR国际化标准(一)
实时荧光定量PCR国际化标准（一）引言概述:实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，简称qPCR）是一种基于PCR技术的高灵敏度和高特异性的核酸检测方法。
随着其在基础科学研究、临床诊断和生物工程中的广泛应用，国际化标准的建立变得尤为重要。
本文旨在介绍实时荧光定量PCR国际化标准的相关内容。
正文:一、样品准备1. 样品的收集、保存和预处理2. 样品加载量的标准化3. 样品质量验证和污染检测4. 基因组DNA和cDNA的质量控制5. 防止样品交叉污染的措施二、引物和探针设计1. 引物和探针序列选择的标准2. 引物和探针的纯化和稀释3. 引物和探针的特异性验证4. 引物和探针设计软件的使用5. 引物和探针批次一致性的验证三、PCR反应体系和条件1. PCR反应体系的配制2. 反应管的选择和处理3. 温度梯度实验和温度优化4. 补偿和矫正实验条件中的误差5. PCR反应重复性的验证四、阳性和阴性对照1. 阳性对照品的选择和制备2. 阳性对照品的定量和标准化3. 阴性对照的添加和验证4. 阳性和阴性对照的检测范围和灵敏度5. 对照品的质量控制和存储五、数据分析和结果解释1. 荧光曲线分析和阈值设置2. 标准曲线的绘制和斜率计算3. 样品浓度的计算和质权矫正4. 数据处理和统计分析方法5. 结果的解释和报告撰写总结:实时荧光定量PCR国际化标准的确立对于确保实验结果的准确性、可比性和可重复性具有重要意义。
通过规范样品准备、引物和探针设计、PCR反应体系和条件、阳性和阴性对照以及数据分析和结果解释等环节，我们能够实现实时荧光定量PCR方法的国际化标准化，从而为该技术的应用提供更可靠的支持。
实时荧光定量pcr标准曲线
实时荧光定量pcr标准曲线实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）是一种用于检测DNA 或RNA的定量分析技术，其基本原理是利用DNA或RNA在PCR过程中产生的荧光信号来实时监测目标序列的扩增情况。
实时荧光定量PCR标准曲线是评估PCR反应效率和定量分析的重要工具，下面将介绍实时荧光定量PCR标准曲线的构建方法及其在定量分析中的应用。
1. 实时荧光定量PCR标准曲线的构建方法。
实时荧光定量PCR标准曲线的构建需要使用一系列已知浓度的模板DNA或RNA标准品，通过对这些标准品进行系列稀释，得到一系列浓度不同的标准曲线点。
在PCR反应中，利用这些标准曲线点进行定量分析，可以得到PCR反应的效率和灵敏度。
首先，选择合适的模板DNA或RNA标准品，可以是纯化的基因片段、合成的基因片段或者已知浓度的cDNA。
然后，对标准品进行系列稀释，通常选择10倍稀释系列，以得到一系列浓度不同的标准曲线点。
接下来，进行实时荧光定量PCR反应，利用这些标准曲线点进行定量分析，得到PCR反应的效率和灵敏度。
2. 实时荧光定量PCR标准曲线在定量分析中的应用。
实时荧光定量PCR标准曲线在定量分析中起着至关重要的作用。
首先，通过标准曲线可以评估PCR反应的效率，即每个循环的扩增倍数，从而判断PCR反应的质量和稳定性。
其次，利用标准曲线可以进行定量分析，计算待测样品中目标基因的相对或绝对含量，从而实现对目标基因的定量检测。
在实际操作中，构建实时荧光定量PCR标准曲线需要严格控制实验条件，确保反应体系的稳定性和准确性。
此外，选择合适的荧光探针和引物对于实时荧光定量PCR的准确性和灵敏度也至关重要。
总之，实时荧光定量PCR标准曲线是实时荧光定量PCR技术中的重要工具，其构建和应用对于PCR反应的效率评估和目标基因的定量分析具有重要意义。
在实际应用中，科研人员需要充分理解实时荧光定量PCR标准曲线的构建方法和应用原理，以确保实验结果的准确性和可靠性。
实时荧光定量pcr原理
实时荧光定量pcr原理实时荧光定量PCR（qPCR）是一种用于检测DNA或RNA的定量分析技术，它结合了PCR技术和实时荧光检测技术，可以实现对目标序列的快速、准确和高灵敏度的定量检测。
本文将介绍实时荧光定量PCR的原理及其在科研和临床诊断中的应用。
首先，实时荧光定量PCR的原理是基于PCR技术和荧光探针技术的结合。
在PCR过程中，DNA或RNA模板会被特异性引物引导进行扩增，同时荧光探针与目标序列结合并释放出荧光信号。
随着PCR的进行，目标序列的数量会不断增加，荧光信号也会随之增加。
利用荧光检测仪器可以实时监测PCR反应体系中的荧光信号强度，从而实现对PCR反应过程的实时监测和定量分析。
实时荧光定量PCR的优势在于其高灵敏度、高特异性和高准确性。
相比于传统的终点荧光定量PCR，实时荧光定量PCR可以在PCR反应过程中实时监测目标序列的扩增情况，从而可以准确地确定起始模板的数量。
此外，实时荧光定量PCR还可以通过荧光探针的设计实现多重PCR反应的同时检测，大大提高了检测的通量和效率。
在科研领域，实时荧光定量PCR被广泛应用于基因表达分析、病原微生物检测、基因突变分析等领域。
通过实时监测PCR反应过程中的荧光信号，可以准确地确定不同样本中目标基因的表达水平，从而揭示基因在生理和病理过程中的作用。
在临床诊断中，实时荧光定量PCR也被用于病原微生物的检测和基因突变的筛查，其高灵敏度和高特异性使其成为临床诊断的重要辅助手段。
总之，实时荧光定量PCR作为一种高效、准确的定量分析技术，已经成为科研和临床诊断中不可或缺的工具。
其原理简单、操作方便，可以快速、准确地实现对DNA或RNA的定量分析。
随着技术的不断进步和发展，相信实时荧光定量PCR在科研和临床诊断中的应用前景将更加广阔。
RT-qPCR(实时荧光定量PCR)
• 2、Molecular Beacon 分子信标。标记荧光的发夹
探针，环与目标序列互补，茎由互补配对序列组成 。变性过程：产生非特异性荧光；延伸过程：不产 生荧光；退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信 号。
• 3、Amplisensor 双链信号引物，进行半巢式扩增
；随着PCR循环的重复进行，信号引物的双链结构 被破坏，其中一条链参与到产物的合成中，荧光消 失，产物量与荧光成反比。
4. 反应Buffer体系的优化
5. 反应温度和时间参数:由酶和引物决定
6. 其他与常规PCR相同
优 点
对DNA模板没有选择性 ----适用于任何DNA 使用方便 -----不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜
缺 点
容易与非特异性双链DNA结合，产 生假阳性，但可以通过融解曲线的分
1
RT-qPCR 原理----绝对定量
R2为相关系数：R2>0.99时，认为 两数值之间相关性好。 E为扩增效率：一般认为在90%110%之间数据可用。 Logo
1
2.相对定量
RT-qPCR 原理----相对定量
病人内参 基因 Ct a
病人目的 基因 b
对照内参 基因 c
对Байду номын сангаас目的 基因 d
������−∆∆������������ = ������−(∆������������������−∆������������������) = ������−[
������−������ −(������−������)]
结果表示病人的目的基因的表达是对照组目的基因表达的多少倍。
Logo
RT-qPCR 原理----融解曲线
荧光强度
实时荧光定量pcr的原理和方法
实时荧光定量pcr的原理和方法实时荧光定量PCR（qPCR）是一种分子生物学技术，用于检测和定量特定DNA或RNA序列的存在和相对丰度。
它可以在短时间内快速、准确地测量目标序列的数量，并在许多领域中被广泛应用，包括基因表达分析、病原体检测和基因突变分析等。
实时荧光定量PCR的主要原理是通过放大DNA模板，并使用荧光探针或染料进行实时监测。
这些荧光探针通常是DNA寡核苷酸序列，带有一个共振能量转移对（RET pair），由一个荧光引物（donor）和另一个荧光引物（acceptor）组成。
在初始的PCR循环中，通过在高温下使DNA变性，使两个引物和DNA分离。
在下一个低温的退火步骤中，这两个引物会与DNA互补结合。
当两个引物结合到DNA模板上时，它们的荧光引物也会接近彼此，从而使共振能量转移发生，导致荧光信号减弱或消失。
这种现象被称为荧光淬灭。
当PCR循环继续进行时，每个复制周期会以指数级增加DNA模板的数量。
由于引物的结合会导致荧光淬灭，因此在每个PCR循环的末尾，荧光信号将与DNA模板的数量成正比。
实时荧光定量PCR中常用的荧光探针有探针PCR和SYBR Green。
探针PCR使用两个引物和一个荧光探针，该探针带有一个荧光团和一个辅助荧光团。
在荧光探针与DNA模板结合时，两个荧光团之间的共振能量转移会发生，导致荧光信号的减弱。
SYBR Green则是一种将DNA结合的染料，在PCR循环中，SYBR Green会与所有DNA结合，并发出荧光信号。
使用探针PCR时，可以通过测量荧光信号的减弱来确定目标DNA的存在量。
而使用SYBR Green时，可以通过测量荧光信号的增加来判断目标DNA的数量。
实时荧光定量PCR的操作过程如下：1. DNA提取和纯化：从样品中提取所需的DNA或RNA，并经过纯化处理，以去除可能干扰PCR反应的杂质。
2. 引物设计：设计适合的引物和荧光探针，以在PCR反应中特异性地扩增目标序列。
实时荧光定量聚合酶链反应技术
实时荧光定量聚合酶链反应技术实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是实时荧光PCR（real-time PCR）的一种。
实时荧光PCR是指在PCR反应体系中加入可以反映PCR扩增进程的荧光基团，并在PCR过程中实时监测荧光信号的变化。
实时荧光定量PCR技术则是将定量PCR的原理应用到实时荧光PCR，通过在实时荧光定量PCR的基础上引入已知浓度的参照基因，或者通过标准曲线来达到对目的基因初始浓度的定量，换句话说，实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中加入荧光基团（如荧光染料、荧光基团标记的探针或引物），并在整个PCR进程中实时监测荧光信号的累积，最后通过参照基因或标准曲线对未知浓度的模板进行定量分析。
实时荧光定量PCR是20世纪90年代初期快速发展起来的可对起始DNA模板浓度精确定量的PCR方法。
在实时荧光定量PCR技术的发展进程中，两个重要的发现起着关键的作用：①在20世纪90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光记探针，因此使得间接的检测PCR产物成为可能；②此后，荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。
随着实时荧光定量PCR技术方法的成熟与稳定，以及配套仪器的不断完善，实时荧光定量PCR已经走向临床，如应用于各种病原体的检测。
一、定量PCR的原理与类别定量PCR是指以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数。
定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行。
根据PCR扩增过程中是否加入某种标记物、标记物的种类和最后检测的信号的不同可分为至少4种类型：直接定量检测法、放射性核素标记定量检测法、酶标记定量检测法和实时荧光定量PCR法。
根据反应体系是否设有参照物及其是否与标本在同一管中进行扩增，定量PCR可分为4种方法：（一）有限稀释法也叫倍比稀释法，其参照品的浓度是通过不断稀释直至靶基因不能再扩增为止，然后根据阳性结果的最大稀释度及内参标或外参标的极限检出底线，计算出待检标本中原始模板的分子数。
实时荧光定量PCR-TaqMan探针法及设计原则
03
Taqman探针的合成与制备
探针的合成方法
化学合成法
通过化学反应将荧光基团和淬灭基团分别连接到DNA或RNA的5'和3'末端，形成 Taqman探针。
酶促合成法
利用DNA聚合酶将荧光基团和淬灭基团分别添加到DNA或RNA的特定位置，形成 Taqman探针。
探针的质量检测与纯化
质量检测
通过电泳、质谱和光谱分析等方法检测探针 的长度、荧光基团和淬灭基团的数量和位置 ，以及探针的纯度。
定义与原理
定义
实时荧光定量PCR-Taqman探针法是 一种基于荧光信号的实时监测技术， 用于定量分析DNA或RNA的拷贝数。
原理
通过在Taq酶催化下，利用荧光染料 标记的特异性探针与待测核酸进行特 异性结合，在PCR循环过程中实时监 测荧光信号的增强，从而实现对核酸 的定量分析。
发展历程与现状
02
Taqman探针的设计原则
探针的长度与结构
长度
通常为20-30bp，确保特异性并减少非特异性扩增。
结构
由报告基团、淬灭基团和连接臂组成，连接臂长度一般为5-6个脱氧核糖核苷酸。
探针的特异性
针对目标序列
确保探针与目标序列完全匹配，避免 交叉反应。
序列选择
选择基因特异性区域，避免基因组中 的高变区。
04
Taqman探针在实时荧光定量 PCR中的应用
样本处理与PCR反应体系建立
样本处理
确保样本质量，去除杂质和抑制剂，提 取高质量的DNA或RNA。
Taqman探针设计
根据目标基因序列设计Taqman探针， 确保探针的特异性和荧光信号的稳定
性。
引物设计
根据目标基因序列设计特异性引物， 确保引物与模板的结合效率和特异性。
qpcr原理
qpcr原理qPCR原理。
实时荧光定量PCR（qPCR）是一种用于检测DNA或RNA的数量的分子生物学技术。
它是基于PCR技术的扩增原理，通过测量DNA 或RNA扩增过程中的荧光信号来定量目标分子的数量。
qPCR技术在医学诊断、基因表达分析、病原体检测等领域有着广泛的应用。
qPCR的原理基于荧光信号的检测。
在PCR扩增过程中，随着DNA或RNA模板的扩增，荧光信号也会随之增加。
这种荧光信号可以是DNA双链结构特异性染料的荧光信号，也可以是与PCR产物结合的探针的荧光信号。
通过检测荧光信号的强度，可以推断目标分子的数量。
qPCR的基本步骤包括样品制备、引物设计、PCR扩增和数据分析。
首先，需要从样品中提取DNA或RNA，并进行适当的纯化和稀释。
接下来，需要设计引物和探针，引物的选择对PCR扩增的特异性和效率有着重要的影响。
然后，在PCR反应中加入DNA或RNA模板、引物、探针和PCR反应体系，进行PCR扩增。
最后，通过检测PCR反应过程中的荧光信号，可以得到样品中目标分子的数量。
qPCR技术有着许多优点。
首先，它具有高灵敏度和高特异性，可以检测到非常低浓度的目标分子。
其次，由于荧光信号是实时检测的，因此可以得到PCR反应过程中的动态信息，包括指数增长期和平台期，这对于定量分析非常重要。
此外，qPCR技术还可以进行多重检测，即在同一反应体系中检测多个目标分子，这在高通量分析中有着重要的应用价值。
然而，qPCR技术也存在一些局限性。
首先，引物和探针的设计需要严格控制，否则可能会导致假阳性或假阴性结果。
其次，样品的制备和纯化对于结果的准确性也有着重要的影响，特别是对于含有抑制物的样品。
此外，qPCR技术的数据分析也需要严格的标准化和质量控制，以确保结果的可靠性。
总的来说，qPCR技术是一种非常重要的分子生物学技术，它在科研和临床诊断中有着广泛的应用前景。
随着技术的不断发展，相信qPCR技术将会在生命科学领域发挥越来越重要的作用。
实时荧光定量pcr的方法
实时荧光定量pcr的方法
实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR）是一种用于精确测量DNA 或RNA样本中特定目标序列数量的分子生物学技术。
该方法结合了传统PCR 技术和荧光探针技术，可以在PCR反应过程中实时监测和定量特定目标序列的扩增量。
实时荧光定量PCR的步骤如下：
1. 准备反应体系：包括特定目标序列的引物和荧光探针、PCR反应缓冲液、酶和DNA模板。
2. PCR反应：将反应体系放入实时荧光定量PCR仪中进行扩增反应。
PCR过程中，引物与DNA模板结合，酶进行DNA合成，目标序列得到扩增。
3. 荧光探针监测：在PCR反应中，荧光探针与目标序列结合，产生荧光信号。
实时荧光定量PCR仪会实时监测和记录荧光信号的强度。
4. 数据分析：实时荧光定量PCR仪会根据荧光信号的强度，通过计算机算法来计算目标序列的起始数量。
可以利用标准曲线法或相对定量法进行数据分析，得到目标序列的绝对或相对数量。
实时荧光定量PCR具有高灵敏度、高特异性、高准确性和广泛线性范围等优点，
广泛应用于分子生物学、医学诊断、基因表达分析等领域。
实时荧光定量pcr技术原理
实时荧光定量pcr技术原理宝子们！今天咱们来唠唠一个超酷的技术——实时荧光定量PCR技术。
这玩意儿听起来是不是就感觉很厉害的样子？那啥是PCR呢？PCR就像是一个复印机，不过它复印的不是文件，而是DNA。
普通的PCR就是把一小段DNA不断地复制，让它的数量变得超级多。
就好像你有一颗小种子，然后通过某种魔法，让它变成一大片花海，超神奇的吧！那实时荧光定量PCR呢，它可不只是简单地复制DNA哦。
它呀，在复制的过程中还能实时地检测DNA的数量。
这就好比你在种小种子的时候，还能随时知道已经长出来多少朵花了。
这里面有个关键的东西就是荧光染料或者荧光探针啦。
咱先说说荧光染料这个小机灵鬼。
荧光染料就像一个小间谍，它特别喜欢和DNA结合。
当它和DNA结合的时候呢，就会发出荧光信号。
随着DNA被复制得越来越多，结合的荧光染料也就越来越多，那发出的荧光信号就越来越强啦。
就像一群小萤火虫，最开始只有几只，慢慢地就变得好多好多，整个地方都亮闪闪的。
再说说荧光探针这个有趣的家伙。
荧光探针就像是一个带着特殊任务的小信使。
它的结构有点特别，一头是荧光基团，另一头是淬灭基团。
在没有发生反应的时候呢，这个荧光基团发出的光会被淬灭基团给弄没了，就像你想点亮一个小灯，但是旁边有个小怪兽把光给吞掉了。
可是呢，当PCR反应进行的时候，这个探针会和DNA结合，然后就像一把小剪刀把探针剪断了，这样荧光基团就自由啦，就可以发出明亮的荧光啦。
是不是感觉像一场小小的魔法秀呢？那这个技术为啥这么有用呢？它可以用来检测很多东西哦。
比如说在医学上，可以检测病毒的数量。
如果有个病人感染了病毒，通过这个技术就能知道他身体里到底有多少病毒在捣乱。
这就像我们要和病毒打仗，得先知道敌人有多少兵力一样。
如果病毒数量很多，那我们就得用更厉害的武器去对付它。
在科研上，这个技术也超棒的。
可以用来研究基因的表达量。
就像每个基因都有自己的小脾气，有的时候很活跃，表达量就高；有的时候就很安静，表达量就低。
实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：
1. TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸， 两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收； PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系 统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全 同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断 和个体化用药分析的首选技术平台。
2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞 争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物 被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已 知模板推测未知模板的起始拷贝数。
谢谢观看
3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地 高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加 入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR目前实时荧光定量PCR已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等......荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR Green I 的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法SYBR Green I 的非特异性方法(试剂盒：LightCycler 480 SYBR Green I Master）SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。
在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。
因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA数量。
一、实验前准备：实验试剂及耗材：试剂：特异性PCR引物，新鲜提取备用的总RNA试剂盒:Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit、LightCycler 480 SYBR Green I Master1号管包含：热启动Taq DNA Polymerase、反应缓冲液、dNTP mix、SYBR Green I染料、MgCI2仪器及耗材：罗氏LightCycler 480全自动实时定量PCR仪以及配套使用的48或96孔板；Thermo Scientific Arktik PCR仪、F1单道移液器、冰盒、QSP盒装吸头等正式实验开始前，冰上解冻各个试剂【注意：SYBR Green I Master 需要避光放置】二、反转录实验操作时注意：所有RNA相关的操作均需要佩戴手套，防止RNase污染。
严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。
按照体系配方在冰上的Rnasefree的灭菌PCR管中配置Templateprimer mix，总体系13ul。
本实验是联合使用anchored oligo dT引物和随机六聚体引物进行的反转录。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
实时荧光定量PCR
所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
实验材料
细胞样品
试剂、试剂盒
RNA提取试剂盒、荧光定量PCR Mix、TRIZOL、dNTP、氯仿、逆转录酶MMLV、异丙醇、Taq酶、DEPC水、ddH2O、TE、MgCl2、琼脂糖、溴化乙锭、MOPS、甲醛、乙酸钠、EDTA、EB、溴酚兰。
乙醇
仪器、耗材
离心管、离心机、分光光度计、电泳槽、凝胶板、Realtime PCR仪。
计时器、低温高速离心机、水浴箱、实验步骤
一、样品RNA的抽提
1.取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全
溶解。
2.两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加
入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒
后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离
心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
3.RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
4.RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O 配制），清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
5.RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
6.溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA 溶液保存于-80℃待用。
二、RNA质量检测
1.紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计
260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
（1）浓度测定
A260下读值为1表示40μg RNA/ml。
样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260×稀释倍数×40μg/ml。
具体计算如下：
RNA溶于40μl DEPC水中，取5μl，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260=0.21
RNA浓度=0.21×100×40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl
取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35μl，剩余RNA总量为：
35μl×0.84μg/μl=29.4μg
（2）纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围
1.8到
2.1。
2.变性琼脂糖凝胶电泳测定
（1）制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10×MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS电泳缓冲液
浓度成分
0.4M MOPS，pH7.0
0.1M乙酸钠
0.01M EDTA
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。
胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
（2）准备RNA样品
取3μgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10μg/ml。
加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
（3）电泳
上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。
5-6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2-3cm。
（4）紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。
还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。
在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。
RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。
用数码照相机拍下电泳结果。
三、样品cDNA合成
1.反应体系
序号反应物剂量
1逆转录buffer2μl
2上游引物0.2μl
3下游引物0.2μl
4dNTP0.1μl
5逆转录酶MMLV0.5μl
6DEPC水5μl
7RNA模版2μl
8总体积10μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
2.混合液在加入逆转录酶MMLV之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。
3.取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。
四、梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR
1.β-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl 并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
2.反应体系如下：
标准品反应体系
序号反应物剂量
1SYBR Green1染料10μl
2阳性模板上游引物F0.5μl 3阳性模板下游引物R0.5μl
4dNTP0.5μl
5Taq酶1μl 6阳性模板DNA5μl 7ddH2O32.5μl
8总体积50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
3.管家基因反应体系：
序号反应物剂量1SYBR Green1染料10μl 2内参照上游引物F0.5μl 3内参照下游引物R0.5μl 4dNTP0.5μl 5Taq酶1μl 6待测样品cDNA5μl 7ddH2O32.5μl 8总体积50μl 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
3.制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃2分钟，然后93℃1分钟，55℃2分钟，共40个循环。
五、制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
1.针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
2.反应体系
序号反应物剂量110×PCR缓冲液 2.5ul
2MgCl2溶液 1.5ul
3上游引物F0.5ul
4下游引物R0.5ul
5dNTP混合液3ul
6Taq聚合酶1ul
7cDNA1ul 8加水至总体积为25ul 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）；72?C延伸5分钟。
（3）PCR产物与DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
（4）将PCR产物进行10倍梯度稀释:将PCR产物进行10倍梯度稀释:设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
六、待测样品的待测基因实时定量PCR
1.所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系。
2.体系配置如下：
序号反应物剂量
1SYBR Green1染料10ul
2上游引物1ul 3下游引物1ul
4dNTP1ul 5Taq聚合酶2ul 6待测样品cDNA5ul 7ddH2O30ul 8总体积50ul 轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
（3）将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。
反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。
七、实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件：Primer Premier5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
八、电泳
各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。
PCR产物与DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
讨论：
实时荧光定量PCR的引物能不能用来做RT-PCR
一般的RT-PCR引物是不能用来做是实时荧光定量的的引物的，但是你可以设计出兼顾二者的引物，除了要注意一般引物设计的原则外，愚见认为还要注意下两个问题：1：设计引物扩增出来的片段一定要小一点不要超过250bp尽量在200bp以内，150bp以上2：实时荧光定量的引物一定要更加注重它的错误引发效率，越低越好。
熔解曲线是为了验证扩增产物特异性的，要是熔解曲线是单峰说明产物只有一条，结果较好；要是双峰说明产物不特异，可能存在引物二聚体或非特异性扩增，有可能你的引物设计有问题。