猪Dlx5基因多态性及其与猪体尺和胸椎数的关系

猪Dlx5基因多态性及其与猪体尺和胸椎数的关系摘要:为探讨猪远端缺失基因5(distal-less homeobox 5,Dlx5)的多态性､群体分布特性及其与体尺和胸椎数的关系,采用PCR-RFLP方法检测了猪Dlx5基因g.394C>T 位点在6个中外猪品种中的多态性分布,并分析了该位点与猪体尺和胸椎数的关系｡检测结果表明,经HhaⅠ酶切后在6个猪品种群体均发现了CC､CT和TT 3种基因型,其中C等位基因在莱芜黑猪中为优势等位基因,而T等位基因在里岔黑猪､鲁莱黑猪､杜洛克猪､大约克猪和长白猪中占优势｡在该多态性位点,莱芜黑猪､里岔黑猪､鲁莱黑猪､杜洛克和长白猪群体均处于哈代—温伯格平衡(P>0.05),而大约克猪群体偏离平衡状态(P<0.05);基因型在群体间的分布差异极显著(P<0.01)｡群体遗传特性分析表明,有效等位基因数在 1.254~1.991之间;杜洛克猪的多态信息含量为0.182,属于低度多态,其余品种均在0.254~0.374之间,属于中度多态｡关联分析结果表明,该多态性位点对莱芜黑猪体长､体高､屠前活重､腹围､胸围､腿臀围和胸椎数以及里岔黑猪胸椎数的影响均不显著(P>0.05)｡Dlx5基因g.394C>T位点在猪群中存在多态,基因型分布在莱芜黑猪与其他猪种间不同,与猪体尺和胸椎数无显著关联｡关键词:猪;远端缺失基因5(distal-less homeobox 5,Dlx5);多态性;体尺;胸椎Polymorphisms of Distal-less Homeobox 5 (Dlx5) Gene in Pigs and Its Association with Body Sizes and Thoracic Spine NumbersAbstract: This study was conducted to investigate the polymorphism, genetic distribution of distal-less homeobox 5 gene (Dlx5) in pigs and its associations with body sizes and thoracic spine numbers. The polymorphism distribution of g.394C>T loci. in Dlx5 gene of 6 breeds of pigs were detected by PCR-RFLP and the relationship between the Dlx5 genotypes and body sizes and thoracic spine numbers were analyzed. The results showed that there were three genotypes such as CC, TC and TT in the 6 pig populations found by enzyme digestion of HhaⅠ. Allele C was dominant in Laiwu black pigs, and allele T was dominant in Licha black pigs, Lulai pigs, Duroc pigs, Yorkshire pigs and Landrace pigs, respectively. A chi-square analysis showed that the genotype distribution in this polymorphism loci. in Laiwu black pigs, Licha black pigs, Lulai Black pigs, Duroc pigs and Landrace pigs populations were in Hardy-Weinberg equilibrium (P>0.05), whereas was not in Yorkshire pigs (P<0.05). The distribution of CC, TC and TT genotypes was significantly different (P<0.01) among six populations. Population genetics analysis showed that effective number of alleles were ranged from 1.254 to 1.991. The polymorphism information content (PIC)in Duroc pigs was 0.182 which was in low polymorphic, while it was ranged from 0.254~0.374 in other pigs which was in moderate polymorphic. The association analysis showed that the Dlx5 g.394C>T mutation was not significantly associated with body length, height at withers, liveweight, abdominal circumference, chest circumference, hip circumference and numbers of thoracic spine of Laiwu black pigs and numbers of thoracic spine of Licha black pigs(P>0.05). It indicated that there the g.394C>T loci in Dlx5 gene were polymorphism in the six pig populations and the genotype distribution in Laiwu black pigs were different with other breeds. And no significant association was detected between the loci. and body sizes and thoracic spine numbers in pigs.Key words: pig; distal-less homeobox 5 gene; polymorphism; body sizes; thoracic spine远端缺失基因(Distal-less homeobox,Dlx)主要调控动物远近轴的发育｡其中,脊椎动物Dlx基因编码一种保守性较高的转录因子,在软骨和骨骼的形成中可能发挥一定作用｡Dlx5在骨骼发育的早期开始表达,能直接激活骨骼形成和间接激活骨骼吸收以及促进骨折愈合,是骨骼更新的重要调控子[1,2]｡研究发现,猪Dlx5基因外显子1存在一个单核苷酸多态性(SNP)(EU168272: g.394C>T),猪群中存在TT ､TC和CC 3种基因型,与猪的部分胴体性状有关[3]｡但该多态位点与胸椎数及其相关性状的关系未见报道｡因此,本研究分析了该多态性位点在6个中外猪种中的多态性,并分析了其与莱芜黑猪体尺和胸椎数以及与里岔黑猪胸椎数的关系,以期为阐明Dlx5在猪重要经济性状形成中的作用奠定基础,为发掘地方猪种的基因资源及培育新品系提供理论依据｡1 材料与方法1.1 试验材料本试验所用的3个山东地方/培育猪种,分别为莱芜黑猪26头和鲁莱黑猪(大约克♂×莱芜黑猪♀)30头(采自山东省莱芜黑猪原种猪场),里岔黑猪75头(采自山东省胶州市里岔黑猪育种中心)｡3个引进猪种分别为杜洛克猪70头､大约克猪62头和长白猪39头(采自山东省农业科学院畜牧研究所良种猪育种中心)｡所有试验猪饲喂同一日粮､自由采食,饲养管理､防疫措施一致｡采集猪耳组织放入70%乙醇中,-20 ℃保存｡1.2 试验方法1.2.1 DNA提取猪耳组织中基因组DNA提取按常规苯酚/氯仿方法进行,0.8%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测基因组的浓度和纯度,-20 ℃保存｡1.2.2 性能测定对达到365日龄的26头莱芜黑猪测定体长､屠前活体质量､腹围､胸围､腿臀围和胸椎数,测定方法根据《种猪测定原理与方法》进行[4]｡对达到100 kg左右的75头里岔黑猪屠宰,记录胸椎数｡1.2.3 PCR扩增引物参照Cheng等[3]序列,由上海生工生物工程技术有限公司合成｡引物序列为:F:5′-GCCACCGCCAGTGAATGA-3′,R:5′-TATCTGTCCCCACCCCCAC-3′｡PCR反应体系:10×PCR Buffer 2.5 μL,MgCl2(25 mmol/L)2 μL,dNTPs(各2.5 mmol/L)2 μL(TaKaRa),上下游引物(25 μmol/L)各0.4 μL,rTaq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL(TaKaRa),基因组DNA(50~100 ng/μL)1 μL,灭菌超纯水加至25 μL｡PCR扩增程序:94 ℃4 min,然后94 ℃30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,进行35个循环,72 ℃ 10 min｡PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测｡1.2.4 PCR-RFLP 在 4 μL PCR产物中加入 4 U的HhaⅠ内切酶(TaKaRa),10×M Buffer 1 μL,灭菌超纯水加至10 μL,37 ℃水浴消化6 h,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,观察和记录酶切结果,判断个体的基因型｡1.2.5 PCR产物测序经HhaⅠ内切酶酶切后,对不同基因型个体的PCR产物用柱式胶回收试剂盒回收纯化,回收后的PCR产物送上海生工生物工程技术服务公司直接测序｡1.3 统计分析统计HhaⅠ酶切后的各种基因型,用PopGen32软件计算基因频率､遗传纯合度(H0)､遗传杂合度(He)､有效等位基因数(Ne),并作χ2适合性和独立性检验;用软件PIC_Calc 0.6计算多态信息含量(PIC)｡根据固定效应模型,用SAS 8.2软件GLM程序对莱芜黑猪不同基因型个体体尺和胸椎数以及里岔黑猪胸椎数的最小二乘均值进行估计和显著性检验｡统计分析模型为:Yij=μ+Gi+Sj+eij,其中Yij为性状表型值,μ为群体平均值,Gi为基因型效应,Sj为性别效应,eij为残差效应｡2 结果与分析2.1 Dlx5基因PCR扩增和HhaⅠ酶切结果以猪耳组织DNA为模板,经PCR扩增,得到1条399 bp的特异性条带(图1),与根据GenBank登录序列计算的片段大小相同｡PCR产物经HhaⅠ限制性内切酶酶切后,得到3种基因型(图1),分别为TT(399 bp),TC(399/222/177 bp),CC(222/177 bp)｡2.2 不同基因型的序列差别测序结果表明,猪Dlx5基因394位碱基C→T,通过与人､小鼠､大鼠和鸡Dlx5基因比对发现,这些物种在该位点均为C,3种基因型测序结果如图2所示｡2.3 不同猪种Dlx5基因的基因型和基因频率及群体χ2检验根据HhaⅠ内切酶酶切结果,统计6个猪群的基因型和基因频率分布见表1｡从表1可知,每个群体均检测到3种基因型,在莱芜黑猪中C为优势等位基因,而鲁莱黑猪T为优势等位基因,TC在这两个猪种中均为优势基因型;在里岔黑猪､杜洛克猪和大约克猪中T为优势等位基因,TT为优势基因型;在长白猪中也是T为优势等位基因,TT和TC均为优势基因型,其基因型频率均为0.436｡经χ2适合性检验发现,除了大约克猪外,其余群体基因型分布均达到了哈代—温伯格平衡(P>0.05)(表1)｡经χ2独立性检验,不同基因型在群体间的分布差异极显著(P<0.01,χ2=61.66>χ20.01(10)=23.209)(表2)｡由表2可知,莱芜黑猪与里岔黑猪､杜洛克猪､大约克猪差异极显著(P<0.01);里岔黑猪与鲁莱黑猪､杜洛克猪和大约克猪差异极显著(P<0.01);鲁莱黑猪与杜洛克猪差异极显著(P<0.01),与大约克猪差异显著(P<0.05);杜洛克猪与大约克猪和长白猪差异极显著(P<0.01);大约克猪与长白猪之间差异极显著(P<0.01),其余猪种之间差异均不显著(P>0.05)｡2.4 Dlx5基因的遗传特性分析Dlx5基因在6个猪群的遗传特性分析见表3｡结果表明,所检测各群体的杂合度(He)较大,杂合度由低到高依次为杜洛克､里岔黑猪､大约克猪､长白猪､鲁莱黑猪､莱芜黑猪｡多态信息含量(PIC)分析结果表明,除杜洛克猪PIC<0.250,处于低度多态外,其余各群体PIC均在0.250~0.500之间,表明该位点在这5个猪种中均处于中度多态｡2.5 Dlx5基因不同基因型与莱芜黑猪体尺和胸椎数的关联分析在对莱芜黑猪Dlx5基因g.394C>T位点多态性检测的基础上,对26头莱芜黑猪体尺和胸椎数与该位点多态性的关系进行了分析(表4)｡结果显示,3种基因型TT､TC和CC对莱芜黑猪体尺和胸椎数影响均不显著(P>0.05)｡2.6 Dlx5基因不同基因型与里岔黑猪胸椎数的关联分析对75头里岔黑猪胸椎数关联分析结果表明(表5),TT､TC和CC 3种基因型对里岔黑猪胸椎数影响同样未达到差异显著的水平(P>0.05)｡3 讨论3.1 Dlx5基因多态性在不同猪群中的遗传分析研究表明Dlx5基因的失活可以使小鼠颅面骨､中轴骨和附肢骨骼异常,导致围产期小鼠死亡[5],所以Dlx5基因对于调节哺乳动物肢体的发育起着非常重要的作用｡本研究对同源盒基因Dlx5外显子1的多态性在不同猪群中的分布进行了检测,在所检测的6个猪群中均发现了3种基因型,但等位基因T和C在不同猪群存在一定差异｡在莱芜黑猪中C等位基因占优势,但在其他猪种中均是T等位基因占优势,而Cheng等[3]在所检测的310头大约克猪×梅山猪的杂交F2代中却是C等位基因占优势｡经序列分析发现在人(GenBank No:NM_005221.5)､小鼠(GenBank No:NM_198854.1,NM_010056.2)､大鼠(GenBank No:NM_012943.1)和鸡(GenBank No: NM_204159.1)Dlx5基因的该位点也是C等位基因占优势｡本研究之所以与上述研究和其他动物Dlx5基因在该位点存在差异,可能与动物品种有关｡3.2 Dlx5基因多态性与莱芜黑猪体尺和胸椎数的关系研究表明,Dlx5基因能直接调节谷氨酸脱氢酶的表达和促进GABAergic(g-aminobutyric acid ergic)神经元的分化[6],并且已经证明Dlx5在人类淋巴母细胞核和大脑组织中具有印记效应[7],但Kimura等[8]认为在小鼠脑中不存在印记效应｡最近的研究表明,Dlx5基因在杂交猪的骨骼肌､脂肪､肺､胃和小肠中呈母性表达,而在心､肝､肾､子宫､卵巢､睾丸或者垂体中不存在印记效应[3]｡而印记基因在调控哺乳动物胎儿生长､发育和胎盘的功能以及出生后的行为方面具有重要的功能｡Dlx5基因外显子1C→T的突变导致丙氨酸变为缬氨酸,这可能改变蛋白质的结构,而蛋白质结构的变化可能影响到骨骼的发育和生长激素的分泌[3]｡猪体长与胸椎和腰椎的数量有关,其胸腰椎骨数一般在20枚左右,一般每增加1枚椎骨数,体长可以增加1.84 cm｡猪椎骨数的遗传力为0.75,胴体长与椎骨数有强的遗传相关[9]｡本试验中莱芜黑猪TC基因型个体胸椎数多于TT和CC基因型个体,而里岔黑猪TT基因型胸椎数稍多于TC基因型,但均未达到差异显著水平(P>0.05),是否TT或者TC基因型对猪的脊椎发育起着一定的作用,尚需进一步研究｡此前,Cheng等[3]发现杂交猪(大白猪×梅山猪)F2代资源家系的不同基因型胴体长､骨骼百分比､平均背膘厚等性状呈极显著差异,而本研究不同基因型其体尺差异却不显著,可能与样本含量较少有关｡另外,最近研究发现BMP-2蛋白能促进Dlx5 mRNA表达水平增高[10],而属于BMPs亚家族的GDF11基因在确立骨骼模式中起着重要作用,GDF11基因缺失的小鼠表现为胸腰脊椎数增加[11,12]｡猪BMP-2､GDF11与Dlx5间的关系值得进一步探讨｡致谢:在试验过程中得到2009届毕业生王留强和胡刘岩同学以及2008级生物技术专业贾坤航同学的帮助,在此表示感谢!参考文献:[1] MASUDA Y,SASAKI A,SHIBUYA H, et al. 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