第三章 3-1目的基因的获得

第三章 目的基因的获得 －目的基因的分离克隆及其方法功能基因的4个特性：1.基因有固定的一级结构 2.每个基因在染色体上占有特定的位置 3.每个基因有特定的转录模式 4.大部分基因都有功能基因的分离与克隆方法：1.根据基因的功能蛋白分离目的基因 2.根据mRNA特异性分离目的基因 3.根据DNA的插入作用分离目的基因 4.基因文库技术分离目的基因 5.图位克隆分离目的基因 6.酵母双杂交系统分离目的基因第三章 目的基因的获得一.根据基因的功能蛋白分离目的基因 （一）技术路线 （二）相关技术 （三）基因分离（一）技术路线 分离纯化功能蛋白蛋白质一级结构分析（AA序列测定） 制备抗体 根据AA序列合成寡核苷酸片断 筛选表达型基因文库 PCR引物 寡核苷酸探针PCR扩增DNA 或cDNA筛选基因文库DNA 或cDNA1蛋白的分离纯化及双相电泳一. 分离纯化的一般程序 样品的前处理： 从组织或细胞中把蛋白溶解出来（二）相关技术1.蛋白质分离纯化及双向电泳 2.蛋白质氨基酸序列分析粗分级分离：与杂蛋白分离开 细分级分离：进一步纯化方法 二. 蛋白分离纯化的方法分离纯化蛋白的依据 蛋白分子的大小 溶解度 电荷 吸附性质 对配体分子的生物学亲和力 透析 密度梯度离心 凝胶过滤 等电点沉淀 蛋白的盐溶和盐析 电泳 离子交换层析 吸附层析：羟磷灰石（吸附剂） • 凝集素亲和层析 亲和层析： 高压液相层析• 免疫亲和层析 • 金属亲和层析21.盐析与有机溶剂沉淀：盐析： 在蛋白溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋 白的胶体性质，使蛋白从溶液中沉淀析 出，称为盐析。

常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸 钠等。

盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效 果最好。

盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质 的变性。

分段盐析： 半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋 白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清 蛋白。

有机溶剂沉淀蛋白质：凡能与水以任意比例混合的有机溶剂， 如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀 蛋白质。

沉淀原理： ① 脱水作用； ② 使水的介电常数降低，蛋白质 溶解度降低。

透析袋 缓冲液2. 透析法3SDS-PAGE电泳槽3. 等电聚焦电泳（IEF）双向电泳The Principle of Isoelectric Focusing. A pH gradient is established in a gel before loading the sample. (A) The sample is loaded and voltage is applied. The proteins will migrate to their isoelectric pH, the location at which they have no net charge. (B) The proteins form bands that can be excised and used for further experimentation.IEF SDS-PAGE4第三章 目的基因的获得（二）相关技术1.蛋白质分离纯化及双向电泳 2.蛋白质氨基酸序列分析蛋白质氨基酸序列分析蛋白一级结构测定1953年英国剑桥大学Sanger F，首次报 道了牛胰岛素两条多肽链的aa序列。

胰岛素由A、B两条链组成， 链之间有2对二硫键， A链内有一对二硫键。

目前，数万种蛋白序列已被完成，并且 开始了蛋白组学研究。

蛋白序列测定的策略一、多肽链数目的测定 二、多肽链、或亚基的拆分 三、肽链氨基酸组分测定 四、多肽链的部分断裂和肽段的分离 五、肽段氨基酸顺序测定 六、肽段在多肽中次序的决定 七、二硫键位置确定1. N－末端分析二硝基氟苯( DNFB)法 丹磺酰氯（ DNS ）法 苯异硫氰酸酯（PITC）法 氨肽酶法：水解N－末端aa。

5氨肽酶法氨肽酶：是一种外肽酶，从-NH2末端逐 个切除氨基酸。

根据释放的AA种类和数量，按反应时间 和残基释放量作动力学曲线，可以得知 N-aa的种类。

氨肽酶Leu氨肽酶（LAP）：水解Leu末端最快。

Ala-A-B-C-D……——→Ala + A-B-CD…… 如果N-末端封闭，则无法测定。

如短 杆菌肽， N-末端与C-末端连接成 环， N-末端残基被封闭， N-末端封闭情况：焦谷氨酰化、或 乙酰化。

焦谷氨酸氨肽酶： 水解焦谷氨酰化的N末端残基。

2. C－末端分析化学法肼解法 还原法羧肽酶法缺点： Gln, Asn, Cys等被破坏，不容易测 出； C-末端Arg转变为鸟氨酸6还原法还原法：Sanger早期用来鉴定胰岛素 A、B链C－末端残基的方法。

原理：肽链C-末端aa被硼氢化锂还原成 相应的α－氨基醇。

肽链完全水解后，层 析鉴定代表C-末端氨基酸的α－氨基醇。

羧肽酶法羧肽酶法：最有效、最常用的方法。

羧肽酶：是一种外肽酶，从-COOH末端 逐个切除氨基酸，释放出游离aa。

羧肽酶羧肽酶有4种：A、B、C、Y A和 B：分别来自牛胰和猪胰。

A：能释放除Pro，Arg和Lys之外所 有的C－末端氨基酸残基； B：只能水解Arg和Lys碱性aa为末 端残基的肽键。

C：来自柑橘叶片。

Y：来自面包酵母。

能作用于任何一个C-末端aa氨基酸序列：－Val-Ser-GlyCOOH根据释放的AA种类和数量，按反应 时间和残基释放量作动力学曲线， 可以得知C-aa的种类。

7四、多肽链的部分断裂和肽段的分离Edman化学降解法只能连续降解几十个残 基；然而蛋白中却含有数百个残基，所以 上述分离提纯的蛋白要用专一性强的蛋白 水解酶或化学试剂进行有控制的裂解，形 成一些小的片段，分别进行序列分析。

1. 酶裂解法胰蛋白酶 糜蛋白酶 嗜热菌蛋白酶 胃蛋白酶 木瓜蛋白酶 葡萄球菌蛋白酶和梭菌蛋白酶五、肽段氨基酸顺序测定1、Edman化学降解法 2、酶解法 3、质谱法 4、根据核苷酸序列的推定法1、Edman化学降解法8第三步：转化反应Edman化学降解法： ——氨基酸序列自动分析仪原理： 多肽－aa－COOH + PITC PTH-AA + 少一个aa的多肽（268nm有吸收）层析鉴定 + 下一轮反应Edman降解法测定氨基酸序列异 硫 氰 酸 苯 酯9氨基酸自动测序仪蛋白交联在胶粒上 Edman降解 洗脱 鉴定DNS－Edman法是改进的Edman方法。

用DNS（丹磺酰氯）法测定肽链N-末端氨基 酸，灵敏度提高100倍；用Edman法提供逐 次减少一个残基的肽链样品。

另外，为了提高检出被释放残基（PTHAA）的灵敏度，用荧光基团或有色基团标记 PITC试剂，灵敏度更高。

利用Edman降解，一次能连续测出60～70aa 残基的序列，一般最多不超过100个。

2、酶解法氨肽酶：从多肽的N－末端向内切 羧肽酶：从多肽的C－末端向内切 方法局限性大。

3、质谱法 4、根据核苷酸序列的推定法10六、肽段在多肽中次序的决定如果肽链只断裂成两段或三段，那么，根 据每段N端、或C-端aa的种类和序列，即 可排出它的在原多肽链中的顺序。

如果断裂成多条，即不能排序。

必须有两 种以上的方法断裂多肽，做成两套或几套 肽段。

这两套或几套肽段的切口彼此是错 位的。

氨基酸序列 分析例子一.根据基因的功能蛋白分离目的基因（三）基因分离具有不同密码子的氨基酸密码数 氨基酸Met Trp Phe Tyr His Gln Asn Lys Asp Glu Cys Ile Val Pro Thy Ala Gly Leu Ser Arg 1 2 3 4 51.根据氨基酸序列设计简并性PCR引物或寡聚核苷酸探针 2. PCR扩增、克隆基因 模板DNA cDNA 总RNA RT3.筛选基因文库 （C库 G库） 4.免疫学法筛选表达文库 a，制备抗体 b，构建表达文库 c，筛选11简并寡核苷酸探针库氨基酸序列： Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys一.根据基因的功能蛋白分离目的基因（三）基因分离A GTT 寡核苷酸探针库： C GT AACT TTCT A A TAC GCT TGG AAG G C1.根据氨基酸序列设计简并性PCR引物或寡聚核苷酸探针 2. PCR扩增、克隆基因 模板DNA cDNA 总RNA RT3.筛选基因文库 （C库 G库）17核苷酸探针库（方框内，含32种序列）（2x2x2x4x1=32)4.免疫学法筛选表达文库a，制备抗体 b，构建表达文库 c，筛选利用抗体 筛选表达 文库（a）把原初平板 上生长的嗜菌斑及 其产生的融合蛋白 质原位复印转移到 硝酸纤维素滤膜 上；（b）滤膜与 第一抗体溶液一道 温浴，漂洗后加放 射性标记的第二抗 体继续温浴； （c）放射自显影12第三章 目的基因的获得三.根据mRNA的特异性分离目的基因 （一）mRNA differential display PCR (DDRT PCR)13。