4 核酸操作的技术
新冠核酸检测原理和方法
新冠核酸检测原理和方法
新冠病毒核酸检测是目前常用的诊断方法之一，通过检测人体样本中的病毒核酸来确认感染情况。
这种检测方法的原理基于核酸的特异性反应。
核酸检测的基本步骤是：收集样本、提取病毒核酸、核酸逆转录（如果是RNA病毒）、扩增特定基因片段、检测扩增产物。
首先，医务人员会采集患者咽拭子、鼻拭子、唾液、血液等样本，并将其置于含有保护剂的管子中，以防止病毒核酸的降解。
其次，对样本进行核酸提取，目的是分离病毒核酸以便后续检测。
核酸提取的方法主要有有机物法和离心柱法两种。
有机物法通过酚/氯仿提取样本中的核酸，离心柱法则利用特制柱子
中的膜，通过离心操作将核酸捕获至膜上。
对于RNA病毒（如新冠病毒），还需要进行核酸逆转录。
逆
转录酶可以将RNA模板逆向转录为相应的DNA，这样可以将RNA转化为DNA，便于后续操作。
接下来，利用聚合酶链反应（PCR）技术扩增病毒核酸中的特定基因片段。
PCR是一种体外扩增技术，其基本原理是利用DNA聚合酶在特定反应条件下，通过多次循环反复复制靶序列。
这种扩增使得原本只含有少量病毒核酸的样本中的目标序列扩增至可以被检测的程度。
最后，对PCR扩增产物进行检测。
目前常用的检测方法有荧
光定量PCR（qPCR）、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和基因测序等。
这些方法都能够通过检测病毒核酸的特定序列来确认感染情况。
总结起来，新冠病毒核酸检测通过核酸提取、逆转录、PCR 扩增和检测等步骤来确认感染情况。
这种方法具有高灵敏度和特异性，因此被广泛应用于疫情防控和个体诊断。
《基因工程B》复习提纲2020
第一章基因工程概述一、名词解释基因、基因操作、基因工程、重组DNA技术二、思考题1、简述基因工程操作的基本步骤。
2、简述基因工程操作的理论依据。
3、简述基因工程诞生理论上的三大发现和技术上的三大发明。
第二章基因工程的工具酶一、名词解释限制性内切酶、同裂酶、同尾酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶二、思考题1、简述限制性内切酶命名的基本原则。
2、影响限制性内切酶活性的因素主要有哪些？3、影响连接反应效率的因素主要有哪些？4、大肠杆菌DNA聚合酶有哪些活性？分别简要说明其主要用途。
5、简述切口平移法标记DNA的原理。
答：首先，在Mg2+存在下利用低限量的DNase I处理双链DNA，随机产生少量切口；然后，利用大肠杆菌DNA聚合酶I的5'→3'外切酶活性在切口处向3'端平移去除核苷酸，同时，其5'→3'聚合酶活性则将切口作为引物沿5'→3'方向催化DNA合成；随着反应的进行，5'端核苷酸不断去除，3'端核苷酸不断掺入，导致切口沿着DNA合成方向移动，即切口平移。
如果在反应体系中加入标记dNTP，则这些标记dNTP将取代原有的核苷酸残基，产生带标记的DNA分子。
6、简述交换（置换）法标记DNA的原理。
答：反应体系中只有一种标记的dNTP存在时，可利用大肠杆菌DNA聚合酶I或T4/T7 DNA 聚合酶的3’→5’外切酶活性从3’端降解DNA，当露出与该标记dNTP互补的碱基时，上述酶的5'→3'聚合酶活性则催化该位置发生合成反应，用标记的dNTP置换原来的核苷酸残基，产生3’端标记的DNA。
第三章基因工程的载体一、名词解释载体、质粒、噬菌体、噬菌体溶菌周期、噬菌体溶原周期、克隆载体、表达载体、穿梭载体、整合载体、表达标签二、思考题1、简述克隆载体具备的基本条件。
2、以大肠杆菌为例，解释利用α互补筛选重组质粒的原理。
核酸杂交的基本原理
核酸杂交的基本原理核酸杂交是分子生物学中常用的一种实验技术，它通过互补配对的原理，可以检测、分离和定量DNA或RNA分子。
核酸杂交技术的基本原理是利用互补配对的性质，使两条核酸链在一定条件下结合形成双链分子，从而实现对特定核酸序列的检测和分析。
在核酸杂交实验中，通常会使用探针和靶序列两种核酸分子。
探针是一段已知序列的标记核酸，可以是DNA或RNA，它的序列与待检测的靶序列互补。
靶序列则是待检测的未知核酸序列。
通过将探针与待检测的核酸样品混合反应，利用互补配对的原理，探针会与靶序列结合形成双链分子。
通过检测探针标记的信号，就可以确定样品中是否含有特定的核酸序列。
核酸杂交的基本原理可以用来进行多种实验，包括Southern blotting、Northern blotting、原位杂交等。
其中Southern blotting是用来检测DNA序列的技术，Northern blotting则是用来检测RNA序列的技术，而原位杂交则可以在细胞或组织中直接检测特定的核酸序列的位置和表达水平。
在核酸杂交实验中，一些重要的因素会影响杂交反应的效果。
首先，温度是一个关键因素，通常在适宜的温度下可以使探针和靶序列充分杂交。
其次，盐的浓度也会影响杂交反应的效果，适当的盐浓度可以提高杂交的特异性和灵敏度。
此外，杂交时间和探针的浓度也会对实验结果产生影响，需要根据具体的实验目的进行优化。
总的来说，核酸杂交技术是一种重要的分子生物学实验技术，它利用核酸分子的互补配对原理，可以实现对特定核酸序列的检测和分析。
在实验设计和操作过程中，需要注意各种因素对杂交反应的影响，以确保实验结果的准确性和可靠性。
通过对核酸杂交技术的理解和应用，可以更好地开展分子生物学研究和临床诊断工作。
2核酸操作技术-DNA提取
优点：较好除去DNA和蛋白质，且获得生物活性的RNA。
RNA提取原理及方法
原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于
水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在0.14mol/L氯化钠盐 溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（RNP）则在0.14mol/L氯 化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开。
思考
1.结合原理 ，简述CTAB法分离 提取植物总DNA的基本过程。 2.为了获得高质量的植物总DNA， 在分离提取过程中应注意那 些问题？
2、动物基因组DNA、总RNA提取
理论基础
核酸是遗传信息的携带者，是生命的最基本物质，它和 蛋白质是构成生物体的主要成分； 按化学组成可以将核酸分成两大类：
的分子，以超螺旋形式存在。
细菌内的共生型遗传因子。
其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转
录依赖于宿主编码的蛋白和酶。
• 碱法提取主要是利用共价、闭合、环状质粒DNA与
线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在碱 性PH下DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能
准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以
0.7 0.9
1～20
0.8～10 0.5～7
1.2
1.5 12.0
0.9～6
0.2～3 0.1～2
仪器和试剂
仪器
– 电泳仪 – 电泳槽 – 灌胶模具等
常用电泳缓冲液
–Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE）
上样缓冲液
电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰 色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上 样缓冲液。
加氯化钠至1mol/L，搅拌10min
常用核酸提取技术介绍
常用核酸提取技术介绍核酸提取是从细胞或组织中分离纯化核酸的过程。
核酸提取技术广泛应用于生命科学研究中，例如基因测序、PCR扩增、基因克隆、基因组学研究等。
下面将介绍几种常用的核酸提取技术。
1.酚-氯仿法酚-氯仿法是一种经典的核酸提取方法。
该方法主要包括细胞破碎、蛋白质消化和核酸沉淀三个步骤。
首先，细胞经过机械强化破碎，释放出核酸。
接着，通过酚的提取使蛋白质溶解，然后利用氯仿分离出水相中的核酸沉淀。
最后，通过酒精沉淀获得纯化的核酸。
优点是操作简单，适用于各种样品类型。
缺点是提取的核酸可能含有蛋白质、多糖等杂质，纯度较低。
2.磁珠法磁珠法是一种高效的核酸提取方法。
该方法利用特定的磁性珠子将核酸选择性地吸附，然后通过磁力将珠子与非目标杂质分离。
该方法相对于传统的酚-氯仿法具有许多优点，包括提取纯度高、自动化程度高、适用于大规模样品处理等。
磁珠法特别适用于高通量的核酸提取和高通量测序等需求。
3.硅胶柱法硅胶柱法是一种常用的核酸提取方法。
该方法利用硅胶膜的亲和性，将核酸吸附到硅胶膜上，然后通过洗涤和洗脱步骤来纯化核酸。
硅胶柱法适用于从小规模样品中提取纯度较高的核酸，例如从血液、组织和细菌培养物中提取DNA。
硅胶柱法提取的核酸能够进行各种分子生物学和分子诊断应用。
4.针对特定样品的提取方法不同类型的样品可能具有不同的特性和组分，因此需要针对特定样品开发相应的核酸提取方法。
例如，提取环境样品中的核酸可能需要经过过滤、浓缩、去除抑制物等步骤。
提取血液样品中的核酸可能需要应用抗凝剂来避免核酸降解。
提取植物样品中的核酸可能需要使用纤维素酶来消化细胞壁。
因此，在选择和设计核酸提取方法时，应该考虑到样品的特点和需求。
总之，核酸提取是生命科学中基础而重要的步骤，良好的核酸提取方法可以确保提取纯度高、完整的核酸样品，为后续的基因分析提供可靠的基础。
不同的核酸提取方法各有优缺点，根据实验需求和样品特点选择合适的方法是至关重要的。
检测核酸的方法
检测核酸的方法
核酸检测是一种常见的生物学检测方法，它可以用来检测DNA 或RNA的存在和数量。
在医学、科研和法医领域，核酸检测被广泛应用于疾病诊断、基因分析、病毒检测等方面。
本文将介绍几种常见的核酸检测方法，包括PCR法、原位杂交法和基因芯片法。
首先，PCR法是一种常用的核酸检测方法。
它利用DNA聚合酶酶链反应（PCR）技术，通过不断复制DNA片段来扩增目标DNA的数量，从而实现对目标DNA的检测。
PCR法具有高灵敏度、高特异性和高效率的特点，因此在病毒检测、基因突变分析等方面得到了广泛应用。
其次，原位杂交法是另一种常见的核酸检测方法。
它通过将标记有荧光或放射性同位素的DNA或RNA探针与待检测样品中的靶标DNA或RNA结合，然后利用显微镜或放射自显影等技术来检测目标核酸的存在和位置。
原位杂交法适用于细胞遗传学研究、病毒感染检测等领域。
最后，基因芯片法是一种高通量的核酸检测方法。
它利用微阵列芯片上固定的数千至数百万个核酸探针，可以同时对样品中的大
量核酸进行检测和分析。
基因芯片法在基因表达分析、基因型鉴定、病毒检测等领域具有广泛的应用前景。
综上所述，核酸检测是一项重要的生物学检测技术，在医学、
科研和法医领域都有着广泛的应用。
不同的核酸检测方法各有特点，选择合适的方法取决于具体的检测需求和实验条件。
希望本文介绍
的几种核酸检测方法能够为相关领域的研究人员和实验人员提供参考，促进科学研究和临床诊断的发展。
做核酸采样的操作方法
做核酸采样的操作方法核酸采样是一种重要的实验操作，用于提取和分离细胞中的核酸，如DNA和RNA。
这项技术在分子生物学、遗传学、疾病诊断和基因工程等领域具有广泛的应用。
以下是一份详细的核酸采样操作方法，包括材料准备、样品处理、核酸提取和存储等环节。
1. 材料准备为了进行核酸采样，需要准备以下材料和试剂：- 目标样品（如细胞、组织、血液、唾液等）- 液氮或干冰- 细胞裂解缓冲液（如Tris-HCl缓冲液）- 蛋白酶解液（如Proteinase K）- 膜破碎剂（如SDS或Tween-20）- 蛋白沉淀剂（如酒精或异丙醇）- RNase A或DNase I- 甲醇或异丙醇- 离心管- 显微注射针或负压管道- 离心机- 离心管架2. 样品处理首先，检查并确认目标样品的数量和质量。
样品应保持新鲜并避免冻融循环。
如果样品是固体的，如组织样品，则需要使用液氮或干冰将其快速冷冻并保存在低温下。
如果样品是液体的，如血液或其他体液，则可以直接使用。
3. 核酸提取(1) 细胞破碎：将细胞样品加入细胞裂解缓冲液中，并根据样品的数量适当调整缓冲液的体积。
将样品在低温下快速破碎，可以使用显微注射针或负压管道将细胞样品反复吸入和喷出来实现破碎。
(2) 蛋白酶解：将Proteinase K加入细胞裂解液中，并根据样品的数量和体积进行适当调整。
将样品在室温下孵育一定时间，以实现蛋白酶解的目的。
(3) 膜破碎：加入适量的膜破碎剂（如SDS或Tween-20），均匀混合。
让样品在室温下孵育一定时间，将细胞膜彻底破裂。
(4) 蛋白沉淀：加入蛋白沉淀剂（如酒精或异丙醇），并轻轻倒置离心管混合，以促使蛋白质沉淀。
然后，采用离心的方式将蛋白沉淀下来。
(5) 脱色：使用甲醇或异丙醇洗涤蛋白沉淀，除去残余的蛋白质。
将离心管轻轻颠倒几次，然后离心沉淀。
(6) 水洗：用无菌去离子水洗涤沉淀，以去除酒精残留。
(7) 干燥：将离心管破碎后，使样品充分暴露于空气中，待其干燥。
核酸检测探针法
核酸检测探针法
核酸检测探针法是一种分子生物学技术，用于检测DNA或RNA序列中的特定序列。
该技术基于DNA或RNA序列的互补配对原理，通过引入特定的探针来检测目标序列。
探针通常由一条能够与目标序列互补配对的寡核苷酸链和一种荧光素或荧光染料组成。
当探针与目标序列配对时，荧光素或荧光染料会被激发并发出荧光信号，从而表明目标序列存在。
核酸检测探针法被广泛应用于疾病诊断、基因表达分析和病原体检测等领域。
例如，在新型冠状病毒疫情期间，核酸检测探针法被用于检测病毒的存在，以便进行疫情监测和诊断。
与传统的检测方法相比，核酸检测探针法具有灵敏度高、特异性强、操作简便、快速和自动化等优点。
然而，该技术也存在一些局限性，如需要特定的设备和试剂、样本处理要求高和可能存在假阳性或假阴性结果等。
因此，在使用该技术时需要结合具体的实验设计和严格的质量控制措施，以确保结果的准确性和可靠性。
- 1 -。
核酸提取方法的技术要点和注意事项
核酸提取方法的技术要点和注意事项1.样品的采集和保存：样品的质量将直接影响到核酸提取的结果。
在采集样品之前，需要有一定的准备工作，例如清洁工作台，检查工具和试剂的应急备份等。
样品可以是从血液、组织、细胞培养物和体液中获得的。
样品应马上放入合适的保存液中，以防核酸降解。
2.细胞破碎：在获得样品后，必须破坏细胞膜以释放核酸。
常用的方法包括机械破碎、化学破碎和酶破碎。
机械破碎通常使用超声波或螺旋破碎器，以激烈的震荡和磨擦力来破坏细胞膜。
化学破碎一般使用溶解细胞膜的缓冲液，如洗涤液或裂解酶。
酶破碎利用特定的酶来降解细胞膜或核膜。
3.去除蛋白质和其他杂质：核酸提取过程中，需要去除细胞残渣、蛋白质和其他杂质，以纯化核酸。
这可以通过加入蛋白酶和盐溶液、醇沉淀或利用柱层析方法来实现。
蛋白质酶可以降解细胞蛋白，使其不会干扰核酸的提取。
盐溶液可以用来沉淀核酸和去除蛋白质，高盐浓度可以使核酸结合在核酸龄处沉淀下来。
醇沉淀则是利用醇和低温来提取核酸，除去杂质。
柱层析方法则是利用不同材料具有不同的亲和性和尺寸选择性来分离纯化核酸。
4.纯化核酸：纯化核酸的目的是去除杂质，提高核酸的纯度。
常用的纯化方法包括酚-氯仿提取、硅胶柱层析和离心柱层析。
酚-氯仿提取方法主要适用于大量核酸的提取，酚可以去除蛋白质，氯仿可以除去可能会干扰PCR反应的污染物。
硅胶柱层析可以在较短的时间内实现核酸的快速纯化，其原理是利用核酸在硅胶膜上的特异性结合来分离纯化核酸。
离心柱层析也是一种常用的方法，它可以根据核酸分子大小和其他特征来实现核酸的分离。
5.储存核酸：在核酸提取完成后，需要储存核酸以备后续实验使用。
常见的储存方法是在低温下（通常为-20°C或更低的温度）储存核酸，可以延长其保存时间。
此外，核酸也可以在冻干的形式下储存，在干燥条件下长期保存。
要注意的事项如下：1.严格控制样品的污染问题，使用无菌器具和试剂，并在一定范围内进行无菌操作，以防止核酸的污染和降解。
分子生物学第九章 分子生物学研究方法电子教案
第九章分子生物学研究方法1．课程教学内容(1)核酸技术1—基本操作(2)核酸技术2—克隆技术(3)核酸技术3—测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2．课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3．课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。
本章内容•核酸的凝胶电泳•DNA分子的酶切割•核酸的分子杂交•基因扩增•基因的克隆和表达•细菌的转化•DNA核苷酸序列分析•蛋白质的分离与纯化•研究DNA与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。
电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。
由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。
从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。
分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。
Gel matrix (胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose (琼脂糖):(1) a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭)Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differfrom each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a fewhundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are orientedorthogonally (直角地) to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as wellas to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up toseveral Mb in length.二、DNA分子的酶切割Restriction endonucleases (限制性内切酶) cleave DNA molecules at particular sitesRestriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRIThe random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46)(1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端).(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
核酸提取的原理
核酸提取的原理核酸提取是分子生物学中常用的实验技术，用于从生物样品中提取纯化核酸（DNA或RNA）。
核酸提取的原理基于核酸的特性和细胞结构，通过一系列化学和物理方法将核酸从细胞中释放出来，并去除其他干扰性物质，最终得到纯净的核酸样品。
核酸提取的过程可以分为以下几个关键步骤：1. 细胞破碎：首先，需要破碎细胞膜和细胞壁，释放细胞内的核酸。
这可以通过机械方法（如研磨或超声波处理）或化学方法（如细胞溶解液或蛋白酶处理）来实现。
破碎细胞的目的是释放核酸，并使其可被后续步骤处理。
2. 蛋白质消化：细胞破碎后，通常还会存在大量的蛋白质。
这些蛋白质会干扰核酸的纯化和分析，因此需要进行蛋白质消化。
常用的方法是加入蛋白酶，将蛋白质降解为小片段。
消化后的蛋白质可以通过离心等方法去除。
3. RNA酶消化：如果需要提取的是DNA而非RNA，则需要加入RNA 酶来降解RNA。
RNA酶是一种能够特异性降解RNA而不对DNA产生影响的酶。
通过这一步骤，可以去除样品中的RNA，使得提取得到的核酸更纯净。
4. 脱色：核酸在细胞中常常与其他物质如蛋白质和多糖结合在一起，形成复合物。
为了去除这些附着物，需要进行脱色步骤。
脱色通常使用一些试剂，如酚-氯仿或氯仿-异丙醇等，通过分相的原理将核酸从其他物质中分离出来。
5. 沉淀：提取纯化后的核酸需要进行沉淀，以得到更浓缩的样品。
常用的沉淀方法是加入盐和酒精，在低温下沉淀核酸。
通过离心，核酸可以沉淀到管底，其他杂质则在上层液体中。
6. 洗涤：提取得到的核酸样品还可能存在着一些残留的盐和杂质，需要进行洗涤以去除这些物质。
洗涤一般使用酒精或乙醚等溶剂，将核酸沉淀物溶解后，再重新沉淀，以去除残留杂质。
7. 溶解：最后一步是将核酸沉淀物溶解于合适的缓冲液中，使其可以用于后续的实验操作。
常用的溶解液包括TE缓冲液和水。
通过以上步骤，核酸提取的过程就完成了。
最终得到的核酸样品可以用于许多分子生物学实验，如PCR、基因测序、基因克隆等。
核酸生物化学实验技术实验
核酸生物化学实验步骤（一）酵母中RNA的提取及紫外分光光度法测定核酸浓度1．稀碱法提取酵母中RNA实验原理：基于核酸不溶于乙醇。
先用稀碱将酵母细胞裂解，采用酸中和，通过离心去除菌体细胞的大碎片，采用乙醇可将上清液中的RNA沉淀出来。
该方法提取的核酸分子为变性失活的RNA。
操作方法：（1）称取2 g干酵母粉，放入100 mL烧杯中，加入20 mL 的1%氢氧化钠水溶液，搅拌30 min （玻璃棒手动充分搅拌）。
（2）30 min后，向（1）中加入少量乙酸调节pH至中性（切忌调节pH低于3，RNA的等电点2-2.5），试纸检查。
（3）将（2）全部转移至离心管中，3800 rpm离心10 min（最大装液量离心管体积的三分之二，等分两个离心管进行离心）。
弃沉淀（主要是细胞壁等碎片），留上清（含有RNA）。
（4）将上清液转移至干净的100 mL烧杯中，加入15 mL 95%的乙醇，充分混匀，静置10 min。
（此时，大部分RNA沉积于烧杯底部，转移时需要搅动，以免丢失RNA。
因此该步骤也可将上清液直接转移到离心管，静置10 min是必要的）（5）将（4）转移至离心管，3800 rpm离心5 min（一次离心管装不下，分两次离心），弃掉上清液，用95%乙醇重悬，离心洗涤2次，每次95%乙醇用量5 mL。
（6）将洗涤后的样品转移至干净的表面皿（已称重）上，95℃水浴蒸汽干燥（约10 min左右），称重计算干酵母中RNA含量。
干酵母中RNA含量(%)=提取的RNA重量（g）干酵母重量（g）×100%2．紫外吸收法测定提取RNA干粉中核酸含量实验原理：核酸分子在260 nm处具有特异性吸收峰试验方法：（1）称取实验1中提取的RNA干粉20 mg，加入少量0.5 mol/L的氢氧化钠水溶液溶解，然后加入去离子水，用50 mL容量瓶定容，（2）以去离子水做空白，测260 nm处的吸光度（A），计算提取的RNA干粉中核酸含量。
新冠肺炎核酸检测采样操作规范与技术分享
新冠肺炎核酸检测采样操作规范与技术分享随着新冠肺炎疫情常态化，疫情防控措施的不断更新，现依据《新型冠状病毒肺炎防控方案（第八版）》要求，采集的临床标本包括上呼吸道标本（如鼻咽拭子、咽拭子等）、下呼吸道标本（如深咳痰液、肺泡灌洗液、支气管灌洗液、呼吸道吸取物等）、粪便/肛拭子标本、尿液、抗凝血和血清标本等。
尽管下呼吸道样本检测阳性率更高一些，但实际被采集对象大多是没有痰液可以咳出的，更不可能去冒风险开展费时费力的肺泡灌洗等操作。
因此，上呼吸道样本采集便成了是首选。
一、新冠肺炎核酸采集具体标本种类有以下八个分类：1.上呼吸道标本：包括鼻咽拭子、口咽拭子等。
2.下呼吸道标本：深咳痰液、肺泡灌洗液、支气管灌洗液、呼吸道吸取物等。
3.便标本/肛拭子：留取粪便标本约10克（花生大小），如果不便于留取便标本，可采集肛拭子。
4.血液标本：尽量釆集发病后7天内的急性期抗凝血，采集量5ml，建议使用含有EDTA抗凝剂的真空釆血管采集血液。
5.血清标本：尽量釆集急性期、恢复期双份血清。
血清标本主要用于抗体的测定，不进行核酸检测。
6.尿标本：留取中段晨尿，采集量2～3ml。
7.物体表面标本：包括进口冷链食品或进口货物的内外包装表面，以及运输储藏工具等可能被污染的部位进行涂抹采集的标本。
8.污水标本：根据海运口岸大型进口冷冻物品加工处理场所排水系统分布情况，重点选取污水排水口、内部管网汇集处、污水流向的下游或与市政管网的连接处等2-3处点位进行采样。
二、根据县疾病预防控制中心具体新冠病毒样本采集情况来看，主要与上呼吸道标本的鼻咽拭子、口咽拭子和物体表面标本以及污水标本为主。
在这几个标本采集过程中经常会遇到的问题有以下几点：1.鼻咽拭子：鼻咽拭子采样时，①容易出现的错误有两处。
一个是角度问题，一个是误把鼻甲肿胀当成鼻咽部。
②采样时被采者头部不断后退，不能进行采集。
2.咽拭子：采集咽拭子时经常看不到咽后壁，主要原因是舌头会挡住视线。
新冠核酸检测护士操作规程
新冠核酸检测护士操作规程新冠核酸检测是新型冠状病毒检测的一种方法，对于疫情监测和防控具有重要意义。
作为进行核酸检测的护士，需要严格按照操作规程执行工作，确保样本的准确性和安全性。
以下是新冠核酸检测护士的操作规程：1. 个人防护：- 护理人员应佩戴符合标准的个人防护装备，包括帽子、口罩、防护眼镜、手套和防护服。
在操作过程中，要注意经常更换口罩和手套，避免交叉感染。
- 洗手是最基本的个人防护措施，护理人员应在操作前和操作后进行彻底的手卫生。
2. 样本采集：- 确保操作区域的洁净和无菌，使用无菌手套进行操作。
- 根据要求，采取采用咽拭子还是鼻拭子的方法进行样本采集。
- 在采集过程中，要保持温和和耐心，避免刺激患者。
3. 样本处理：- 在采集后，将样本放入无菌的容器中，并添加保存液。
确保样本完整并且不污染。
- 将样本保存在低温环境中，避免样本的变质和受污染。
4. 实验室操作：- 在进行实验室操作前，护理人员应根据操作规程对操作区域进行清洁和消毒。
- 样本的实验室操作主要包括核酸提取、逆转录和PCR扩增等步骤。
在操作过程中，要遵循实验室的标准操作程序和无菌操作要求。
5. 结果判读和报告：- 对于检测结果的判读，护理人员必须具备丰富的专业知识和经验，并严格按照标准判读结果。
- 在报告结果时，要准确填写相关信息，确保报告的准确性和完整性。
6. 废物处理：- 废弃物的处理是防止交叉感染和污染的重要环节。
护理人员应将使用过的设备、容器和其他废弃物分别收集，并进行正确的分类、消毒和处置。
7. 设备和仪器的维护：- 护理人员应按照要求对使用过的设备和仪器进行清洁、消毒和维护，确保设备的正常运转和准确性。
8. 参加培训：- 护理人员应接受相关培训，熟悉操作规程和相关知识。
定期参加专业培训，提升技能和知识水平。
以上是新冠核酸检测护士的操作规程，护理人员需认真执行并加强个人防护，确保操作的安全性和准确性。
同时，要严格遵守相关法律法规和纪律要求，保护患者和自身的权益。
核酸检测抗原使用方法
核酸检测抗原使用方法
一、采集样本
在进行核酸检测抗原检测前，需要先采集样本。
通常采集鼻咽拭子或口咽拭子，使用一次性拭子在鼻腔或口腔内轻轻旋转擦拭数次，收集粘膜细胞样本。
注意采集时应避免过度擦拭，以免损伤粘膜。
二、样本处理
采集的样本需要进行适当的处理，以释放并提取样本中的病毒核酸。
将采集的样本放入含有细胞保存液的收集管中，充分摇匀后进行离心，以分离出上清液和沉淀物。
将上清液转移至新的收集管中，备用。
三、结果观察
将处理后的样本加入核酸检测试剂盒中，按照说明书要求进行操作。
观察反应结果，通常在15-30分钟内读取结果。
若C和T区域出现两条色带，则为阳性结果，表示样本中存在病毒核酸。
若只有C区域出现一条色带，则为阴性结果，表示样本中未检测到病毒核酸。
若未出现色带或色带模糊不清，则表示检测结果无效，需重新进行检测。
四、垃圾处理
使用完的拭子、废物收集瓶等样本采集工具和已开封或使用后的核酸检测试剂，需按照感染性医疗废物进行处置。
处置时应佩戴一次性手套和口罩，并按照相关规定做好垃圾分类处理工作。
养老院新冠病毒核酸检测实验室操作规范(2023)
养老院新冠病毒核酸检测实验室操作规范
(2023)
1. 前言
此实验室操作规范适用于养老院新冠病毒核酸检测实验室，旨在规范实验人员操作行为，确保检测结果准确可靠。
2. 实验室环境
实验室应位于相对独立的空间，具备良好通风条件和完善的排风设施。
实验室内应保持清洁卫生，实验员应穿戴完整的个人防护装备。
3. 样本采集标准
1. 所采集样本应符合国家和相关部门颁布的标准和技术规范；
2. 采集样本时，实验人员应该正确佩戴个人防护装备，并按要求落实检测过程中各项防护措施；
3. 采集前应确认患者的相关信息，如姓名、身份证号等，并正确标注样本编号与信息，避免错误。
4. 样本预处理
1. 样本离心时，应按要求标注离心管编号，严格执行离心时间和力度；
2. 样本稀释时，应注意加入稀释液的体积和比例，严格按照标准操作。
5. 核酸检测
1. 核酸检测方法应遵循国家和省市制定的检测技术标准和评估方法；
2. 核酸检测仪器应定期检测校准和质量控制，确保检测结果的准确性和可靠性；
3. 核酸检测结果应及时记录，检测人员应对结果进行判读，如有疑问须向主管领导或专家组咨询；
4. 核酸检测结束后，实验室应及时清洁消毒并妥善处理检测废弃物，避免交叉污染。
6. 结束语
实验室人员应严格执行此操作规范，确保检测准确、结果可靠，保障患者就医和安全，也保护自己的健康与安全。
核酸pcr操作流程
核酸pcr操作流程
核酸PCR（聚合酶链式反应）是一种用于扩增DNA片段的技朧，广泛应用于分子生物学、医学诊断、法医学等领域。
下面将介绍核
酸PCR的操作流程。
首先，准备PCR反应体系。
通常包括DNA模板、引物（primer）、dNTPs（四种脱氧核苷酸）、聚合酶、缓冲液和水。
DNA模板是待扩
增的DNA片段，引物是用于引导DNA合成的短链DNA片段，dNTPs
提供DNA合成所需的四种碱基，聚合酶是催化DNA合成的酶，缓冲
液用于维持反应的pH值。
其次，进行PCR反应。
将PCR反应体系加入PCR管中，放入
PCR仪中进行反应。
PCR反应通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，将反应体系加热至94-98摄氏度，使DNA双链解旋
成两条单链。
在退火步骤中，将反应体系降温至50-65摄氏度，引
物与DNA模板结合。
在延伸步骤中，将反应体系加热至72摄氏度，聚合酶在引物的引导下合成新的DNA链。
最后，进行PCR产物的分析。
PCR反应结束后，可以通过凝胶
电泳、实时荧光定量PCR等方法对PCR产物进行分析。
凝胶电泳可
以将PCR产物按照大小分离成不同的条带，从而确定PCR反应是否
成功。
实时荧光定量PCR可以实时监测PCR反应的进程，得到更加
准确的结果。
总的来说，核酸PCR是一种快速、灵敏、特异的DNA扩增技术，广泛应用于科研和临床实验中。
熟练掌握核酸PCR的操作流程对于
科研人员和临床医生来说至关重要，可以帮助他们更好地进行实验
和诊断工作。
基因工程试题(8)
1、下列有关基因的叙述，错误的是【 A 】A 蛋白质是基因表达的唯一产物B 基因是 DNA 链上具有编码功能的片段C 基因也可以是 RNAD 基因突变不一定导致其表达产物改变结构2、基因工程的单元操作顺序是【 B 】A 增，转，检，切，接B 切，接，转，增，检C 接，转，增，检，切D 切，接，增，转，检3、生物工程的上游技术是【 A 】A 基因工程及分离工程B 基因工程及发酵工程C 基因工程及酶工程D 基因工程及细胞工程4、下列各组专业术语中，含义最为接近的是【 C 】A 终止子与终止密码子B 基因表达与基因转译C DNA 退火与 DNA 复性D 重组子与转化子5、根据酶切活性对盐浓度的要求，限制性核酸内切酶可分成【 B 】A 2 大类B 3 大类C 4 大类D 5 大类6、T 4 -DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是【 D 】A 2' -OH 和 5' – PB 2' -OH 和 3' -PC 3' -OH 和 2' – PD 5' -OH 和 3' -P7、下列有关连接反应的叙述，错误的是【 A 】A 连接反应的最佳温度为37 ℃B 连接反应缓冲体系的甘油浓度应低于 10%C 连接反应缓冲体系的 ATP 浓度不能高于 1mMD 连接酶通常应过量 2-5 倍8、原生质体转化方法不大适用于【 A 】A 大肠杆菌B 枯草杆菌C 酵母菌D 链霉菌9、下列各常用载体的装载量排列顺序，正确的是【 A 】A Cosmid >λ-DNA > PlasmidB λ -DNA > Cosmid > PlasmidC Plasmid >λ -DNA > CosmidD Cosmid > Plasmid > λ-DNA10、若某质粒带有 lacZ 标记基因，那么与之相匹配的筛选方法是在筛选培养基中加入【 D 】A 半乳糖B 异丙基巯基 - β - 半乳糖苷( IPTG )C 蔗糖D 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚基 - β -D- 半乳糖苷( X-gal )11、下列各组用于外源基因表达的受体细胞及其特点的对应关系中，错误的是【 C 】A 大肠杆菌－繁殖迅速B 枯草杆菌－分泌机制健全C 链霉菌－遗传稳定D 酵母菌－表达产物具有真核性12、分子杂交的化学原理是形成【 D 】A 共价键B 离子键C 疏水键D 氢键13、某一重组 DNA ( 6.2 kb ) 的载体部分有两个 SmaI 酶切位点。
核酸专业知识面试
核酸专业知识面试1. 引言核酸是生物体中重要的生物大分子之一，对于核酸专业的学生来说，对核酸的了解和掌握是至关重要的。
在核酸专业的求职面试中，考官通常会提问涉及核酸领域的基础知识和应用技术。
本文将介绍一些常见的核酸专业知识面试题，并提供参考答案，帮助核酸专业学生更好地准备面试。
2. 基础知识2.1. 什么是核酸？核酸是由核苷酸组成的生物大分子，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。
DNA负责遗传信息的存储和传递，RNA参与蛋白质的合成过程。
2.2. DNA和RNA的结构有何区别？DNA和RNA都由核苷酸组成，但其结构上有一些差异。
DNA的糖是脱氧核糖，而RNA的糖是核糖。
此外，DNA中的碱基有腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶四种，而RNA中的碱基则没有胸腺嘧啶，而是含有尿嘧啶。
2.3. DNA的双螺旋结构是如何形成的？DNA的双螺旋结构是由两条互补的DNA链通过碱基间的氢键相互结合形成的。
其中，腺嘌呤与胸腺嘧啶之间有两个氢键，鸟嘌呤与胞嘧啶之间有三个氢键。
这种特殊的碱基配对方式使得DNA的两条链呈现出稳定的双螺旋结构。
2.4. DNA复制的过程是怎样的？DNA复制是指在细胞分裂过程中，DNA分子能够通过特定的机制产生两条完全相同的新DNA分子。
复制过程包括解旋、合成和连接三个主要步骤。
首先，DNA双螺旋结构被酶解开，形成两条单链。
然后，DNA聚合酶将新的核苷酸与模板链上的互补碱基配对，并形成新的DNA链。
最后，两条新的DNA链通过连接酶连接在一起，形成两个完全相同的DNA分子。
3. 应用技术3.1. PCR是什么？它有什么应用？PCR（聚合酶链式反应）是一种体外扩增DNA分子的技术。
通过PCR，可以迅速、准确地扩增出特定的DNA片段。
PCR的应用非常广泛，包括基因分型、疾病诊断、法医学鉴定等领域。
3.2. 什么是基因测序？常用的基因测序技术有哪些？基因测序是指确定DNA或RNA中碱基顺序的过程。
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4.2 核酸的检测与保存
检测： 紫外光谱分析法和荧光分析法。 A260=1相当于 50μg/mL 双链DNA 保存： pH：TE； 温度：-20℃，-80℃。
4.3 核酸的凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳
分类：低熔点琼脂糖和高 熔点琼脂糖。 分辨率：差异高于200bp。 指示剂：溴酚蓝、二甲苯腈
洗涤，获得纯品
4.1.5 核外DNA的提取
组 织 匀 浆 差速离心分离细胞器
去除核DNA
蔗糖密度梯度离心 收集线粒体
裂解线粒体
DNA提取相关步骤
4.1.6 RNA的提取
总RNA提取： 常用方法：利用异硫氰酸胍裂解。 mRNA提取： 在总RNA提取的基础上进行亲和层析。
注意：RNase无处不在，需要做好实验预处理。
4.1.2 微生物DNA的提取
质粒DNA提取
细菌DNA提取 病毒DNA提取
质粒DNA提取
细菌培养 碱裂解法、 煮沸法、 去污剂裂解法。
菌体收集 裂解
离心去除沉淀 酚氯仿抽提
异丙醇沉淀
细菌DNA的提取
细菌细胞
悬浮细菌 碱裂解或煮沸或去污剂 酚氯仿抽提 12000rpm离心
上层水相 乙醇沉淀
中间变性蛋白 下层有机相
沉淀：63%乙醇（终浓度）
洗涤：70%乙醇
洗涤获得纯品
4.1.3 动物细胞DNA的提取
组 织 匀 浆 蛋白酶K消化 RNase消化 SDS裂解 高盐或酚氯仿抽提 乙醇沉淀
洗涤，获得纯品
4.1.4 植物细胞的提取
组 织 匀 浆 CATB处理 高盐或酚氯仿抽提 去除RNA 乙醇沉淀
1.CATB 法： CATB （十六烷基三乙基溴化铵），能溶解细胞 膜 ， 与 核 酸 形 成 复 合 物 ， 该 复 合 物 在 高 盐 溶 液 （ 0.7M NaCl）中可溶，降低盐浓度（0.3M）即可沉淀。 很好的去除糖类；初期能同时分离DNA和RNA。
2.SDS法：SDS（十二烷基硫酸钠）在55-65℃下裂解细胞， 使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用高盐 及降低温度的做法或用酚氯仿法使蛋白质变性，多糖沉淀， 除去沉淀后用乙醇沉淀核酸。 操作简单、温和，可提取RNA和DNA，但糖类不易去除。
电泳凝胶核酸印迹法、斑点印迹法、 狭线印迹法、菌落和噬菌斑印迹法。
（2）探针杂交。
探针的制备
探针：经放射性或飞放射性等物质标记的 已知或特定的DNA或RNA序列。 探针种类：
同位素标记探针 生物素标记探针 地高辛标记探针 辣根过氧化酶标记探针
核酸杂交方法
Southern DNA杂交 Northern RNA杂交 斑点印迹 杂交 菌落（噬 菌斑）杂 交
染色：EB
缓冲液：TAE、TBE
聚丙烯酰胺凝胶电泳少：银染，可检测 少量样品；
回收DNA纯度高；
脉冲场凝胶电泳
分离超大DNA分子： 1-10Mb用于基因组构建。4.4 核酸的分子杂交
原理：A-T(U),G-C互补配对。 可形成DNA:DNA，DNA:RNA双链分子。 主要步骤： （1）核酸转移；
4 核酸操作的基本技术
核酸是基因工程研究的对象和材 料，核酸操作技术的好坏对于基因工 程的成败可产生决定性的影响。
4.1 4.2 4.3 4.4
核酸的提取与纯化 核酸的检测与保存 核酸的凝胶电泳 核酸的分子杂交
4.1 核酸的提取与纯化
提取的目的：保持核酸的完整性。 需要注意的方面： 细胞内的核酸酶；化学因素；物理因素。
离心分离法：超速离心、凝胶电泳
超速离心：
（a）速度区带离心：蔗糖。
沉降速度与样品质量、密度、离 心力大小、介质密度及样品与介 质的摩擦力有关。
（b）密度梯度离心:CsCl。
沉降速度与密度有关。 分辨率：0.02g/mL 蛋白质：1.3g/mL DNA： 1.6-1.7g/mL RNA： 1.75-1.85g/mL
4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4 4.1.5 4.1.6
基本原理 微生物DNA的提取 动物细胞DNA的提取 植物细胞的提取 核外DNA的提取 RNA的提取
4.1.1 基本原理
步骤：
组织细胞破碎
去除杂质（蛋白、糖类）
去除其他杂质核酸
脱盐、获得纯品
化学试剂提取法：碱裂解法、煮沸法、有 机溶剂抽提法、去污剂法等