荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量

基本操作
1. 打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器。 打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机启动工作站并初始化仪器。 2. 仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参 仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目， 数：激发波长= 440 nm，发射波长=540 nm。 激发波长= nm，发射波长=540 nm。 3. 样品测定。 样品测定。 4. 退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。 退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。
I F = 2.303φI 0 εbc
当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系： 当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：
I F = Kc
这是荧光光谱法定量分析的理论依据。 这是荧光光谱法定量分析的理论依据。
荧光分析法的特点
a. 与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。 与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。 b. 选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定 选择性好。荧光法既能依据发射光谱， 物质。 物质。 c. 所需试样量少、操作方法简便。 所需试样量少、操作方法简便。
仪器部件
a. 光源 ： 在荧光计中常用卤钨灯作光源 ； 荧光分度计常采用高压汞灯或 光源：在荧光计中常用卤钨灯作光源； 氙弧灯做光源。 氙弧灯做光源。 b. 单色器 ： 荧光计的单色器是滤光片， 只能用于定量分析 ；荧光分光光 单色器：荧光计的单色器是滤光片，只能用于定量分析； 度计采用两个光栅单色器，可获得激发光谱和荧光光谱。 度计采用两个光栅单色器，可获得激发光谱和荧光光谱。 c. 检测器 ： 荧光计采用光电管作检测器 ； 荧光分光光度计采用光电倍增 检测器：荧光计采用光电管作检测器； 管作检测器。 管作检测器。
实验预习
预习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B 的分析原理。 预习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的分析原理。 了解荧光光度计的操作步骤和测定多维葡萄糖粉中维生素B 了解荧光光度计的操作步骤和测定多维葡萄糖粉中维生素B2 的 方法。 方法。
仪器与试剂
970CRT荧光光度计（上海分析仪器总厂） 970CRT荧光光度计（上海分析仪器总厂） 荧光光度计 5 mL吸量管1只，2 mL吸量管1只， 50 mL容量瓶7只 mL吸量管 吸量管1 mL吸量管 吸量管1 mL容量瓶 容量瓶7 10.0µg·mL-1VB2标准溶液（置阴暗处保存），冰乙酸（AR）， 标准溶液（置阴暗处保存），冰乙酸（AR）， ），冰乙酸 多维葡萄糖粉试样
多维葡萄糖粉中维生素B 多维葡萄糖粉中维生素B2含量的测定 维生素B 又叫核黄素， 维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构 是橘黄色无臭的针状结晶，
OH
式为： 式为：
HO HO HO H H 3C N H H H H N O
H3C
N O
维生素B 易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定， 维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定， 光照易分解，对热稳定。 光照易分解，对热稳定。
荧光分析仪器 常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记 常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、 录器五部分构成，如下图所示： 录器五部分构成，如下图所示：
I0 单色器
光源
液槽 If 单色器
显示器
检测器
荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点： 荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点： a.荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响； a.荧光分析仪器采用垂直测量方式 以消除透射光的影响； 荧光分析仪器采用垂直测量方式， b.荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其 b.荧光分析仪器有两个单色器 荧光分析仪器有两个单色器， 它杂散光干扰。 它杂散光干扰。
荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B 荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量
实验目的
学习荧光分光光度法测定多维葡萄糖粉中维生 素B2的分析原理。 的分析原理。 掌握荧光分光光度计的操作技术和测定多维葡 萄糖粉中维生素B 的方法。 萄糖粉中维生素B2 的方法。
实验原理
荧光分析法 常温下， 常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态 分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级， 分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以 辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。 辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。 在稀溶液中，荧光强度I 与物质的浓度c有以下的关系： 在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系：
数据处理
1. 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。 2. 根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出 根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度， 试样中VB 含量。 试样中VB2含量。
注意事项和问题
1. 试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。 试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。 2. 维生素B2在pH＝6～7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？ 维生素B pH＝ 时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？
荧光光谱
激发光谱
激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与 激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长) 照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多， 照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多， 荧光强度最大。 荧光强度最大。
发射光谱
维生素B 溶液在430～ 维生素B2溶液在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值 nm蓝光的照射下 发出绿色荧光， 蓝光的照射下， 波长为525 nm。 波长为525 nm。VB2的荧光在pH=6～7时最强，在pH=11时消失。维生素 的荧光在pH=6 时最强， pH=11时消失 时消失。 B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光 在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素， 比核黄素的荧光强的多，故测VB 的荧光时溶液要控制在酸性范围内， 比核黄素的荧光强的多 ， 故测 VB2 的荧光时溶液要控制在酸性范围内 ， 且在避光条件下进行。 且在避光条件下进行。 多维葡萄糖中含有维生素B 多维葡萄糖中含有维生素B1、B2、C、D2及葡萄糖，其中维生素C和 及葡萄糖，其中维生素C 葡萄糖在水溶液中不发荧光，维生素B 本身无荧光， 葡萄糖在水溶液中不发荧光，维生素B1本身无荧光，在碱性溶液中用铁 氰化钾氧化后才产生荧光，维生素D 用二氯乙酸处理后才有荧光， 氰化钾氧化后才产生荧光，维生素D2用二氯乙酸处理后才有荧光，他们 都不干扰维生素B 的测定。 都不干扰维生素B2的测定。
实验步骤
1. 标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定： 标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定： 在六个干净的50 mL容量瓶中 分别吸取0.50、1.00、1.50， 在六个干净的50 mL容量瓶中，分别吸取0.50、1.00、1.50，2.00 、2.50 容量瓶中， 标准溶液，各加入2.00 mL冰乙酸 稀释至刻度，摇匀。 冰乙酸， 和3.00 mL VB2标准溶液，各加入2.00 mL冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。从 稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。 稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。 2. 未知试样的测定: 未知试样的测定: 称取0.15称取0.15-0.20 g多维葡萄糖粉试样,用少量水溶解后转入50 mL容量瓶中， g多维葡萄糖粉试样 用少量水溶解后转入50 mL容量瓶中 多维葡萄糖粉试样, 容量瓶中， 加2.00 mL冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件， mL冰乙酸 稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件， 冰乙酸， 测量其荧光强度。 测量其荧光强度。
发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光强度与 发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 发射光波长关系曲线。 发射光波长关系曲线。 固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长， 固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定 激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。 激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长 和发射荧光波长的选择是本实验的关键。 和发射荧光波长的选择是本实验的关键。