人参皂苷Rb3对ox_LDL诱导内皮细胞氧化应激与功能障碍的类雌激素样保护作用
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1406 ・
药学学报 Acta Pharmaceutica Siniwk.baidu.coma 2014, 49 (10): 1406−1412
人参皂苷 Rb3 对 ox-LDL 诱导内皮细胞氧化应激与 功能障碍的类雌激素样保护作用
潘玉婷 1†, 郭春雨 2, 马晓娟 2, 王景尚 2, 刘 张 淼 2, 殷惠军 1, 2*†
甘肃高校飞天学者特聘计划 .
潘玉婷等: 人参皂苷 Rb3 对 ox-LDL 诱导内皮细胞氧化应激与功能障碍的类雌激素样保护作用
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1407 ・
levels of Akt was measured by Western blotting.
The results showed that GRb3 could enhance the activity of These effects were blocked by
PAN Yu-ting1†, GUO Chun-yu 2, MA Xiao-juan 2, WANG Jing-shang 2, LIU Xin2, SUN Ming-yue 2, ZHANG Miao2, YIN Hui-jun 1, 2*†
(1. Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. Xiyuan Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100091, China)
2. 中国中医科学院西苑医院 , 北京 100091)
欣 2, 孙明月 2,
(1. 甘肃中医学院 , 甘肃 兰州 730000;
摘要 : 人参皂苷 Rb3 (ginsenoside Rb3, GRb3) 是西洋参茎叶总皂苷 (Panax quinquefolius Saponin of stem and leaf, PQS) 的主要入血成分之一 , 既往研究显示其具有雌激素受体激动效应。本研究观察 GRb3 对 ox-LDL 诱导人脐静脉内皮细胞氧化应激与功能障碍的保护作用 。药物干预后检测细胞内 SOD 、NOS 活性与 MDA 含量, ELISA 法进行细胞培养上清液 ET-1 与 NO 含量的测定 , real time RT-PCR 方法检测细胞中 eNOS 和 iNOS 的转录 水平, Western blotting 方法测定丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶 Akt 的磷酸化水平。 与 ox-LDL 损伤模型组相比 , GRb3 增 高细胞内 SOD 活力 , 降低细胞内 MDA 含量与总 NOS 活性 , 减少细胞 ET-1 和 NO 合成 , 升高 eNOS 的转录水平 及降低 iNOS 的转录水平 , 且能调节 Akt 的磷酸化水平 , 从而发挥保护作用 , 给予雌激素受体抑制剂 ICI182780 预处理后上述保护作用消失。结果提示 , GRb3 可通过雌激素受体的介导发挥抗 ox-LDL 对内皮细胞的损伤作用 , 其作用效应与 17β-雌二醇相似。 关键词: 人参皂苷 Rb3; 氧化低密度脂蛋白 ; 氧化应激 ; 内皮素-1; 一氧化氮 中图分类号 : R963 文献标识码 : A 文章编号 : 0513-4870 (2014) 10-1406-07
收稿日期 : 2014-04-21; 修回日期 : 2014-06-13. 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (81173584); 北京市自然科学基金资助项目 (7122157). † 共同第一作者 . *通讯作者 Tel / Fax: 86-10-62874093, E-mail: huijunyin@yeah.net
The estrogen-like protective effect of ginsenoside Rb3 on oxidative stress and dysfunction of endothelial cells induced by oxidized low-density lipoprotein
−9 −1 [5] −6 −1 [4] [3] [2] [1]
材料与方法
药物和试剂 人参皂苷 Rb3 (GRb3, 纯度 98%) 购自天津一方科技有限公司 ; 17β- 雌二醇为德国 Dr 公司 生产 ; ox-LDL (MDA: 47 nmol·mL−1) 由北京协 生生物有限公司制备; ICI186780 (ICI) 由英国 Tocris 公司生产。 M199 培养基 (Medium 199) 、 胎牛 血清 (fetal bovine serum, FBS) 、 LSGS (low serum growth supple ment) 均购自 GIBCO 公司; 胶原酶Ⅰ、 明胶、 DMSO 、 MTT (Sigma-Aldrich 公司 , 美国); 0.25% 猪胰 蛋白酶 (Hyclone 公司 ); 100× 青链霉素混合液 (北京 索莱宝科技有限公司 ); PBS 磷酸盐缓冲剂 ( 北京鼎 国生物有限公司); 肝素、NaHCO3、台盼蓝等均为国 产分析纯。 细胞裂解液 (北京普利莱基因技术有限公 司 ); 蛋白酶抑制剂 ( 苯甲基磺酰氟 , 上海索莱 宝公司 ) 。 BCA 蛋白定量试剂盒 (PIERCE 公司 , 美 国 ); 超氧化物歧化酶 (SOD) 测定试剂盒、丙二醛 (MDA) 测定试剂盒及总一氧化氮合酶 (NOS) 测定 试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品。人一氧 化氮 (NO) 、人内皮素-1 (ET-1) ELISA 试剂盒 (R&D 公司, 美国); M-MLV 反转录试剂盒 (Takara 公司, 日 本 ); real-time PCR 扩增试剂盒 ( 北京中原领先科技 有限公司)。 Akt 为兔来源的单克隆抗体, 由美国 CST 公司生产。 实验仪器 CO2 培 养 箱 (Thermo 3111 美 国 ); DMIRB 型倒置相差显微镜 (莱卡公司, 德国); Milli-Q 超纯水/Elix 纯水系统 (MilliPORE 公司 , 美国); 核酸 紫外分光光度计 (Biophotometer, 德国); MULTISKAN MK3 全自动酶标仪 (Thermo, 美国 ); Real-Time PCR 仪 (ABI 7500, 美国); 稳压稳流电泳仪、垂直电泳槽 及半干转电转印仪 (Bio-Rad, 美国 ); 数码凝胶成像 系统 (北京宾达英创科技有限公司)。 人脐静脉内皮细胞的培养 人脐静脉内皮细胞 (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) 的 分离与培养在 Jaffe 法 [6] 的基础上进行改进。无菌条 件下收集健康产妇正常分娩的新生儿脐带 , 0.1% 胶
Abstract : Ginsenoside Rb3 (GRb3) is one of the main components in plasma of Panax quinquefolius Saponin of stem and leaf (PQS), which can be into human plasma. estrogen-like vascular protective effects. Previous studies have found PQS has In the present study, we investigated the estrogen-like protective effect
血管内皮细胞是血管壁的主要屏障 , 其功能失 调和损伤是动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 的始 动环节 。 17β-雌二醇 (17β-estradiol, 17β-E2) 作为一 种激素替代疗法防治绝经后女性 AS 曾在国内外有一 定应用, 但因其不良后果如生殖系统肿瘤、静脉血栓 栓塞等限制了其推广应用 。 近年来 , 流行病学研究、 大量人群试验与动物实验均证实 , 植物性雌激素具 有心血管保护作用 , 且未出现明显的毒副作用, 其对 雌激素受体的选择性激活作用表现出对绝经后女性 冠状动脉性心脏病患者更具心血管保护作用 。西洋 参茎叶总皂苷 (Panax quinquefolius Saponin of stem and leaf, PQS) 是从西洋参茎叶中提取分离的有效组 分。 课题组对绝经后女性冠心病患者的临床研究与对 去势 ApoE-/-动脉粥样硬化雌性小鼠的实验研究显示 , PQS 具有抗过氧化损伤、 抑制炎症反应、 调节血管舒 缩及血脂代谢等类雌激素样血管保护作用 。 PQS 的 药效物质基础研究发现 , 人参皂苷 Rb3 (ginsenoside Rb3, GRb3) 是 PQS 的主要入血成分之一 , 进一步采 用快速识别药物作用靶点的计算模拟方法, 发现 GRb3 与雌激素受体 (estrogen receptor, ER) 强势结 合, 推测其可能发挥雌激素效应 , 为此 , 课题组利用 转基因细胞株建立实验体系 , 将重组雌激素受体效 应片段 (EREs) 和荧光素酶报告基因的质粒稳转进 人卵巢癌细胞株 (BG1), 并用药物暴露细胞 , 通过 检测荧光素酶的活性来检测药物的雌激素受体活性 , 结果表明, GRb3 有显著的 ER 活性, 1×10 mol·L 诱 导 ER 的活性可达到 1×10 mol·L 17β-E2 的 100% 。 推测 GRb3 为 PQS 发挥类雌激素样心血管保护作用 的药效物质基础之一。 GRb3 是否具有类雌激素样血管内皮细胞保护 效应, 目前尚未见报道。本研究建立体外氧化低密度 脂蛋白 (oxidized-low density lipoprotein, ox-LDL) 诱 导内皮细胞损伤的 AS 模型 , 观察 GRb3 对内皮细胞 过氧化损伤与功能障碍的影响 , 探索其效应机制 , 为 PQS 在防治心血管疾病方面的临床应用提供实验 依据。
of GRb3 on oxidative stress and dysfunction of endothelial cells induced by oxidized low-density lipoprotein. The activities of SOD, NOS and the contents of MDA in the cell lysate were examined by enzyme method or spectrophotometry. method. The NO and ET-1 concentrations in the cell culture supernatant were measured by ELISA The iNOS and eNOS mRNA expression were measured by real time RT-PCR, while the phosphorylation
SOD, reduce the content of MDA, increase the level of NOS, NO, ET-1 and iNOS mRNA expression while decrease the eNOS mRNA expression and the phosphorylation level of Akt. estrogen receptor antagonist ICI182780. estrogen receptors, the protective mechanism is similar to 17-β estrodiol. Key words: ginsenosides Rb3; ox-LDL; oxidative stress; endothelin-1; nitric oxide GRb3 can play a role in protecting vascular endothelial cells by
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药学学报 Acta Pharmaceutica Siniwk.baidu.coma 2014, 49 (10): 1406−1412
人参皂苷 Rb3 对 ox-LDL 诱导内皮细胞氧化应激与 功能障碍的类雌激素样保护作用
潘玉婷 1†, 郭春雨 2, 马晓娟 2, 王景尚 2, 刘 张 淼 2, 殷惠军 1, 2*†
甘肃高校飞天学者特聘计划 .
潘玉婷等: 人参皂苷 Rb3 对 ox-LDL 诱导内皮细胞氧化应激与功能障碍的类雌激素样保护作用
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levels of Akt was measured by Western blotting.
The results showed that GRb3 could enhance the activity of These effects were blocked by
PAN Yu-ting1†, GUO Chun-yu 2, MA Xiao-juan 2, WANG Jing-shang 2, LIU Xin2, SUN Ming-yue 2, ZHANG Miao2, YIN Hui-jun 1, 2*†
(1. Gansu University of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China; 2. Xiyuan Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100091, China)
2. 中国中医科学院西苑医院 , 北京 100091)
欣 2, 孙明月 2,
(1. 甘肃中医学院 , 甘肃 兰州 730000;
摘要 : 人参皂苷 Rb3 (ginsenoside Rb3, GRb3) 是西洋参茎叶总皂苷 (Panax quinquefolius Saponin of stem and leaf, PQS) 的主要入血成分之一 , 既往研究显示其具有雌激素受体激动效应。本研究观察 GRb3 对 ox-LDL 诱导人脐静脉内皮细胞氧化应激与功能障碍的保护作用 。药物干预后检测细胞内 SOD 、NOS 活性与 MDA 含量, ELISA 法进行细胞培养上清液 ET-1 与 NO 含量的测定 , real time RT-PCR 方法检测细胞中 eNOS 和 iNOS 的转录 水平, Western blotting 方法测定丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶 Akt 的磷酸化水平。 与 ox-LDL 损伤模型组相比 , GRb3 增 高细胞内 SOD 活力 , 降低细胞内 MDA 含量与总 NOS 活性 , 减少细胞 ET-1 和 NO 合成 , 升高 eNOS 的转录水平 及降低 iNOS 的转录水平 , 且能调节 Akt 的磷酸化水平 , 从而发挥保护作用 , 给予雌激素受体抑制剂 ICI182780 预处理后上述保护作用消失。结果提示 , GRb3 可通过雌激素受体的介导发挥抗 ox-LDL 对内皮细胞的损伤作用 , 其作用效应与 17β-雌二醇相似。 关键词: 人参皂苷 Rb3; 氧化低密度脂蛋白 ; 氧化应激 ; 内皮素-1; 一氧化氮 中图分类号 : R963 文献标识码 : A 文章编号 : 0513-4870 (2014) 10-1406-07
收稿日期 : 2014-04-21; 修回日期 : 2014-06-13. 基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (81173584); 北京市自然科学基金资助项目 (7122157). † 共同第一作者 . *通讯作者 Tel / Fax: 86-10-62874093, E-mail: huijunyin@yeah.net
The estrogen-like protective effect of ginsenoside Rb3 on oxidative stress and dysfunction of endothelial cells induced by oxidized low-density lipoprotein
−9 −1 [5] −6 −1 [4] [3] [2] [1]
材料与方法
药物和试剂 人参皂苷 Rb3 (GRb3, 纯度 98%) 购自天津一方科技有限公司 ; 17β- 雌二醇为德国 Dr 公司 生产 ; ox-LDL (MDA: 47 nmol·mL−1) 由北京协 生生物有限公司制备; ICI186780 (ICI) 由英国 Tocris 公司生产。 M199 培养基 (Medium 199) 、 胎牛 血清 (fetal bovine serum, FBS) 、 LSGS (low serum growth supple ment) 均购自 GIBCO 公司; 胶原酶Ⅰ、 明胶、 DMSO 、 MTT (Sigma-Aldrich 公司 , 美国); 0.25% 猪胰 蛋白酶 (Hyclone 公司 ); 100× 青链霉素混合液 (北京 索莱宝科技有限公司 ); PBS 磷酸盐缓冲剂 ( 北京鼎 国生物有限公司); 肝素、NaHCO3、台盼蓝等均为国 产分析纯。 细胞裂解液 (北京普利莱基因技术有限公 司 ); 蛋白酶抑制剂 ( 苯甲基磺酰氟 , 上海索莱 宝公司 ) 。 BCA 蛋白定量试剂盒 (PIERCE 公司 , 美 国 ); 超氧化物歧化酶 (SOD) 测定试剂盒、丙二醛 (MDA) 测定试剂盒及总一氧化氮合酶 (NOS) 测定 试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品。人一氧 化氮 (NO) 、人内皮素-1 (ET-1) ELISA 试剂盒 (R&D 公司, 美国); M-MLV 反转录试剂盒 (Takara 公司, 日 本 ); real-time PCR 扩增试剂盒 ( 北京中原领先科技 有限公司)。 Akt 为兔来源的单克隆抗体, 由美国 CST 公司生产。 实验仪器 CO2 培 养 箱 (Thermo 3111 美 国 ); DMIRB 型倒置相差显微镜 (莱卡公司, 德国); Milli-Q 超纯水/Elix 纯水系统 (MilliPORE 公司 , 美国); 核酸 紫外分光光度计 (Biophotometer, 德国); MULTISKAN MK3 全自动酶标仪 (Thermo, 美国 ); Real-Time PCR 仪 (ABI 7500, 美国); 稳压稳流电泳仪、垂直电泳槽 及半干转电转印仪 (Bio-Rad, 美国 ); 数码凝胶成像 系统 (北京宾达英创科技有限公司)。 人脐静脉内皮细胞的培养 人脐静脉内皮细胞 (human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) 的 分离与培养在 Jaffe 法 [6] 的基础上进行改进。无菌条 件下收集健康产妇正常分娩的新生儿脐带 , 0.1% 胶
Abstract : Ginsenoside Rb3 (GRb3) is one of the main components in plasma of Panax quinquefolius Saponin of stem and leaf (PQS), which can be into human plasma. estrogen-like vascular protective effects. Previous studies have found PQS has In the present study, we investigated the estrogen-like protective effect
血管内皮细胞是血管壁的主要屏障 , 其功能失 调和损伤是动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 的始 动环节 。 17β-雌二醇 (17β-estradiol, 17β-E2) 作为一 种激素替代疗法防治绝经后女性 AS 曾在国内外有一 定应用, 但因其不良后果如生殖系统肿瘤、静脉血栓 栓塞等限制了其推广应用 。 近年来 , 流行病学研究、 大量人群试验与动物实验均证实 , 植物性雌激素具 有心血管保护作用 , 且未出现明显的毒副作用, 其对 雌激素受体的选择性激活作用表现出对绝经后女性 冠状动脉性心脏病患者更具心血管保护作用 。西洋 参茎叶总皂苷 (Panax quinquefolius Saponin of stem and leaf, PQS) 是从西洋参茎叶中提取分离的有效组 分。 课题组对绝经后女性冠心病患者的临床研究与对 去势 ApoE-/-动脉粥样硬化雌性小鼠的实验研究显示 , PQS 具有抗过氧化损伤、 抑制炎症反应、 调节血管舒 缩及血脂代谢等类雌激素样血管保护作用 。 PQS 的 药效物质基础研究发现 , 人参皂苷 Rb3 (ginsenoside Rb3, GRb3) 是 PQS 的主要入血成分之一 , 进一步采 用快速识别药物作用靶点的计算模拟方法, 发现 GRb3 与雌激素受体 (estrogen receptor, ER) 强势结 合, 推测其可能发挥雌激素效应 , 为此 , 课题组利用 转基因细胞株建立实验体系 , 将重组雌激素受体效 应片段 (EREs) 和荧光素酶报告基因的质粒稳转进 人卵巢癌细胞株 (BG1), 并用药物暴露细胞 , 通过 检测荧光素酶的活性来检测药物的雌激素受体活性 , 结果表明, GRb3 有显著的 ER 活性, 1×10 mol·L 诱 导 ER 的活性可达到 1×10 mol·L 17β-E2 的 100% 。 推测 GRb3 为 PQS 发挥类雌激素样心血管保护作用 的药效物质基础之一。 GRb3 是否具有类雌激素样血管内皮细胞保护 效应, 目前尚未见报道。本研究建立体外氧化低密度 脂蛋白 (oxidized-low density lipoprotein, ox-LDL) 诱 导内皮细胞损伤的 AS 模型 , 观察 GRb3 对内皮细胞 过氧化损伤与功能障碍的影响 , 探索其效应机制 , 为 PQS 在防治心血管疾病方面的临床应用提供实验 依据。
of GRb3 on oxidative stress and dysfunction of endothelial cells induced by oxidized low-density lipoprotein. The activities of SOD, NOS and the contents of MDA in the cell lysate were examined by enzyme method or spectrophotometry. method. The NO and ET-1 concentrations in the cell culture supernatant were measured by ELISA The iNOS and eNOS mRNA expression were measured by real time RT-PCR, while the phosphorylation
SOD, reduce the content of MDA, increase the level of NOS, NO, ET-1 and iNOS mRNA expression while decrease the eNOS mRNA expression and the phosphorylation level of Akt. estrogen receptor antagonist ICI182780. estrogen receptors, the protective mechanism is similar to 17-β estrodiol. Key words: ginsenosides Rb3; ox-LDL; oxidative stress; endothelin-1; nitric oxide GRb3 can play a role in protecting vascular endothelial cells by