3DNA的复制

3 DNA的复制Watson 和Crick 在专著中写到“一种遗传物质，必须能行使两种功能，即自我复制和对细胞的高度特异性的影响”。

DNA作为主要的遗传物质它必须具备的第一个功能是能够准确地进行自我复制。

自DNA双螺旋结构模型提出后，DNA复制的基本过程和分子机理才得以揭示和阐明。

DNA复制是亲代双链DNA分子在DNA聚合酶等相关酶的作用下，分别以每条单链DNA分子为模板，聚合与模板链碱基可以互补配对的游离的三磷酸脱氧核糖核酸dNTP,合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代双链DNA分子的过程。

从复制起点到复制终点的DNA区段称为一个复制子（Replicon）。

然而，由于DNA复制过程的复杂性和突变体材料的特殊性，关于DNA复制的过程还未能完全揭示，DNA复制的机理仍有较多不解之迷。

例如双链DNA分子在复制过程中解旋所需的能量来源；原核生物DNA复制如何以105bp/min的高速延伸（相当于8400 rpm的高速离心机!）；参与复制体（replisome）的多种酶类怎样协同互作以保证遗传信息的准确复制；生物种类纷繁复杂，但复制机理的共同特征和进化痕迹是什么等。

3.1 DNA复制的基本特征3.1.1 DNA的半保留复制Watson 和Crick在提出著名DNA双螺旋模型时就科学地预见，DNA复制过程中亲代DNA 的双链分子彼此分离，作为模板，按AT配对，CG配对的原则，合成两条新生子链，并称这种方式为半保留复制复制（semiconservativereplication）。

然而在缺乏科学实验证据的情况下，并不能排除还有全保留复制（conservative replication）和随机分散复制（random dispersive）方式的可能（图3-1）。

1958年M. Meselson和F. W. Stahl利用经典的实验, 区分了这三种复制的方式，为Watson 和Crick的科学预见提供了有力的科学证据。

他们将N15加入到培养E.coli的培养基内，标记合成的新生DNA单链，然后将E.coli转移到含N14的培养基内，经过一个世代后，提取E.coli的DNA进行CsCl密度梯度离心，测定DNA分子的密度（图3-2）。

如果DNA是按全保留方式复制，两条含N15高密度的亲代DNA单链（DD）仍然结合在一起，新合成的双链DNA 含N14，位于低密度区（LL），离心管中出现两条不同密度的DNA带纹。

如果按随机分散方式复制，只会出现一条中等密度的双链DNA分子（DL）。

如果按半保留方式复制，一条高密度图3-1 DNA复制的三种可能模式的亲代单链DNA分子与一条低密度的子代单链DNA分子结合成双链分子，也只会出现一条中等密度梯度的带纹。

为了区别半保留方式复制与随机分散方式复制的DNA梯度带纹，M.(CsCl gradient centrifuge)N15DNAN14Semi-Conservation Replication图3-2 DNA的半保留复制证据Meselson 和F. W. Stahl 提取在N 14培养基内复制1代后的DNA （即第二世代）,并进行密度梯度离心，理论上按随机分散方式复制,占1/4的N 15的核苷酸组分随机分布在所有4条双链DNA 分子中，只会表现一条密度较低的DNA 带纹，而按半保留方式复制的第二代E.coli 的DNA 分子中，2条双链DNA 为低密度带纹（LL ）, 2条为中等密度的带纹（LD ）。

将这些DNA 分子进行热变性后，对被分离的单链DNA 分子进行密度梯度离心，理论上按随机分散方式复制的DNA 只会表现一条密度的带纹，按半保留方式复制的单链DNA, 会表现一条高密度的带纹（(N 15–DNA, D ）和一条低密度的带纹（N 14-DNA, L ）, 而如果让E.coli 再继续复制到第三、四代，密度梯度离心后仍会出现两条DNA 带纹，但低密度的DNA 分子会逐代增加，带纹（LL ）会逐渐变宽, 中等密度的DNA 分子仍为重链与轻链结合的一条双链DNA 分子（LD ）。

实验结果证实了DNA 是按半保留方式进行复制的（图3-3）。

3.1.2 DNA 复制按5’→ 3’延伸方向DNA 分子是一条双螺旋的多聚脱氧核苷酸链, 每条单链分子是由脱氧核苷酸间以5’磷酸酯键和3’磷酸酯键相连接而成的, 因此DNA 双链分子的线性末端极性是5’ → 3’ 和3’ → 5’反向平行的. 当新生单链DNA 以亲代单链DNA 为模板进行合成时, 其生长点是在5’端,还是在3’端, 即新生单链DNA 分子的延伸方向是5’ → 3’ ? 还是3’ → 5’? 20世纪50年代中期, A. Kornberg 就提出DNA 分子的复制过程必然是在一种依赖DNA 的DNA 聚合酶作用下的酶促反应过程, 继1956年Kornberg 成功地从E.coli 中分离到这种DNA 聚合酶I(DNA PolymeraseI , 亦称Kornberg 酶)后, 相继又分离到DNA PolymeraseII, DNA PolymeraseIII, 而且证明DNA PolymeraseIII 在原核生物的DNA 复制中起主要作用。

但不管是那种聚合酶它们都不能自己首先发动DNA 的复制过程, 只能利用引物分子提供的3’-OH 末端聚合dNTP, 所以新生单链DNA 分子的延伸方向只能是5’ → 3’, 这也是生物进化进程中“经济节能,适应生存”的结果. 如果DNA 链的延伸方向是3’ → 5’, 则新生DNA 单链的5’端必须带有三个磷酸基团才能与dNTP 的3’-OH 发生聚合反应, 显然dNTP 所具有的强烈负电荷与新生DNA 链5’末端三磷酸的强烈负电荷之间的静电斥力, 即使在生理盐浓度下, 这种斥力也难以屏障, 从而既影响了末端核苷酸与模板的配对, 又严重地阻止了dNTP 向DNA 链5’末端的靠近(图3-4)。

另外当DNA 复制中发生错误聚合, 需要进行校正时,必须先对错误聚合的dNMP 进行切除, 随后还需动用其他酶系统添加两个磷酸基团, 形成三磷酸末端后, 才能保证下一次聚合反应的进行, 这种既费时,又耗能的复制体系显然对生物的进化而言是一种劣势(图3-5)。

研究表明，所有核酸分子的复制均是从5’向3’进行的。

3.1.3 DNA 分子的半不连续复制（Semidiscontinuous Replication ）双链DNA 分子的复制是分别以两条极性相反的单链分子为模板，按5’→3’的延伸方向合成新生单链DNA 分子。

显然，这两条新合成的子链DNA 分子的延伸方向，一条是朝向复制叉的，因此它是随着复制叉的展开，以显露的单链DNA 分子为模板聚合dNTP 而延伸的,也称其为先导链 (leading strand ）。

而另一条是背向复制叉的，复制叉的延伸与新生DNA 单链的延伸是背道而驰的,由于这条链的复制较先导链慢,所以也称之为后随链(lagging strand)。

A T C G +5‟ppp OH 3‟Gppp OH G5‟ppp 因能量的需要，DNA 的5‟端必须带有PPP游离dNTP 具有ppp ppp OH 3‟A T C G 在0.2M Nacl 的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使dNTP 难以聚合到DNA 的5…端，而且双链DNA 的5‟端碱基配对困难需要其他机制以解脱图3-4 如果DNA 复制从3’向5’延伸, 强烈的负电荷之间的静电斥力将阻止DNA 的聚合新生DNA 单链DNA 是如何利用模板DNA 链,聚合与之互补的dNTP 而不断得以延伸的呢？1968年冈崎（Reiji Okazaki ）设计了两组实验，其一是脉冲标记实验（pilse －labeling experiment ）。

其二是脉冲追踪实验（pulse －chase experiment ）。

在脉冲标记实验中, 冈崎利用T4噬菌体侵染 E.cili(t-)菌株，并分别用dTTP(3H-T)进行2s ，7s,15s,30s,60s,120s碱基发生错配后的校正……费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗OH +ppp Appp OH T C GT C G pp p OH图3-5 如果DNA 复制从3’向5’延伸, 将不利于对复制错误的校正 的脉冲标记，分离提取T4噬菌体DNA ，变性后，进行Cscl 密度梯度离心，以检测具放射性的沉降片断，判断片断大小。

结果表明经不同标记时间的，被3H-T 标记的新合成的DNA 片段几乎都为10-20s ，即均为1000-2000核苷酸大小（图3-6）。

图3-6 DNA 分子不连续复制的脉冲标记实验与脉冲跟踪实验冈崎在第二组脉冲跟踪实验中,为了研究在脉冲标记实验中所发现的10－20s 的小片段在复制全过程中的发展结局，将实验菌株先进行同位素标记培养30秒，然后转入正常培养基继续培养数分钟，分离DNA 进行密度梯度离心，发现小片段已被连接成为70－120S 的大片段。

为此将DNA 的这种复制方式称为不连续复制模式，将最初合成的10－20s 片段称为冈崎片段。

如果两条极性单链的DNA复制均按这种不连续的模式进行，后随链的合成可以在模板单链暴露到1000－2000核苷酸长度后，开始从5’→3’合成冈崎片段，而先导链的合成从进化的原则讲，大可不必按冈崎片段的模式不断地启动小片段的合成，既耗时又费能。

换言之, DNA的复制应该是按一种半不连续的方式进行，即先导链以连续复制的方式完成子代DNA的合成，而后随链以不连续复制的方式完成冈崎片段的合成。

但在脉冲标记实验结果中，被标记的DNA片段全部为10s左右的小片段,实验结果似乎表明两条新生单链DNA分子均是以不连续复制的方式,按冈崎片段大小合成的。

进一步的研究表明, 其实在 E.coli的细胞内,存在dUTP和dTTP两种类似物,其比例大约为1：300，而DNA聚合酶III又不能区分这两者，一旦将dUMP聚合到DNA分子中，突变修复系统无法识别DNA中自身的U和因C氧化脱氨转换的U.这将必然会导致生物在基因表达与进化过程中的潜在危险。

实际上E.coli 依靠了两种机制阻止了dUMP 掺入到DNA分子的过程。

即由dut基因编码的dUTP酶（dUTPase）能有效地将dUTP，dUDP分解为dUMP,从而避免了dUMP作为底物而掺入到DNA分子中。

但是,即使dUTPase能将绝大部分的dUTP降解，但仍有dUTP分子约以1／1200的几率逃逸分解，并掺入到DNA分子中。

细胞内的“第二道防线”是由ung基因编码的尿嘧啶－N－糖苷酶（ungase）可以迅速地将已经掺入到DNA分子中的dUMP切除，形成一个无嘌呤或嘧啶的Ap位点（apurinic 或apyrimidinic），再由Ap内切酶进一步将Ap位点酶解成缺口，以与其对应的亲代链为模板重新聚合和连接，完成切补修复过程。