ESBLs及Ampc酶

一、ESBLs酶

1.初步筛选试验

(使用一种以上的药物进行筛选将会提高检测的敏感性)

判读结果

头孢泊肟10μg 的抑菌圈≤17mm

头孢他啶30μg的抑菌圈≤22mm

氨曲南30μg的抑菌圈≤27mm

头孢噻肟30μg的抑菌圈≤27mm

头孢曲松30μg的抑菌圈≤25mm

提示可能有ESBLs的产生

2.表型确证试验

确证试验需要同时使用头孢噻肟和头孢他啶，单独和联合克拉维酸的复合制剂

（1）头孢他啶30μg与头孢他啶/克拉维酸30/10μg

（2）头孢噻肟30μg与头孢噻肟/克拉维酸30/10μg

2组药物中有任何一组，在加克拉维酸后，抑菌圈直径与不加克拉维酸的抑菌圈相比，增大值≥5mm时，判定为产ESBLs（如，头孢他啶的抑菌圈＝16mm；头孢他啶/克拉维酸的抑菌圈＝21mm）

二、Ampc酶（目前还很少将其做为常规监测）

1.初筛：

（1）头孢西汀（30μg/片）与头孢西汀（30μg）/邻氯西林（200μg）。后者比前者的抑菌圈≥5mm即疑为Ampc。

（2）5种纸片筛选：头孢吡肟、亚胺培南、头孢西汀、头孢他啶与头孢他啶/克拉维酸。如头孢西汀≤17mm，对头孢吡肟、亚胺培南敏感即疑为产Ampc；如头孢他啶与其酶抑制剂的抑菌圈≥5mm可能产ESBLS。

2.确证试验（参考）

（1）双纸片法：待检菌株接种于M-H琼脂平板，贴上诱导剂头孢西汀纸片，在其左右10 mm 处分别贴上底物头孢他定(CAZ)和头孢噻肟(CTX)纸片，35％孵育16—18 h后，由于诱导型AmpC酶的产生，CAZ或CTX的抑菌圈在靠近诱导剂的一侧被酶抑制而缩小，出现扁平区，即底物离诱导剂远侧的抑菌圈半径减去近侧的抑菌圈半径≥4 mm为阳性。也可在M- H琼脂平板贴上诱导剂头孢西汀（FOX）和亚胺培南（lP）纸片，两纸片上下相距20 mm，然后在FOX和lP 左右10 mm处分别贴上底物CAZ和CTX纸片。同理判断，即底物CAZ或CTX离诱导剂远侧的抑菌圈半径减去近侧的抑菌圈半径>／4 mm为阳性。作为检测的诱导剂，IP优于FOX。

（2）四纸片法：采用亚胺培南(IPM)、阿莫西林/克拉维酸(AMC)、

头孢他定(CAZ)、头孢噻肟(CTX)或头孢曲松(CRO)、氨曲南(ATM))

四纸片。位置如左图该方法不仅能准确、快速区分产ESBI~和产诱导

AmpC酶，并能同时检出产这2种酶菌。

.（3）三维水相试验方法

将标准菌株ATCC 25922按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H

平板上。在M-H平板中心贴一片头孢西汀(30ug/片) 纸片，在距纸片边缘1cm处，用无菌手术刀片切3cm长度的小槽，将待测菌株的6个菌落接种于槽内(勿溢出槽外)，35℃孵育18-24h。

结果观察：若抑菌圈向内凹陷，即AmpC酶阳性。

三维水相试验方法的改进(M-H平板打孔[2mm]扩散法)。

（4）质粒型AmpC酶三联纸片方法的检测

将标准菌株ATCC 25922按常规药敏纸片K-B法操作均匀涂布于M-H平板上。在M-H平板中心贴一片头孢西汀(30ug/片) 纸片，在纸片边缘贴有待测菌的纸片（纸片上含20ul， PH8.0，1M Tris-0.1MEDTA）。另一侧边缘贴有产AmpC酶菌的纸片（同上）。

35℃孵育18-24h，如待检菌出现扁平或凹陷的抑菌环为阳性。