特异性启动子在植物基因工程中的应用

［ 1*］ 法也是常用的启动子分析方法 。 +6=<=6&B，4;UT ）
， 它与其他种子特异性基因 （如
豌豆球蛋白基因、 谷类储藏蛋白基因及玉米蔗糖合 的 启 动 子 的 保 守 元 件 相 似， 该序列包含
［ *］
了一个保守的 /3 基序 （ 4#"54#"5） ， 它 对 于种 子 特 异性基因的表达有重要作用 。植物叶特异 性 表达 的 1 ，* 二 磷 酸 核 酮 糖 羧 化 酶 ( 加 氧 酶 小 亚 基 （ /6%78&9:$1 ，*$%69+;&9+;<=: ><?%&’@8<9:(&’@8<9: 9A<88 基 因 启 动 子 中 5"55""##" 序 列、 ?%>C） #"$1 97%7B6= ， %&’、 D$%&’ 顺 式 元 件 也 具 有 高 度 保 守 性
［ E］
。菜豆富
含甘 氨 酸 的 蛋 白 质 （ !"# 1 F G ） 基因启动子中位于 ) !.*至 ) 1HH%+ 的 4"54#"5 序 列 与 木 质 部 特 异 性 表达 有 关
［ I］
它是指活体细胞， 经过甲醛的处理， 使得转录因子与 通过超声 L0# 分子上的结合 位 点 共 价 交 联 在 一 起， 波等机械手段将 L0# 分子破碎成小 片段， 然 后利用 某种转录因子的抗体免疫沉淀蛋白 $L0# 复合体， 最 后纯化分离出与该种转录因子结 合 L0# 片段， 并对 其 T4/ 扩增 和 凝 胶 分 析 以 获 得 启 动 子 及 其 顺 式 元 件的序列信息。
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生物工程学报
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［ $］
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特异性启动子概述
启动子是指 /)7 聚 合 酶 及 一 些 反 式 作 用 因 子
识别并与之结合从而正确有效地起始转录的一段特 异性的 Z)7 序 列。 不 同 的 启 动 子 使 基 因 具 有 不 同 的表达特性。能够使基因在大多数的细胞类型中表 达的启动子称为组 成 型 启 动 子， 例如花椰菜花叶病 毒 （ ;>M% ） E6S 启 动 子、 肌动蛋白 （ >0915 ） 和泛素 （ 4-1X41915） 启动 子 等。 使 基 因 表 达 能 够 对 特 异 条 件 产生响应的启动子为特异性启动子。在以往的转基 因植物中使用较多 的 是 组 成 型 表 达 启 动 子， 它们是 植物基因工程中应用最早、 最广泛的一类启动子， 特 点是表达具有持 续 性， 表 达 量 基 本 恒 定。 也 正 由 于
于翠梅等： 特异性启动子在植物基因工程中的应用
GG［ 11］ 子则含有 保 守 的 445#4 序 列 ； 干旱响应启动子
这种特点使得外源基因产物可能对植物的生长发育 产生不利影响， 甚至导致死亡。此外， 重复使用同一 种启动子驱动两个或两个以上的外源基因可能引起
［ !］ 。为了使外源基因 在 植物 基因沉默或共抑制现象
自 $UAE 年首次获得转基因植 物 以 来， 植物 基 因 工程的技术在解决 人 类 所 面 临 的 粮 食、 能源和环境 危机等方 面 发 挥 了 很 大 的 作 用 并 显 示 了 良 好 的 前 景， 然而， 在其发展过程中也不可避免地遇到一些问 题， 例如外源基因 在 受 体 植 物 内 往 往 会 出 现 表 达 效 率低、 表达产物不稳定甚至基因失活或沉默等现象， 导致转基因植物 无 法 投 入 实 际 应 用。 另 外， 转基因 植物安全性问题也逐步引起人 们的关 注
［ 2］ ［ -］
诱导表达； 激素应 答 启 动 子 中 则 包 含 激 素 应 答 元 件
［ 12］ （ J/K） 等。
利用这些保守元件一方面可以推测新基因的功 能， 另外将其有序的组合， 并与目的基因融合构建植 物表达载体最终应用于基因工程研究中。 !"# 启动子的研究方法 启动子分析方 法 主 要 分 为 两 大 类， 一是通过实 验测定方法， 二是通过计算机预测方法。 !"#"! 实验测定方法： 实验测定 启动子 及其 顺式调 节元件的最常 用 方 法 是 构 建 启 动 子 （或 拟 启 动 子） $ 报告基因 系 统。 其 过 程 为， 构建启动子 （或 拟 启 动 子） 片段与报告基因的表达载体， 然后通过合适的检 测系统， 测定报告基因的表达水平， 最终确定启动子 的表达特性或定位启动子顺式作用元件。构建启动 子片段采用缺失 （包括 *N 系列缺 失、 -N 系列缺 失和 中 间缺失） 、 突变 （对特定序列的点突变、 整段取代和扫 描突变） 和功能 获 得 实 验。 常 用 的 报 告 基 因 有 " $葡 聚糖酸醛苷 酶 （" 、 氯霉素乙酰转 $O87>7?&B6P<9:， 5QC ） 移酶 （ 4;8&?<A+;:B6><8 <>:=@8 =?<B9R:?<9:， 、 荧光素 4#"） 酶（ D7>6R:?<9:，DQ4 ）和 绿 色 荧 光 蛋 白（ 5?::B 。 用 于 启 动 子$报 告 基 因 表 R87&?:9>:B= +?&=:6B ，5ST ） 达特性检测的系统 有 原 生 质 体 转 化、 基因枪轰击和 农杆菌介导的瞬间表达检测以及转基因植物的稳定 表达检测。 此 外，免 疫 共 沉 淀（ 4;?&A<=6B 6AA7B&+?:>6$
摘
要
选择特异性启动子构建植物表达载体， 是实现 基 因 表 达 三 维 调 控 的 重 要 策 略， 并 已 应 用 于 植 物 品 质 改 良 基 因 工 程、
抗性基因工程及植物生物反应器等领域。文章综述了特异性启动子的结构、 类 型、 研究方法及在植物基因工程研究中的应用 进展和发展前景。 关键词 特异性启动子，植物基因工程，转基因植物 TDA 文献标识码 7 文章编号 $###BE#"$ （!##"） #"B#AA!B#U
特异性启动子在植物基因工程中的应用
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于翠梅 $ ，马莲菊 ! ，张宝石 $"
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$ 沈阳农业大学 遗传育种系，沈阳 ! 沈ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ师范大学 生物系，沈阳 $$#$"$
。 选择特
异性的启动子构建植物表达载体， 用以调控外源基因 在植物体内定时、 定位、 定量表达是解 决 上 述问 题 的 一个重要策略。本文就已经取得的进展进行综述。
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万方数据 >49?&. ( @+’ ：A"B!CBAACAD$E6 ，F>G：A"B!CBAACABD$E6 ，HB,>1’：:4041,+1 I $"E J 0&, " ;&..+<8&5215=
［ ］ 在着保守的 （ 5(4） （ 5(4） "#"5 序列 H 。
在诱导启 动 子 中， 光 响 应 启 动 子 通 常 存 在 5"$ 热 响应 启 动 1、 5#"#、 5$%&’ 等顺式元件的共同 作 用； 子使得基因的表达水平在受到热冲击后迅速大幅度 地提高， 其中含有的热冲击响应元件 （ JCK ） ， 在植 ［ 1.］ 万方数据 物、 动物和酵 母 中 有 一 定 保 守 性 ； 低温响应启动
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和 包含 保 守 的 干 旱 响 应 元 件 （ L/K， "#445#4#" ）
［ ］ （ #M/K， 植物在遭到 #M# 应 答 因 子 #45"55"4 ）1! ；
水淹时产生缺氧胁 迫， 低氧响应启动子中含有的缺
［ 1-］ 氧响应元件 （ #/K） ， 使得相关基因因发生缺氧而
体内高效发挥作用， 同时又可减少对植物的不利影 响， 目前人们对特 异 性 启 动 子 的 研 究 和 应 用 越 来 越 重视。 !"! 特异性启动子的结构与功能 植物特异性启动子主要由保守的基本启动子核 心序列及其上游特异性的顺式作用元件组成。一般 情况 下， 基本启 动子包 含转录起始位 点 和 "#"#$%&’ 结构。转录起始位点一般为 #， 两侧常 为 嘧 啶碱 基。 ［ #("］#［ #("］ ， 大都 "#"#$%&’ 的保守 序 列 为 "#"# 位于 转 录 起 始 点 ) !*%+ , ) -.%+ 之 间，是 /0# 聚 合酶 ! 的识别和结 合 位 点， 它决定了转录起始的精 确性。而上游特异性的顺式作用元件与特异性的转 录因子相结合调控基因表达的强度或特异性。因此 不同类型的启动子的差异可归结为顺式作用元件与 转录因子的差异， 而同一类型的启动子又具有一些 保守的序列。 在组织特异性 启 动 子 中， 种子特异性表达的玉 米醇溶蛋白 基 因 启 动 子 含 有 一 段 结 合 核 因 子 的 1* 个碱基的保守序列 成酶基因