分子标记在猕猴桃性别基因研究中的应用

收稿日期:2007-04-02基金项目:广东省科技攻关项目(2005B60301010);仲恺农业技术学院校基金(G3051312)作者简介:周玲艳(1972-),女,湖南衡阳人,讲师,在读博士研究生,主要从事植物生物技术研究。

分子标记在猕猴桃性别基因研究中的应用周玲艳1,秦华明2,梁　红1(1.仲恺农业技术学院生命科学学院,广东广州510225;2.暨南大学理工学院,广东广州510623)摘要:概述了猕猴桃性别分化的研究情况,简单介绍了几种常用的DNA 分子标记技术,并概括了分子标记技术在猕猴桃性别基因研究中的研究进展。

关键词:分子标记;猕猴桃;性别基因中图分类号:S663.4 文献标识码:A 文章编号:1004-3268(2007)08-0010-03 猕猴桃是猕猴桃科猕猴桃属植物的总称,为多年生藤本植物,雌雄异株的重要果树资源。

猕猴桃是20世纪野生果树人工驯化栽培最有成就的四大果种之一。

其风味独特,营养丰富,维生素C 含量高,有一定保健功效,因而倍受关注。

我国猕猴桃栽培面积居世界第1位,产量排第2位。

随着猕猴桃产业的发展,猕猴桃的研究受到越来越多的重视。

猕猴桃是功能性雌雄异株植物,雌株的花从结构上看虽然是具有雌雄两性器官的完全花,但雄蕊败育不产生有活力的花粉;而雄株的花则是雌蕊败育不形成胚珠,雌株和雄株的形态特征除了花器官之外肉眼无法识别,只能等到开花结果时才能分出雌雄。

而猕猴桃一般从播种至开花结果约需4年以上时间,达到一定产量的盛产期还需要3年左右,而雄株约占群落的50%左右。

用实生苗建园时,在树苗成熟以前就判定其性别,早期排除不需要的雄性植株,可以减少生产上的消耗和浪费;在进行杂种优势利用时,如果能早期鉴定杂种苗的性别,可以节省大量的时间、人力和财力。

因此,猕猴桃的早期性别鉴定研究在其生产和遗传育种方面有着重要的意义。

1　猕猴桃性别多态性的研究情况猕猴桃性别分化是在花芽发育的后期,即由越冬的腋芽分化出两性花的各个部分原基,后期在雄花中花柱及柱头停止发育而子房内无胚珠,在雌花中则雄蕊发育减慢而产生无萌发能力的花粉。

自20世纪70年代发现能结果的雄株以来,对猕猴桃属植物的性别变异和性别表达机理展开了一些研究[1～3]。

现有研究表明,猕猴桃在性别表达上几乎呈现连续的变异,至少有6种不同的性别表现型:完全两性植株,花形似雌花但所有的花药内均具有生活力的花粉;雌株,花药内具无生活力的花粉;不完全雌株,部分花药具有生活力花粉;可结果雄株,同时具有雄花和两性花;雄株,即只具有雄花以及中性株,花形似雄花但无生活力花粉。

而且上述6种表现型内也具有不同变异[3]。

既有不同基因型间的遗传变异,也表现出不同年份间的环境变异。

猕猴桃的染色体多而小,且核型存在多态性,有二倍体、四倍体、六倍体和八倍体等,所以从细胞遗传学上研究其性别的进展不大。

有研究者认为,猕猴桃的性别控制符合XY 染色体决定性别表达的方式,即二倍体XX 为雌性、XY 为雄性;多倍体则为X n 和X n Y ,如六倍体的美味猕猴桃的雌雄应分别为:XXXXXX 和XXXXXY [3]。

猕猴桃在性别表达上所呈现连续的变异大大增加了雌雄鉴别的难度。

植物在漫长的进化过程中,形成了性别的差异和分化上的变化,但并不像动物那样具有明显的第二性征。

植物性别间的差异主要表现在花器官上,因而在性成熟前和非花果期,雌雄植株间无明显的形态差异,很难分辨雌雄。

关于猕猴桃雌雄株的早期鉴别,从20世纪80年代起人们开始进行雌雄性别鉴别方法的研究,根据其外部形态、生长速度和物候期等特征进行分辨,但这些方法既无明确的鉴定标准,又受树龄、地区等方面变化的影响,难以应用,至今没有得到令人满意的结果。

如Olah 等[4]发现美味猕猴桃雌雄株的叶片和叶柄之间的形态差异,但叶片的大小和厚度均属数量性状,容易受营养和气候等条件的影响;徐东生等[5]试图从形态特征区分猕猴桃的雌雄,但通过统计分析发现性别和形态・01・2007年第8期关系不大。

赵林森等[6]根据叶片中酚类物质与不同化学试剂反应所产生的稳定颜色变化鉴别猕猴桃雌雄株,但仅限于成年植株。

近年来,随着分子生物学的发展,出现了越来越多的分子标记技术,其具有独特的优点而应用于生物学的各个方面。

在传统方法研究植物性别分化受到一定限制时,研究者试图通过分子生物学技术来打开植物性别分化决定的缺口。

2　分子标记在猕猴桃性别基因研究中的研究进展2.1　特异蛋白质标记特异蛋白质分子标记的研究方法主要有聚丙烯酰胺凝胶双向电泳和聚丙烯酰胺凝胶印迹转移电泳,聚丙烯酰胺凝胶双向电泳对蛋白质的分离效率相当高,已经在植物性别研究中有所应用,但在猕猴桃研究中起步较晚。

2006年,Khunaishvili等[7]采用SDS-PA GE电泳技术分析了中华猕猴桃和花叶狗枣猕猴桃叶的蛋白质组成,发现了猕猴桃性别相关的特定蛋白。

2.2　同工酶标记同工酶标记的本质是具有同一底物专一性的不同分子形式同工酶有组织、发育及物种的特异性,反映了编码这些酶的等位基因间的差异。

已有的结果表明,猕猴桃在同工酶水平上具高度的遗传多样性。

Hirsch等[8]首次报道了2个花芽过氧化物酶同工酶谱带为雄株特有。

接着晃无疾等[9]报道了叶片过氧化物酶同工酶谱带B是雄株特有的“性酶带”。

沈德绪[10]则认为,中华猕猴桃中雌株过氧化物酶同工酶酶带数比雄株多。

丁土林等[11]采用海沃德雌雄株幼叶、功能叶和1年生枝皮为材料,发现其过氧化物同工酶谱带数目和位置都没有差异,未发现与性别相关的“性酶带”。

但是,雄株的酶带染色要比雌株相应酶带深,显色时间要大大缩短,并认为根据酶带显色时间可鉴定猕猴桃雌雄株。

王妹清等[12]对猕猴桃雌雄植株叶片中过氧化物同工酶进行电泳分析测定发现,雌雄株之间同工酶的酶谱存在着明显差异,酶谱的变化与叶片生长量、植株的生育期、不同种类有关。

Hirsh等[13～15]对猕猴桃雌雄株POD同工酶进行了系统的研究,结果证明,猕猴桃雌雄株POD活性及同工酶图谱存在差异,且差异与试验材料种类、取材时期、培养方式等有密切关系。

对已知性别的成年树的研究表明,猕猴桃不同性别间酶谱的谱带数量不同,同工酶的活性也有差异,这些研究结果为猕猴桃雌雄株早期鉴定提供了参考。

同工酶虽广泛存在于植物体内,但对环境因子较为敏感,且同工酶的酶谱和活性又受植物发育阶段的影响,并有组织差异性,如在实生苗和实生幼苗中,过氧化物酶的谱带数目和活性与成树雌雄株均无一致性。

因此,目前还无法直接根据同工酶酶谱或活性作为鉴别猕猴桃雌雄性别的依据。

2.3　DNA分子标记2.3.1　RA PD标记　RA PD标记是在PCR的基础上发展起来的随机扩增的DNA多态性分析,其具有DNA用量少、质量要求低、检测效率高、且引物无种属特异性等优点,在植物性别研究中广泛采用,有些雌雄异株的植物已经得到了性别连锁RA PD 标记,如Khadka等[16,17]用RA PD标记技术在山靛中获得雄性特异性分子标记,并将其转化为SCA R 标记,将其中1个标记O PB01-1562进行序列分析,并从二倍体雌性、六倍体雄性以及雌雄同株植物中分离了同源序列,通过同源序列比较分析以及进一步的DNA和RNA杂交分析雌山靛性别决定的代表性基因M af ex。

Yakubov等[18]在阿月浑子中获得1个905bp的雌性特异性RA PD标记片段。

在猕猴桃性别研究中,Harvey等[19]以12个中华猕猴桃杂交群体为材料,用混和分离分析发现了与猕猴桃性别连锁的2个基因,Sm Y仅出现于雄株混合组,即雄性Y基因;SmX仅出现于雌株混合组,即雌性X基因。

G ill等[20]将RA PD SmX转化成特异引物SCA Rs,在来自同代的雌雄2个DNA池中,用500个随机引物进行筛选,确定了中华猕猴桃中2个性别连锁的SCAR标记。

2.3.2　A FL P标记　A FL P技术是RFL P和RA PD相结合的产物,具多态性丰富,DNA用量少、检测效率高、可靠性好、重复性高等优点,是一种十分理想的分子标记,近年来在植物性别基因研究中得到越来越多的应用。

J amsari等[21]使用雄性开花基因(MM)的单个雄性纯合体建立了一个H i n dⅢBAC文库,发展了基于BAC起源的标记,这些标记有利于雄性植物筛选的诊断。

张潞生等[22]采用A FL P技术对中华猕猴桃雌雄分离群体和Hay2 ward X毛花猕猴桃雌雄分离群体进行了分析,采用E co RⅠ/M seⅠA FL P引物组合和Operon等引物,筛选出与猕猴桃性别基因连锁的A FL P标记。

柯辉鹏等[23]也建立了猕猴桃A FL P分析系统,试图找到与猕猴桃性别相关的A FL P标记。

2.3.3　SSR标记　SSR标记具有多态性丰富、共显性遗传、DNA需要量少、DNA质量要求不高等优点,在植物性别研究中已有应用,如Parasnis等[24]研究发现微卫星标记(GA GA)4在番木瓜雌雄性别中表现出差异。

Danin等[25]报道,微卫星标记CS2 TA050与控制黄瓜全雌性别的F位点连锁距离为・11・河南农业科学7.4cM 。

Khattak 等[26]使用101个A FL P 和9个SSR 标记建立了藜科菠菜的遗传连锁图谱,并将性别基因定位于距离SSR 标记SO 41.9cM 的区域,该区域与性别共分离。

但目前还未见SSR 标记在猕猴桃性别基因研究中的相关报道。

3　展望植物性别分化本质上由遗传物质所决定,性别特异基因的分离以及其表达机理的阐明是最终揭开植物性别分化机理的关键。

随着分子生物学技术的发展,分子标记技术越来越成熟,各种特定分子标记的研究将为猕猴桃性别分化机理的最终阐明提供重要的途径,应用分子标记技术对猕猴桃乃至其他植物进行早期性别鉴定展示了光明前景。

但由于植物性别分化的复杂性和多样性,寻找稳定的性别特异的分子标记还是一项不容易的工作,园艺植物性别分化更是一个复杂的生物学现象,目前,与猕猴桃性别相关的DNA 分子标记虽有一定进展,但得到在所有群体中通用稳定的分子标记很少,有关研究工作需进一步深入开展。

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