核酸的分离纯化

DNA乙醇沉淀举例
5M NaCl 8L 100% 乙醇 400L
200L DNA 溶液
-20℃冰箱过夜 离心去上清，70%乙醇洗涤沉淀， 离心去上清，风干沉淀。
H2O或TE缓冲液溶解
(四）核酸的浓度、纯度及完整性测定
1 紫外分光光度法
前提
核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼 脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于 0.25 μg/ml 。
优点：
需体积小，速度快，适于浓度低、体积大
的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。 缺点： 易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难 以挥发除去。所以，最后用70％乙醇漂洗数
次。
3 核酸沉淀的温度和时间
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。 低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀， 影响以后的实验。 一般使用0℃冰水，10-15min， DNA样品足 可达到实验要求。
氯仿：加速有机相与水相分层，去除核酸溶液中残余 的酚，因为残余的酚会影响后续的酶反应。 异戊醇：降低表面张力，减少气泡产生，使离心后的 水相、变性蛋白相及有机溶剂相维持稳定。 （酚：氯仿：异戊醇=25：24：1） 具体操作：第一次用酚氯仿异戊醇抽提，之后用氯 仿异戊醇再洗2-3遍，以除去残余的酚。 用量：与DNA粗提液同倍体积，即1：1。
5. 观察、拍照
6. 分析、回收特定片段 (注意使用不同的UV 波长， 254nm; 365nm)
DNA电泳定量示意图
（五）核酸的保存
1 对DNA ① DNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或 -20℃保存； ② 长期保存样品中可加入1滴氯仿。
2
对RNA
① RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 ℃保存; ② 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; ③ 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于 -70℃,可保存数年。
中心法则
Gene，genome，ORF， exon， intron
内源基因的突变、表达及调控的异常和外源致病基 因的侵入是人类疾病发生、发展的根源。
核酸是临床检验的第四类重要的生物大分子。 核酸多与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。 DNA、RNA的分离纯化是分子生物学研究及对疾病 进行分子诊断的最基础工作。
在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相 当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或 RNA为40μg/ml；单链寡核苷酸为 33μg/ml。
结论
碱基的共轭双键
各种碱基的紫外吸收光谱
操作步骤
a. 吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加水稀释至特 定体积后，转入分光光度计的石英比色杯中。
临床分子诊断学-技术篇1
核酸的分离纯化
Isolation and Purification of Nucleic Acid
总论 原则 主要步骤 鉴定和保存 个论 • 基因组DNA的分离纯化 • 质粒DNA的提取纯化 • RNA的分离纯化 • DNA片段的回收
主要内容
Question?
• 分离方法
酚抽提法
甲酰胺解聚法 玻璃缠绕法 • 纯化方法
琼脂糖凝胶回收 聚丙烯酰胺凝胶回收 技术关键： 防止机械剪切力对基因组DNA一级结构完整 性的破坏。 100~200 kb
•非需要的核酸物质
•分离纯化过程中加入的有机溶剂和金属离子
操作步骤：
（一）细胞的破碎
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2 3 4 5 6
高速组织捣碎机捣碎
玻璃匀浆器匀浆 缺点：机械剪切力 超声波处理法 液氮研磨法 化学处理法(SDS、LDS，吐温80等） 生化法（溶菌酶、纤维素酶等）
物理法
（二）核蛋白的解聚、变性蛋白质的去除
核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电作用力 (核酸与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德 华力。
锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA样品在紫外光激发下， 可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系 列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA 溶液浓度。
EB与DNA的结合
其它荧光染料 Syber Green I GeneFinder
3 核酸的凝胶电泳
3 核酸的凝胶电泳 DNA电泳的功用？1. 检查DNA分子的大小、浓度、 纯度和完整性 2. 分离、回收特定的DNA片段 DNA电泳介质？ 琼脂糖凝胶；聚丙烯酰胺凝胶
3 (pH5.2)
10 5
0.3
2.5 0.2
1/10
1/4（25/100） 1/25（4/100）
LiCl
8
0.8
1/10
自学：利弊和使用范围
2
有机沉淀剂
（1）乙醇
优点： 对盐类沉淀少，沉淀中所含微量乙醇易挥 发除去，不影响以后实验。
2:1
缺点：
乙醇用量大，一般要求低温操作。
（2）异丙醇 1:1
b．分光光度计先用一定量的水校正零点。
c．测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值。 盐和小分子 核酸 蛋白质
d．计算浓度。
双链DNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释倍 数× 50/1000； RNA样品浓度(μg/μl) = OD260×核酸稀释倍数 ×40/1000。
（2) 肝素 （3）复合硅酸盐（Macaloid)
（4）RNase阻抑蛋白（RNasin） （5）氧钒核糖核苷复合物 (VanadylRibonucleoside Complex, VRC) (6) 异硫氰酸胍
原则：
（二）保证纯度（Purity）
认识杂质（contaminant）：主要包括三部分 ? •非核酸生物大分子：蛋白质、多糖、脂类
1. 核酸是什么？有什么理化 性质？ 2. 如何认识核酸在医学研究 领域的重要性？
核酸知识的回顾
核酸是遗传信息的携带者，遗传和突变的物 质基础。 核酸的组成：五碳糖、磷酸、碱基 核酸包括DNA和RNA，它们的区别在于核糖； T/U。 DNA双螺旋结构，tRNA三叶草结构 碱基互补配对原则
环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大 100 ～ 1000倍。 2） 容易降解，保存在 4 ℃或液氮中； 3 ）提 RNA 时， 0.1% DEPC浸泡器皿,37℃ 2 h以上。4）实验用试剂 （Tris,DTT例外）应用终浓度0.1%的DEPC水制备，37 ℃ 水浴过夜，高压灭菌去除残存DEPC。5）对眼睛和气道粘 膜有强刺激，避免吸入，是潜在的致癌物质。
核酸分离纯化选择原则
标本 实验目的 产品种类 血液、尿液、唾液、分泌物、 组织及细胞 RFLP, PCR, library construction DNA(genomic, plasmid)，RNA
对产品的要求 产量、完整性、纯度、浓度 方法 难易程度、安全性、成本
材料与方法的选择(selection)
1 DNA酶(DNase)抑制剂
1） 金属离子螯合剂：
DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属 二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四 乙酸二钠)、8-羟基喹啉；
2） 阴离子型表面活性剂：
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质 变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在 高盐溶液中沉淀。
原则：
（一）保持核酸分子一级结构的完整性 （Integrity）
1 意义：为什么？
2 如何保持结构完整性？
1）温度不要过高；
2）控制一定的pH值范围(pH值5-9)； 3）保持一定的离子强度； 4）减少物理因素对核酸降解的机械剪切力 （剧烈的物理震荡、反复冻融）。
5）防止核酸的生物降解
细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中 的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。 DNA酶(DNase) RNA酶(RNase) 措施 所用器械和一些试剂需高温灭菌；提取缓冲 液中需加核酸酶抑制剂；操作时戴手套防 止外来污染。
e．分析纯度。
举例说明DNA量计算方法： DNA 样品体积 = 100 μl 1/10稀释： 20μl of DNA 样品 + 180μl 去离子水 用0.2 ml 比色皿检测 A260 = 0.2
样品DNA浓度= 50μg/ml x A260 x 稀释倍数 = 50μg/ml x 0.2 x 10 = 100μg/ml =100 μg/1000μl =0.1 μg/μl DNA总量= 浓度 x 体积 = 100μg/ml x 0.1 ml = 10μg of DNA
使用酚时应注意：
1）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现 粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物， 例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽 提实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯 键。 2）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作 时应戴手套。
（三）核酸的浓缩、沉淀和洗涤
真空干燥；固体聚乙二醇；正丁醇浓缩法；沉淀法 有机溶剂沉淀是浓缩核酸最常用的方法，通过洗涤去 除共沉淀的盐。 主要用于：
避免反复冻融产生的机械剪切力，采取小量分装。
核酸的分离与纯化总论小结
• 核酸分离、纯化原则
• 保持核酸分子一级结构的完整性 • 保证纯度
• 分离提取核酸的主要步骤
•核酸的释放：细胞的破碎 •核蛋白的解聚、变性，蛋白质的去除 •核酸的浓缩、沉淀和洗涤 •核酸的浓度测定 •核酸的保存
基因组DNA的分离纯化
①改变核酸的溶解缓冲液； ②重新调整核酸的浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。
1
盐 MgCl2 NaAc
用于核酸沉淀的盐类及浓度
贮存液浓度 终浓度 加入体积比（V盐/V核酸溶液） (mol/L) （mol/L) 1 3 (pH5.2) 0.01 0.3 1/100 1/10