无胶筛分毛细管电泳法检测DNA的条件优化

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慢，由于电压过低，无法体现分离优势。相反，随着电压升高 则 迁移速度加快，分离 时 间 减 少，分 离 效 果 相 应 提 高。 但 当 分 离 电压过高≥１５ｋＶ 时，分离效果又降低。因 此 选 择 最 优 分 离 电 压 为 １０ｋＶ。
图２ 缓冲液 ｐＨ 优化曲线 ４．电 泳 条 件 优 化 后 的 分 离 结 果 通 过 以 上 主 要 条 件 的 优化，以及 ＤＮＡ 浓度、毛 细 管 温 度、毛 细 管 内 径、进 样 方 式 及 进样电压的微调，最后选择在电泳缓冲液ｐＨ 值７．９、进样电压 １０ｋＶ、运 行 电 压 １０ｋＶ、ＰＶＰ 浓 度 ４％、毛 细 管 温 度 ２５ ℃、 ＴＡＰＳ浓度为８０ｍｍｏｌ／Ｌ，在内径为５０μｍ 的非涂层毛细管 上 进行负 极 向 正 极 的 电 泳，ＤＮＡ 分 子 质 量 标 准 φＸ１７４ＤＮＡ／ ＢＳＵＲＩ（ＨａｅⅢ）７２～１ ３５３ｂｐ １１ 个 目 的 片 段 峰 全 部 实 现 了 有 效 分 离 ，结 果 见 图 ３。
文献报道，低分子质量 ＰＶＰ 具有动态涂渍作用，而本组 的 实 验 结果显示，高分子质 量 ＰＶＰ 具 有 动 态 涂 渍 作 用 和 筛 分 作 用 的 双层功效。动态涂层 抑 制 了 电 渗 流 的 产 生，使 得 具 有 相 同 质／ 荷比的 ＤＮＡ 分子具有相同的迁 移 速 度；而 高 分 子 质 量 使 得 其 筛分作用将不同大小的 ＤＮＡ 得 以 分 离。 尽 管 如 此，筛 分 介 质 ＰＶＰ 的浓度需要 优 化，浓 度 太 低 或 太 高 都 不 利 于 分 离［８］。 从 图１可以看出，随着 ＰＶＰ 浓度的升高，ＤＮＡ 分 离 度 相 应 升 高， 这是因为筛分介质的浓度增大使得相应“筛孔”孔径变小，使 不 同大小 ＤＮＡ 片段之间差异增大 即 增 大 了 选 择 性，从 而 分 离 度 提高，但是如果 ＰＶＰ 浓 度 过 高，大 于 ５％，导 致 分 离 缓 冲 液 黏 度增加，ＤＮＡ 分子的迁移时间延长，灌柱和冲洗难度 也 相 应 增 大。缓冲液最优 ｐＨ 值的选择也必不可少，对 分 离 效 果 影 响 明 显，缓冲液 ｐＨ 值影响毛细管内表面的状态，ｐＨ 值较高时 内 表 面存在大量硅羟基，与 ＤＮＡ 分子相 互 作 用 影 响 分 离，同 时 ｐＨ 值也影响 ＤＮＡ 的荷 电 状 态，影 响 其 迁 移 速 度，从 而 改 变 分 离 度。从图２可以看出，当 ｐＨ 值 较 低，由 于 不 利 于 缓 冲 溶 液 中 筛分介质 ＰＶＰ 和毛细管内壁形成稳定的动态涂层而分 离 效 率 降低；但当缓冲溶液 ｐＨ 值 ≥８．１ 时，不 但 ＤＮＡ 分 子 所 带 的 电 荷发生改变，而且 双 链 ＤＮＡ 分 子 会 发 生 解 链 现 象，影 响 分 离 效果，因此本实验最终选择 ｐＨ７．９。还有１个很重要的影响因 素 是 分 离 电 压，高 电 压 对 分 离 的 影 响 主 要 表 现 在 以 下 两 方 面， 一是对电泳淌度 的 影 响，电 压 高 迁 移 速 度 加 快，使 各 ＤＮＡ 片 段迁移速率的差别 减 小，分 离 选 择 性 变 差；另 一 方 面，ＤＮＡ 在 电泳时会沿电场方向定向伸展，这种伸展在低电场时对分离 影 响不大，但随电场强 度 增 加，伸 展 程 度 增 大，分 离 度 变 差，而 且 随着电压升高产生的焦耳热的增加也会妨碍分离，随着电压 增 高，大 于 １５ｋＶ 时，分 离 度 呈 下 降 趋 势；但 是 电 压 过 低 （≤８ ｋＶ）时，会使组分迁移时间延长，也 不 利 于 分 离，因 此 需 要 选 择 最优分离电压。
图３ 优化后的 φＸ１７４ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ电泳图谱 ５．毛细管电泳检测 ＤＮＡ 重复性实验 同 一 ＤＮＡ 分 子 质量标准重复做８次毛细管电泳，观察出峰时间。结果显示 平 均 出 峰 时 间 变 异 系 数 为 １．１％ ，具 有 较 好 的 重 现 性 。
讨 论 ＣＥ 是一类以 直 径 为 几 十 到 几 百 微 米 的 毛 细 管 为 分 离 通 道 ，在 高 压 直 流 电 场 作 用 下 依 据 目 的 离 子 的 大 小 、电 荷 数 量 、符 号及电位不同，导致 迁 移 速 率 不 同 而 分 离 的 电 泳 技 术［６］，对 于 ＤＮＡ 的 分 离 ，ＣＧＥ 有 其 显 著 的 优 势［５，７］，凝 胶 有 效 阻 止 了 电 渗 流的产生，使不同体积的溶质分子在起“分子筛”作用的凝胶 中 得以分离，分离速度只 与 目 的 分 子 的 分 子 质 量 大 小 有 关，因 此 分 离 效 率 大 大 提 高 ，而 缺 点 是 制 柱 技 术 要 求 高 ，易 产 生 气 泡 ，重 现性不理想，且柱子寿命较短，而限制了其广泛应用；无胶筛 分 毛 细 管 电 泳 技 术 克 服 了 上 述 缺 点 ，以 非 交 联 的 高 分 子 聚 合 物 溶 液作筛分介质，制备相对简单，操作简便，每次运行后筛分介 质 可 以 替 换 ，不 存 在 寿 命 问 题 ，与 凝 胶 电 泳 相 比 具 有 明 显 优 势 ，具 有 更 好 的 应 用 前 景 。 ［８－９］ 在 无 胶 筛 分 毛 细 管 电 泳 模 式 中 ，筛 分 介 质பைடு நூலகம்的 选 择 是 电 泳 中 的关键，同时具备低黏 度、动 态 涂 层 能 力 和 高 筛 分 性 能 是 理 想 选择［８］。目前应用于毛细管无胶筛分电泳的聚合物，在进行 电 泳前几乎都要对毛细管壁进行涂层处理。但在进行管壁涂层 操作时由于涂层条件繁琐且苛刻，涂层效果往往不太理想。 本 实验选择高分子质 量 聚 合 物 ＰＶＰ 作 为 无 胶 筛 分 介 质，该 分 子 同时含有亲水基团和亲油基团，可溶于水和多种有机溶剂。 有
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国际检验医学杂志２０１０年１２月第３１卷第１２期 Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１０，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．１２
· 新 技 术 、试 剂 与 设 备 ·
无胶筛分毛细管电泳法检测 ＤＮＡ 的条件优化＊
俞 娟１，２ ，丛 辉１ ，施 秀 英１ ，卢 美 红１ ，杨 曙 梅１ ，王 跃 国１ ，王 惠 民１△ （南 通 大 学 ：１．附 属 医 院 检 验 医 学 中 心 ；２．公 共 卫 生 学 院 ；江 苏 南 通 ２２６００１）
２．试剂 ＤＮＡ 分 子 质 量 标 准 φＸ１７４ＤＮＡ／ＢＳＵＲＩ（Ｈａｅ Ⅲ）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司产 品 ）、ＰＶＰ（相 对 分 子 质 量 为 １ ３００ ０００， 上海晶纯公司产 品 ）、三 羟 基 甲 基 氨 基 丙 烷 磺 酸 （ＴＡＰＳ，上 海 晶纯公司）、荧光染料 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ（上海基星公司）。
图１ ＰＶＰ 浓度优化曲线
２．缓冲溶液 ｐＨ 值 选 择 由 图 ２ 可 看 出，当 缓 冲 溶 液 ｐＨ 值为７．９时，分离效率最优，而当 ｐＨ 值较低（≤７．６）和 ｐＨ 值较高（＞８．１）时，均影响分离效果，本实验选择缓冲溶液 最 优 ｐＨ 值为７．９。
３．分离电压选择 ＤＮＡ 片段的迁移时间随着 分 离 电 压 的升高而降低，当分离电压≤８ｋＶ 时，电压 越 低 则 迁 移 速 度 越
结 果
１．ＰＶＰ 浓度优化 ＰＶＰ 浓 度 优 化 曲 线 见 图 １。 从 图 １ 可以看出，ＰＶＰ 浓度在１％～４％ 之 间，聚 合 物 浓 度 越 高，ＤＮＡ 电泳迁移的时间 越 长，即 ＤＮＡ 分 离 所 需 时 间 越 长，分 离 效 果 也越好；而当 ＰＶＰ 浓度≥５％时，虽然分离度增加，但 基 线 开 始 不稳，噪音变大，且毛细管易堵塞，使冲洗更换变得不易。 本 实 验最终选择 ＰＶＰ 浓度４％为最优筛分介质浓度。
【关 键 词 】 电 泳 ，毛 细 管 ； ＤＮＡ； 无 胶 筛 分 毛 细 管 电 泳 ； 条 件 优 化 ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－４１３０．２０１０．１２．０６８ 中图分类号：Ｒ４４６．１ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１６７３－４１３０（２０１０）１２－１４６６－０３
４．样 品 处 理 ＤＮＡ 分 子 质 量 标 准 φＸ１７４ＤＮＡ／ＢＳＵＲＩ （ＨａｅⅢ ），用 双 蒸 水 稀 释 １０ 倍 。
５．分析步骤 １）毛细管活 化：１ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ以 ２０ｐｓｉ压
力 冲柱３０ｍｉｎ，再用去离子水以２０ｐｓｉ压力冲５ｍｉｎ；２）电泳缓 冲液以２０ｐｓｉ压力冲柱３ｍｉｎ，再 用 分 离 缓 冲 液 以 ４０ｐｓｉ压 力 冲３ｍｉｎ（灌柱），１０ｋＶ ２０ｓ电 压 进 样，１０ｋＶ 恒 压 （由 负 极 向 正 极 运 行 ）２０ ｍｉｎ；３）２ 次 分 离 间 用 去 离 子 水 以 ４０ｐｓｉ压 力 冲 柱 ４ ｍｉｎ，然 后 按 步 骤 ２）操 作 。
６．优化实验 主要分析了影响分离的３个因素：分 离 缓 冲液中 ＰＶＰ 的 浓 度、电 泳 缓 冲 液 的 ｐＨ 值 和 运 行 电 压。 每 次 实验只观察１个影响因素，其他因素相对固定。１）分离缓 冲 液 中 ＰＶＰ 的浓度：在分离电压１０ｋＶ、缓冲液 ｐＨ 值 ７．９、毛 细 管 温度２５ ℃条件下，比较了不同 ＰＶＰ 浓度对分离的影 响。ＰＶＰ 的浓度（ｍ／ｖ）分别为１％、３％、４％、５％、６％。２）电泳 缓 冲 液 的 ｐＨ 值：在分离电压 １０ｋＶ、毛 细 管 温 度 ２５ ℃、ＰＶＰ 的 浓 度 为 ４％条件下，比较 了 不 同 电 泳 缓 冲 液 的 ｐＨ 值 （７．６、７．９、８．１、 ８．３）对分离的影响。３）运 行 电 压：在 ＰＶＰ 浓 度 为 ４％、缓 冲 液 ｐＨ 值７．９、毛细管温 度 ２５ ℃ 条 件 下，比 较 了 不 同 运 行 电 压 （８ ｋＶ、１０ｋＶ、１５ｋＶ、２ ０ｋＶ）对 分 离 的 影 响 。
毛细管电泳（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＣＥ），又 称 高 效 毛 细 管 电 泳 （ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＨＰＣＥ），是 ２０世纪８０年代问世的一种 高 效 液 相 分 离 法［１］。ＣＥ 作 为 一 种 高效、微量、高灵敏度 及 自 动 化 的 分 离 分 析 方 法，已 在 医 学、生 物 学 、生 命 科 学 等 领 域 引 起 广 泛 关 注 。 ［２－３］ 对 于 ＤＮＡ 的 分 离 ， 通常采用传统琼脂糖 凝 胶 电 泳，但 由 于 其 分 离 能 力 的 局 限 性， 限制了它 的 广 泛 应 用［４］。 毛 细 管 凝 胶 电 泳 （ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｇｅｌ ｅｌｅｃ－ ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＣＧＥ）于是应运而 生［５］，不 同 体 积 的 溶 质 分 子 在 起 “分子筛”作用的凝胶 中 进 行 分 离，效 率 大 大 提 高，但 缺 点 是 制 柱要求高、易产生气泡、重复性差、柱寿命短。无胶筛分毛细 管 电泳，以非交联的高分 子 聚 合 物 作 为 筛 分 介 质，便 于 灌 入 和 冲 出毛细管，分离效果 可 与 ＣＧＥ 相 媲 美，且 易 实 现 分 离 自 动 化。 本组在以 高 分 子 质 量 聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮 （ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎ， ＰＶＰ）作为筛分介质的前 提 下，ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ 作 为 荧 光 染 料， 采用激光诱导 荧 光 检 测，在 非 涂 层 的 毛 细 管 柱 上 探 讨 了 分 离 φＸ１７４ＤＮＡ／ＢＳＵＲＩ（ＨａｅⅢ）标准１１个 ＤＮＡ 片 段 的 无 胶 筛 分 电泳的最适条件。
＊ 基金项目：江苏省医学重点学科资助（ＸＫ２００７２３）；南通大学附属医院基金（Ｔｄｆｙ０９２９）。 △ 通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｔｆｙｊｙｋ＠ｐｕｂｎｔ．ｊｓｉｎｆｏ．ｎｅｔ。
国际检验医学杂志２０１０年１２月第３１卷第１２期 Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１０，Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．１２
３．电泳缓冲液及分离缓冲液 的 制 备 电 泳 缓 冲 液 为 ８０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎ－３－（羟 甲 基 ）甲 基 氨 丙 磺 酸 （Ｎ－ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ，ＴＡＰＳ），用 １ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 调节 ｐＨ 值分别为７．６、７．９、８．１、８．３ 的 缓 冲 溶 液；分 离 缓 冲 液 为含 ＰＶＰ 和 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ⅰ（１∶１０ ０００稀释）的 ＴＡＰＳ液（８０ ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ ７．９），ＰＶＰ 的 浓 度 分 别 为 １％、３％、４％、５％、６％ （ｍ／ｖ）。
资料与方法
１．仪器 Ｐ／ＡＣＥＴＭ ＭＤＱ 高 效 毛 细 管 电 泳 仪 （Ｂｅｃｋ－ ｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，美国）；４８８ｎｍ 氩 离 子 激 光 器 （Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， 美国）；３２ ＫａｒａｔＴＭ Ｓｏｆｔｗａｒｅ 数 据 处 理 软 件 （Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌ－ ｔｅｒ）；熔融石英毛细管：内 径 ５０μｍ（河 北 永 年 锐 沣 色 谱 器 件 有 限公司）；ｐＨ 计：ＰＨＳＪ－４Ａ 型 （上 海 精 密 科 学 仪 器 有 限 公 司 ）； 电 子 分 析 天 平 ：ＦＡ１００４（上 海 衡 平 科 学 仪 器 有 限 公 司 ）。