第二章_沉淀法
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Hale Waihona Puke 中性盐沉淀蛋白质的基本原理：
蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2 和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成 水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水 胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极 性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲 和力越大，因而溶解度也越大。 亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷层和水化膜。 因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加 入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水 区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即 形成沉淀。盐析示意图如下页图 所示。
②
硫酸铵盐析
A．固体法：最常用的是固体硫酸铵加入法。 将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地 加入粗制品溶液中，接近计划饱和度时，加盐 的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度 过大而造成不应有的蛋白质沉淀。在此过程 中，溶液中的硫酸铵的浓度会不断提高，水分 子会不断与硫酸铵结合，当加入的硫酸铵使溶 液浓度达到“盐析点”时，蛋白质就沉淀出来。
二、制备蛋白质 影响蛋白质溶解度的外界因素：
溶液的pH 离子强度 介电常数 温度 主要类型： 1.盐析法 2.有机溶剂沉淀法 3.蛋白质沉淀法 4.聚乙二醇沉淀法 5.选择性沉淀法 6.结晶沉淀法
1．盐析法
盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中溶解度会随 盐浓度的增高而上升，当盐浓度增高到一定数值时， 其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出(盐析)。
B.作盐析曲线
将每个分级沉淀 部分分别重新溶解 于一定体积的适宜 pH缓冲液中， 根据其蛋白质或 酶含量和相对应的 硫酸铵浓度之间的 关系作图， 即可得到如图2-1 所示的典型盐析曲 线。
C.确定最佳盐析范围 在此曲线基础上，参照表2-3的分级试验方法，可根据生 物材料来源的难易程度，以及对有效成分纯度和收得率的需 求，先找出有利于提高纯化倍数或得率的大致分级框架，然 后经过反复试验就能确定最佳盐析范围。
第二章
沉淀法
沉淀法（即溶解度法）它是古老、实用、 简单的初步分离的方法，该法成本低、操作简 单，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的 的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是 制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀， 将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相， 而与杂质得到初步的分离。
目的与要求
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
B．饱和溶液法
这是一种使蛋白质脱水沉淀比较温和的力法。其操作 是在蛋白质溶液中逐步加人预先调好pH的饱和硫酸铵溶液， 不同饱和硫酸铵溶液，不同饱和度所需的硫酸铵的量可用下 列公式表示：
V＝V0
S2－S1 S3－S2
V表示需要加入硫酸铵溶液的体积(ml)； V0表示原来溶剂的体积(m1)； S1和S2含义同上； S3表示需要加入硫酸铵溶液的饱和度(一般用百分之百)。
如，在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱和 度达35％时，尿素酶基本上仍留在溶液中；而饱 和度达55%时，尿素酶几乎全都沉淀出来。
名 称 沉 淀 效 果（25℃） 硫酸铵饱和度/% 0—25 25—35 35—45 45—55 55—65 沉淀物的酶活力单位/U 0 112 6850 3020 27
(2)盐析曲线制作
用盐析法沉淀欲分离样品时，所需浓度范围要通过试验确 定。 具体步骤如下：
A. 分级沉淀
取一定体积已测含量之蛋白质或酶的待分离溶液，调节pH 至稳定范围，分6~10次加入不同量的硫酸铵： 第一次加硫酸铵到溶液出现微弱混浊状态时，静置一段时 间，离心或过滤即得到第一个分级沉淀部分。 接着以同样的操作加硫酸铵到上清液或过滤液中，则得到第 二个分级沉淀部分。 如此连续进行，便可得到6~10个分级沉淀部分。
⑵有机溶剂的选择和浓度的计算 用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要 能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、 甲醇和丙酮。 为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用 溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原 溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。
用有机溶剂沉淀蛋白质时，需加入的有机溶剂量， 一般是以体积为单位按下列公式计算：
硫酸铵沉淀尿素酶的作用
盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心 与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫 酸铵常用过滤方法。各种饱和度下需加固体硫酸铵的量。 （1）、计算法 X=G（p2-p1）/1-Ap2 G为经验常数，0℃ 515，20 ℃ 513 A为常数 0 ℃ 0.27 20 ℃ 0.29 P2、P1为初始和最终溶液的饱和度 X为1L溶液所需加入的硫酸铵的克数 （2）、查表法
从表2-3可以看出， 若生物材料来源容易，主要是考虑提高纯化倍数时，选择48 ％-65％盐饱和分级范围，酶的纯化倍数可达3.0，而得率仅为75 ％； 若生物材料来源较困难，主要是考虑提高收得率时，则选择 45％~70％甚至45％~75％盐饱和分级范围，酶的收得率可达80 ％以上，而纯化倍数将≤2．4。
由下表可以看到， 硫铵在0℃时的溶解度，远远 高于其它盐类： 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
0℃ （NH4)2SO4 Na2SO4 NaH2PO4 70.6 4.9 1.6 20℃ 75.4 18.9 7.8 80℃ 95.3 43.3 93.8 100 ℃ 103 42.2 101
（1）盐分级沉淀 一般操作过程：选择一定浓度范围的盐溶液 （０～２５％饱和度），使部分杂质 呈盐析状 态，有效成分呈盐溶状态。经离心分离得到上清 液，再选择一定浓度范围的盐溶液（ ２５～６０ ％饱和度），使有效成分呈盐析状态，而另部分杂 质呈盐溶状态，离心法收集沉淀物即为初步纯化的 有效成分物质
(4)脱盐
常用的脱盐方法：凝胶过滤法、透析 法。(前者的原理及操作将在第六章阐 述)， 透析法的原理是分子扩散运动。 其具体操作是：把待脱盐溶液装入有 一定孔径的透析袋，扎紧袋口(袋内留有 适当空间)，漂在水或适当的透析液中。
①透析袋处理 市场购买的透析袋(或透析纸)要用蒸馏 水洗净，严格检查，无漏洞时，即可使用。 但是，样品中所含盐类易被金属或水解酶等破坏之时， 透析袋需要用下列方法处理： 将10cm长的透析袋置500ml含lmmol／L EDTA-Na2的2 ％碳酸氢钠溶液中煮沸10min，用干净镊子或戴橡皮手套 取出，经蒸馏水煮沸、漂洗后，即可使用。用过的透析 袋依上述方法处理一下，还能重复使用，若不马上使用 时，可于室温凉干，移入盒中存放(切忌受压)，还可泡 在蒸馏水中或50％的乙醇中置低温(4℃)保存。
④蛋白质的纯度和浓度
一般控制样品液蛋白浓度在0.2％—2％为宜。 (蛋白质浓度越高，共沉淀现象越明显，分离效果越 差）
⑤其他
在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加 1mmol／L的EDTA-Na2盐，以除去沉淀剂中带 入的金属离子。 再者是加硫酸铵沉淀的时间要控制好，过长 过短都不适宜，一般需要2h左右。
(3)盐析的影响因子
①盐析常数(KS)
实验证明，每种蛋白质在溶液中的溶解度和该溶液的 盐浓度之间存在下列关系，即溶解度(S，以mg／ml表 示)的对数值与溶液中盐的浓度(M)成反比例关系，可 用下面的公式表示： lgS=β- KS·M 式中，S表示有效成分在水中的溶解度； M表示摩尔浓度； KS表示有效成分在特定条件下的恒定值 (见表2-4)，其大小即表示有效成分之溶 解度降低的速率与盐浓度的关系。
当分离两种以上蛋白质时，若每一种蛋白质的KS值都很大， 而且盐析范围(盐离子强度)差异明显，则分离效果好(见图2-2 中A和C)；若KS值很大，但盐析范围差异较小，则分离效果 不好(见图2-2中A和B)。
③pH和盐浓度
选择适当pH的盐溶液，可以大大提高盐析 有效成分的效果
一般来说， 在第一次盐析时(即除去杂质)，盐溶液pH应偏离有效 成分的pI值，靠近杂质的pI值； 在第二次盐析时(分级盐析范围内，即沉淀有效成 分)，盐溶液pH应调至接近有效成分的pI值。
②分级效果好，有些抽提液经过加适量硫酸铵的一步分级 沉淀处理后，就可除去杂蛋白75％以上； ③有稳定蛋白质结构的作用，将2-3 mol／L硫酸铵盐析 的蛋白质置低温下保存一年，其性质没有变化； ④价格低廉，废液可以肥田。 但是用硫酸铵或其他盐类进行分级沉淀都有一个共 同的缺点，即得到的样品欲继续纯化时，需花一定时 间脱盐。
此法比加入固体硫酸铵沉淀法温和，但是对 于大体积样品不适用。因为硫酸铵溶液的大量加 入，将导致样品溶液体积增加。例如，当样品达 到50％硫酸铵饱和度时，其体积增加一倍。
C．透析法：
将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体积盐溶 液中，通过透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度。此法 的盐浓度是以连续状态变化的，可以避免盐浓度局部升高 产生的不良影响，所以分离效果好。但是，在实际应用过 程由于受透析袋容积有限、盐析速度缓慢和硫酸铵耗费多 等因子的制约，所以此法仅在要求较精确、样品体积小的 试验使用。
V表示加入有机溶剂的体积； Vo表示蛋白溶液的原始体积； S1表示蛋白溶液中有机溶剂的浓度(体积百分浓度)； S2表示蛋白溶液中欲达到的有机溶剂浓度(体积百分浓度)。
2 、有机溶剂沉淀法
⑴基本原理
有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子 生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其 原理主要是： ①降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶 液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白 质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。 ②脱水作用：由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于 水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了 蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。
KS 值大，则意味着有效成分溶解度降低的速度是随着盐浓度 的增加而快速降低(即沉淀加快)。 因此，对一种有效成分而言， KS 值越大，分级范围越窄，盐 析效果就越好。 某一蛋白质的 KS 值不仅与蛋白质本身的性质有关，而且也会 受溶液的pH、温度和盐的种类等因子的影响。
②盐分级范围的差异性
①盐的选择 一般进行蛋白质沉淀时，常选用是硫酸铵。因为 硫酸铵与其他盐(如氯化钠、硫酸钾等)相比，具以下 优点： ①溶解度大，对温度不敏感，当水的温度是25℃ 时，硫酸铵的饱和溶解度(即每升溶剂可溶解盐的克 数)为769g(其摩尔浓度为4.1mol／L)，当水的温度降 至0℃时，其饱和溶解度高达679g(其摩尔浓度为 3.9mol／L) 这是其他盐类所不具备的。由于酶和各 种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求 在低温下（0～4℃）进行。
②透析液选择
一般选用的透析液均为低离子强度的中性缓冲液。对含有辅 基的酶透析时，在透析液中宜加入适量的辅基或保护辅基的试剂。 为了防止微生物生长，透析应在4℃进行或在透析液中添加0.02 ％NaN3。
③掌握透析时间
透析操作在搅拌下进行时，样品液与透析体积之比以l：10 较好，一般3h可达平衡。若透析在静止状态下过夜进行时，则比 例应扩大到1：20以上。脱盐是否彻底，要经常检查：如除去的 是硫酸铵，可用10％氯化钡检查；如除去的是氯化钠，可用10％ 硝酸银检查，直到透析液中检测不出硫酸钡或氯化银沉淀为止， 即透析已完成。
何谓盐析？其原理是什么？ 盐析法纯化蛋白质的优点有哪些？ 盐析的一般操作步骤是什么？影响盐析 的主要因素有哪些？ 有机溶剂沉淀法的原理是什么？
第一节
一、基本原理
基本原理与沉淀类型
沉淀法也称溶解度法。其纯化生命大分子物质的 基本原理是，根据各种物质的结构差异（如蛋白质分 子表面疏水基团与亲水基团之间比例的差异）来改变 溶液的某些性质(如pH、极性、离子强度、金属离子 等)，就能使抽提液中的有效成分的溶解度发生变化。 因此，选择适当的溶液就能使欲分离的有效成分呈现 最大溶解度，而使杂质呈现最小溶解度，或者相反， 有效成分呈现最小溶解度，而杂质呈现最大溶解度。
蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2 和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成 水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水 胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极 性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲 和力越大，因而溶解度也越大。 亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷层和水化膜。 因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加 入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水 区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即 形成沉淀。盐析示意图如下页图 所示。
②
硫酸铵盐析
A．固体法：最常用的是固体硫酸铵加入法。 将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地 加入粗制品溶液中，接近计划饱和度时，加盐 的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度 过大而造成不应有的蛋白质沉淀。在此过程 中，溶液中的硫酸铵的浓度会不断提高，水分 子会不断与硫酸铵结合，当加入的硫酸铵使溶 液浓度达到“盐析点”时，蛋白质就沉淀出来。
二、制备蛋白质 影响蛋白质溶解度的外界因素：
溶液的pH 离子强度 介电常数 温度 主要类型： 1.盐析法 2.有机溶剂沉淀法 3.蛋白质沉淀法 4.聚乙二醇沉淀法 5.选择性沉淀法 6.结晶沉淀法
1．盐析法
盐析法的根据是蛋白质在稀盐溶液中溶解度会随 盐浓度的增高而上升，当盐浓度增高到一定数值时， 其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出(盐析)。
B.作盐析曲线
将每个分级沉淀 部分分别重新溶解 于一定体积的适宜 pH缓冲液中， 根据其蛋白质或 酶含量和相对应的 硫酸铵浓度之间的 关系作图， 即可得到如图2-1 所示的典型盐析曲 线。
C.确定最佳盐析范围 在此曲线基础上，参照表2-3的分级试验方法，可根据生 物材料来源的难易程度，以及对有效成分纯度和收得率的需 求，先找出有利于提高纯化倍数或得率的大致分级框架，然 后经过反复试验就能确定最佳盐析范围。
第二章
沉淀法
沉淀法（即溶解度法）它是古老、实用、 简单的初步分离的方法，该法成本低、操作简 单，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的 的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是 制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀， 将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相， 而与杂质得到初步的分离。
目的与要求
调整硫酸铵溶液饱和度计算表
B．饱和溶液法
这是一种使蛋白质脱水沉淀比较温和的力法。其操作 是在蛋白质溶液中逐步加人预先调好pH的饱和硫酸铵溶液， 不同饱和硫酸铵溶液，不同饱和度所需的硫酸铵的量可用下 列公式表示：
V＝V0
S2－S1 S3－S2
V表示需要加入硫酸铵溶液的体积(ml)； V0表示原来溶剂的体积(m1)； S1和S2含义同上； S3表示需要加入硫酸铵溶液的饱和度(一般用百分之百)。
如，在尿素酶抽提液中加入固体硫酸铵，当饱和 度达35％时，尿素酶基本上仍留在溶液中；而饱 和度达55%时，尿素酶几乎全都沉淀出来。
名 称 沉 淀 效 果（25℃） 硫酸铵饱和度/% 0—25 25—35 35—45 45—55 55—65 沉淀物的酶活力单位/U 0 112 6850 3020 27
(2)盐析曲线制作
用盐析法沉淀欲分离样品时，所需浓度范围要通过试验确 定。 具体步骤如下：
A. 分级沉淀
取一定体积已测含量之蛋白质或酶的待分离溶液，调节pH 至稳定范围，分6~10次加入不同量的硫酸铵： 第一次加硫酸铵到溶液出现微弱混浊状态时，静置一段时 间，离心或过滤即得到第一个分级沉淀部分。 接着以同样的操作加硫酸铵到上清液或过滤液中，则得到第 二个分级沉淀部分。 如此连续进行，便可得到6~10个分级沉淀部分。
⑵有机溶剂的选择和浓度的计算 用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要 能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、 甲醇和丙酮。 为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用 溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原 溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。
用有机溶剂沉淀蛋白质时，需加入的有机溶剂量， 一般是以体积为单位按下列公式计算：
硫酸铵沉淀尿素酶的作用
盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心 与过滤。在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫 酸铵常用过滤方法。各种饱和度下需加固体硫酸铵的量。 （1）、计算法 X=G（p2-p1）/1-Ap2 G为经验常数，0℃ 515，20 ℃ 513 A为常数 0 ℃ 0.27 20 ℃ 0.29 P2、P1为初始和最终溶液的饱和度 X为1L溶液所需加入的硫酸铵的克数 （2）、查表法
从表2-3可以看出， 若生物材料来源容易，主要是考虑提高纯化倍数时，选择48 ％-65％盐饱和分级范围，酶的纯化倍数可达3.0，而得率仅为75 ％； 若生物材料来源较困难，主要是考虑提高收得率时，则选择 45％~70％甚至45％~75％盐饱和分级范围，酶的收得率可达80 ％以上，而纯化倍数将≤2．4。
由下表可以看到， 硫铵在0℃时的溶解度，远远 高于其它盐类： 几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
0℃ （NH4)2SO4 Na2SO4 NaH2PO4 70.6 4.9 1.6 20℃ 75.4 18.9 7.8 80℃ 95.3 43.3 93.8 100 ℃ 103 42.2 101
（1）盐分级沉淀 一般操作过程：选择一定浓度范围的盐溶液 （０～２５％饱和度），使部分杂质 呈盐析状 态，有效成分呈盐溶状态。经离心分离得到上清 液，再选择一定浓度范围的盐溶液（ ２５～６０ ％饱和度），使有效成分呈盐析状态，而另部分杂 质呈盐溶状态，离心法收集沉淀物即为初步纯化的 有效成分物质
(4)脱盐
常用的脱盐方法：凝胶过滤法、透析 法。(前者的原理及操作将在第六章阐 述)， 透析法的原理是分子扩散运动。 其具体操作是：把待脱盐溶液装入有 一定孔径的透析袋，扎紧袋口(袋内留有 适当空间)，漂在水或适当的透析液中。
①透析袋处理 市场购买的透析袋(或透析纸)要用蒸馏 水洗净，严格检查，无漏洞时，即可使用。 但是，样品中所含盐类易被金属或水解酶等破坏之时， 透析袋需要用下列方法处理： 将10cm长的透析袋置500ml含lmmol／L EDTA-Na2的2 ％碳酸氢钠溶液中煮沸10min，用干净镊子或戴橡皮手套 取出，经蒸馏水煮沸、漂洗后，即可使用。用过的透析 袋依上述方法处理一下，还能重复使用，若不马上使用 时，可于室温凉干，移入盒中存放(切忌受压)，还可泡 在蒸馏水中或50％的乙醇中置低温(4℃)保存。
④蛋白质的纯度和浓度
一般控制样品液蛋白浓度在0.2％—2％为宜。 (蛋白质浓度越高，共沉淀现象越明显，分离效果越 差）
⑤其他
在进行盐析沉淀时，有时需在溶液中加 1mmol／L的EDTA-Na2盐，以除去沉淀剂中带 入的金属离子。 再者是加硫酸铵沉淀的时间要控制好，过长 过短都不适宜，一般需要2h左右。
(3)盐析的影响因子
①盐析常数(KS)
实验证明，每种蛋白质在溶液中的溶解度和该溶液的 盐浓度之间存在下列关系，即溶解度(S，以mg／ml表 示)的对数值与溶液中盐的浓度(M)成反比例关系，可 用下面的公式表示： lgS=β- KS·M 式中，S表示有效成分在水中的溶解度； M表示摩尔浓度； KS表示有效成分在特定条件下的恒定值 (见表2-4)，其大小即表示有效成分之溶 解度降低的速率与盐浓度的关系。
当分离两种以上蛋白质时，若每一种蛋白质的KS值都很大， 而且盐析范围(盐离子强度)差异明显，则分离效果好(见图2-2 中A和C)；若KS值很大，但盐析范围差异较小，则分离效果 不好(见图2-2中A和B)。
③pH和盐浓度
选择适当pH的盐溶液，可以大大提高盐析 有效成分的效果
一般来说， 在第一次盐析时(即除去杂质)，盐溶液pH应偏离有效 成分的pI值，靠近杂质的pI值； 在第二次盐析时(分级盐析范围内，即沉淀有效成 分)，盐溶液pH应调至接近有效成分的pI值。
②分级效果好，有些抽提液经过加适量硫酸铵的一步分级 沉淀处理后，就可除去杂蛋白75％以上； ③有稳定蛋白质结构的作用，将2-3 mol／L硫酸铵盐析 的蛋白质置低温下保存一年，其性质没有变化； ④价格低廉，废液可以肥田。 但是用硫酸铵或其他盐类进行分级沉淀都有一个共 同的缺点，即得到的样品欲继续纯化时，需花一定时 间脱盐。
此法比加入固体硫酸铵沉淀法温和，但是对 于大体积样品不适用。因为硫酸铵溶液的大量加 入，将导致样品溶液体积增加。例如，当样品达 到50％硫酸铵饱和度时，其体积增加一倍。
C．透析法：
将盛蛋白质溶液的透析袋放入一定浓度的大体积盐溶 液中，通过透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度。此法 的盐浓度是以连续状态变化的，可以避免盐浓度局部升高 产生的不良影响，所以分离效果好。但是，在实际应用过 程由于受透析袋容积有限、盐析速度缓慢和硫酸铵耗费多 等因子的制约，所以此法仅在要求较精确、样品体积小的 试验使用。
V表示加入有机溶剂的体积； Vo表示蛋白溶液的原始体积； S1表示蛋白溶液中有机溶剂的浓度(体积百分浓度)； S2表示蛋白溶液中欲达到的有机溶剂浓度(体积百分浓度)。
2 、有机溶剂沉淀法
⑴基本原理
有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子 生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其 原理主要是： ①降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶 液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白 质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。 ②脱水作用：由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于 水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了 蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。
KS 值大，则意味着有效成分溶解度降低的速度是随着盐浓度 的增加而快速降低(即沉淀加快)。 因此，对一种有效成分而言， KS 值越大，分级范围越窄，盐 析效果就越好。 某一蛋白质的 KS 值不仅与蛋白质本身的性质有关，而且也会 受溶液的pH、温度和盐的种类等因子的影响。
②盐分级范围的差异性
①盐的选择 一般进行蛋白质沉淀时，常选用是硫酸铵。因为 硫酸铵与其他盐(如氯化钠、硫酸钾等)相比，具以下 优点： ①溶解度大，对温度不敏感，当水的温度是25℃ 时，硫酸铵的饱和溶解度(即每升溶剂可溶解盐的克 数)为769g(其摩尔浓度为4.1mol／L)，当水的温度降 至0℃时，其饱和溶解度高达679g(其摩尔浓度为 3.9mol／L) 这是其他盐类所不具备的。由于酶和各 种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求 在低温下（0～4℃）进行。
②透析液选择
一般选用的透析液均为低离子强度的中性缓冲液。对含有辅 基的酶透析时，在透析液中宜加入适量的辅基或保护辅基的试剂。 为了防止微生物生长，透析应在4℃进行或在透析液中添加0.02 ％NaN3。
③掌握透析时间
透析操作在搅拌下进行时，样品液与透析体积之比以l：10 较好，一般3h可达平衡。若透析在静止状态下过夜进行时，则比 例应扩大到1：20以上。脱盐是否彻底，要经常检查：如除去的 是硫酸铵，可用10％氯化钡检查；如除去的是氯化钠，可用10％ 硝酸银检查，直到透析液中检测不出硫酸钡或氯化银沉淀为止， 即透析已完成。
何谓盐析？其原理是什么？ 盐析法纯化蛋白质的优点有哪些？ 盐析的一般操作步骤是什么？影响盐析 的主要因素有哪些？ 有机溶剂沉淀法的原理是什么？
第一节
一、基本原理
基本原理与沉淀类型
沉淀法也称溶解度法。其纯化生命大分子物质的 基本原理是，根据各种物质的结构差异（如蛋白质分 子表面疏水基团与亲水基团之间比例的差异）来改变 溶液的某些性质(如pH、极性、离子强度、金属离子 等)，就能使抽提液中的有效成分的溶解度发生变化。 因此，选择适当的溶液就能使欲分离的有效成分呈现 最大溶解度，而使杂质呈现最小溶解度，或者相反， 有效成分呈现最小溶解度，而杂质呈现最大溶解度。