新疆杨叶肉原生质体游离和纯化的研究
玉米叶肉原生质体瞬时表达系统建立与优化
玉米叶肉原生质体瞬时表达系统建立与优化随着生物技术的不断发展，表达外源蛋白是生物制药领域和农业领域的重要研究内容。
原生质体瞬时表达系统是一种常用的蛋白表达技术，具有快速、简便、高效的特点。
本文将介绍玉米叶肉原生质体瞬时表达系统的建立与优化，希望能为相关研究提供一定的参考和借鉴。
一、玉米叶肉原生质体瞬时表达系统的建立1. 选材：选择适合原生质体注射的玉米品种，并进行对照实验，筛选出最适合的玉米品种。
2. 原生质体制备：对选定的玉米品种进行原生质体制备，采用酶解法或离心法，获得高质量的原生质体。
3. 质体注射：将目的基因载体注入原生质体，使目的基因载体与原生质体结合，形成重组质体。
4. 基因表达：经过一定时间的培养和处理，检测基因在质体内的表达情况，确定表达效果，并选取表达效果最好的基因进行优化。
二、玉米叶肉原生质体瞬时表达系统的优化1. 基因载体优化：对基因表达载体进行优化，如引入启动子、终止子、选择合适的启动子/终止子对基因进行调控。
2. 质体注射条件优化：探索最佳的质体注射条件，包括注射液的配制、渗透压、注射压力等因素。
3. 外源基因选择与优化：在选择外源基因时，考虑目的基因的大小、结构、稳定性等因素，进而优化外源基因的表达效果。
4. 生长调控剂的应用：在培养过程中添加适当的生长调控剂，如植物生长激素、营养液等，提高外源基因的表达。
5. 基因表达效果的检测与分析：通过蛋白质免疫印迹、荧光定量PCR等方法对外源基因的表达效果进行检测与分析，找出影响表达的关键环节。
三、玉米叶肉原生质体瞬时表达系统的应用前景1. 生物制药领域：玉米叶肉原生质体瞬时表达系统可用于大规模生产多肽类药物、抗体和疫苗等生物制药产品。
2. 农业领域：利用该系统表达抗病、抗虫、抗旱等相关基因，为农业生产提供技术支持。
3. 基因功能研究：该系统可用于外源基因的功能分析和相关途径研究。
总结：玉米叶肉原生质体瞬时表达系统的建立与优化对于蛋白表达和生物制药领域具有重要意义。
烟草叶肉原生质体分离与转化
烟草叶肉原生质体分离与转化植物原生质体的分离工作起始于上世纪60年代，英国植物病理学家Cooking首次用纤维素酶分离得到植物原生质体，在经过了前人的不断探索和技术创新之后，植物原生质体的分离,培养及转化技术已日渐成熟。
本实验以烟草为材料，进行原生质体分离转化方面的研究。
一、烟草叶肉原生质体的分离1、材料：温室中的烟草与进行无菌培养的烟草均可。
取材时需按以下标准进行：应取生长状态好的较大叶片，表现为颜色墨绿、充分伸展、叶片较为饱满。
若以无菌苗作为材料应注意去掉变黄及生长状态不好的叶片。
（因为无菌苗的叶片常常很小，需要数片叶片才能分离出足够量的原生质体）2、材料预处理。
（此步也可省略，但有关文献中指出预处理可使制得的原生质体活力增强，易于转化）一般将从温室中采来得叶片（通常较大叶片一片足够）在自来水中冲洗10min左右，（动作要轻微，防止弄伤叶片），然后用保鲜膜包好，置于4℃ 6-12小时。
（一般过夜）3、消毒。
将预处理过的叶片用剪刀小心剪成10mm2大小，置于盛有0.1%升汞的大培养皿中，浸泡8-10min。
再用无菌水冲洗4-5遍。
（放入叶片前，可在0.1%的升汞中加入几滴Tween20，用枪吹打混匀）4、酶解。
将消毒过的叶片用镊子夹取平放于灭菌的滤纸上，若使用无菌苗叶片，需用拇指与中指按住两端，右手拿单面保险刀片从叶片中间部位横切，将叶片切成0.5-1mm左右的细丝，然后立即用镊子将切好的叶片转入预先培好的酶液。
若使用温室苗的叶片，则需将消毒过的叶片平放于灭菌滤纸上，背面朝上，用左手固定住叶片，右手用尖头镊子小心撕去下表皮，后迅速转进酶液，背面朝下。
(注：切成细丝或撕去下表皮的叶片应马上转移入酶液)5、酶解处理。
不同搭配的酶液的最适温度与酶解时间各异。
实验发现烟草叶肉原生质体分离的最适酶液搭配为：cellulaseR-10. Macerozyme R-10.最适温度与酶解时间：26℃避光3-4h。
影响肉品质量的三个因素
动物生长期较短， 呈味物必然沉积量少， 尤其 快速出栏的动物。国外注重成分含量， 而我国则注 重其气味与滋味， 如慢速鸡的呈味物— ——肌甘酸是 快 速 鸡 的 １．５ 倍 ， 以 地 方 鸡 论 ， 乌 骨 鸡 含 量 最 高 ， 其次为白耳鸡、狼山鸡等； 母鸡高于公鸡， 人们之 所以喜欢食用母鸡， 可能就是这种原因。而北京黑 猪在肌甘酸方面则大于外来猪种。又有试验证实， 饲料选择有助于核甘酸的积累， 并可使背长肌中的 肌 甘 酸 明 显 提 高 达 ２１．７９％ ， 并 能 改 善 肉 的 品 质 。 据报道， 国外已有培育“大理石”样肉品新品种的 研究。
农产品加工 ３１ ２００７·２
安全与检测
Ａｎ ｑ ｕ ａｎ Ｙｕ Ｊ ｉａｎ ｃｅ 说， 肉鸡脂肪含量高于蛋白质， 影响了肉品品质的 提高。猪肉也发生同 样 的 变 化 ， 猪 肉 蛋 白 １９５２ 年 为 １６．７ ｇ， １９９１ 年则为 １３．２ ｇ， 仍呈下降趋势。
当前， 许多业主为了追求利润， 除滥用添加剂 外， 往往在动物出栏前加大脂肪含量高的饲料及高 热能饲料， 甚至饲喂酸败油脂， 有的还饲喂化肥 等， 使肉食出现高脂和异味， 除动物引发生理障碍 外， 肝脏往往肿大， 甚至有癌变发展的倾向， 对食 用者造成潜在危害。
Ｔｅｌ： ０３１１－ ８７６９９７７２ Ｅ－ ｍａｉｌ：ｘｕｃｈａｎｐｉｎ２００６＠１６３．ｃｏｍ
新疆杨愈伤组织原生质体的游离与纯化
［ 键词 ］ 新 疆杨 ； 伤 组 织 ； 生质体 ； 离； 化 关 愈 原 游 纯 ［ 图分 类 号 ］ Ｑ ４ 中 ９５ ［ 献标 识码 ］ Ａ 文 ［ 文章 编 号 ］ １０ — ０ ２２ １）１０ ４ — ４ ０ ９ ０ ０ （ １ — ０ ９ ０ ０ ０
胶酶 Ｙ ２ ＋ ． ｍｏ Ｌ甘 露 醇 ， 解 温度 ２ ℃ ， 一 ３ ０６ １ ／ 酶 ７ 酶解 时 间 ８ｈ 在 此 条件 下 ， 生质 体 产 量达 ８ ｘ Ｏ 个／ ｇ Ｆ ） 活 力 。 原 ． ｌ （ ・Ｗ ， ５ 达 ８． ３６ 原 生质 体 纯 化可 采 用 蔗 糖 等 密度 离 心 法 ， 适蔗 糖 浓度 为 ３ ％。 论 ： 究筛 选 出 的酶 解 因素组 合 与 等 密 ％。 较 ０ 结 研
ｒ ｃ ｔ ｎ ｏ ｒｔｐ ａ ｔ ｗ ｒ ｔ ｄ ｅ ．Ｍ ｅ ｈ ｄ ：Ｕｓ ｇ ｓｍｐ ｅ ｅ ｐ ｒ ｎａ ｅ ｉｎ ａ ｄ ｖ ｒ ｎ ｅ ａ ａ ｙ ｉ ｍｅｈ ｄ ｃ ｉ ａｉ ｆ ｐ ｏ ｏ ｌｓｓ ｅ ｅ ｓ ｉｄ ｉ ｆ ｏ ｕ ｔｏ ｓ ｉ ｉ ｌ ｘ ｅ ｉ ｎ ｍｅ ｔｌ ｄ ｓ ｎ ａ ａ ｃ ｎ ｌ ｓ ｔ ｏ ，ａ — ｇ ｉ ｓ ｃ ｒ ｉｇ ｔ ｈ ｎ ｕ ｎ ｅ ｆｃ ｏ ｓ ｏ ｒ ｔｐ ａ ｔ ｓ ｌ ｔ ｎ ｓ ｌｔ ｄ ｔ ａ ｄ ｍａ ｎ ｔｌ ｃ ｎ ｅ ｔａｉｎ ｏ ｒｔ ｐ ａ ｔ ｗｅｅ ｏ ｄ ｎ ｏ ｔ ｅ ｉ ｆ ｅ ｃ ａ ｔ ｒ ｆ ｐ ｏｏ ｌ ｓｓ ｉｏａｉ ，ｉｏａ ｅ ｉ ｌ ｏ ｍｅ ｎ ｎ ｉ ｏ ｃ ｎ ｒ ｔ ｆ ｐ ｏｏ ｌ ｓ ｒ ｏ ｏ ｓ ｓ ｄｅ ，ｂ ｓ ｇ Ｆ ｓ ｉ ｉ ｇ ｍｅｈ ｄ ｏ ｓ ｒ ｉ ｇ ｖ ａ ｉ ｔ ｆ ｃ ｌ ｐ ｏｏ ｌ ｓｓ ｔ ｉ ｄ ｙ ｕ ｉ ＤＡ ｔ ｎｎ ｔｏ ｂ ｅ ｖ ｎ ｉｂ ｌ ｙ ｏ ａｌ ｒ ｔｐ ａ ｔ．Ｒｅ ｕ ｔ ：Ｔ ｅ ｍｏｅ ａ ｐ ｏ ｒ ｔ ｉ ｌ ｕ ｎ ａ ｉ ｉ ｓ ｌｓ ｈ ｒ ｐ ｒ ｐ ａ ｅ ｙｅ ｄ ｉ
苘麻叶肉原生质体的分离和培养研究
和利用 已有悠 久历史 ， 为韧皮纤维 作物 ， 茎 皮产 生一种 长而强韧 的纤 维 ， 可用 来制 麻绳 、 麻 袋¨ ｊ ｌ ］ 。苘麻 可 以入
药 。全草味苦 ， 性平 ， 能 解毒 、 祛风 ， 治 痢疾 、 中耳炎 、 耳
鸣、 耳聋 、 关节酸痛等 。种子性 味甜 ， 无毒 ， 能清热利 湿 、
・
中草药 ・
北方 园艺 ２ ｏ １ ３ （ ｏ ７ ） ： １ ７ ０ ～ １ ７ ２
苘 麻 叶 肉原 生 质 体 的 分 离 和 培 养 研 究
徐 琴 ，王 晓 军 ，王 卉 ，刘 敏 ，郝 秀 英。
（ １ ． 中 国科学 院 新 疆理 化技 术研究 所 ， 新疆 乌鲁木 齐 ８ ３ ０ ０ １ １ ； ２ ． 中 国科 学 院 研究 生 院 ， 北京 １ ０ ０ ０ ３ ９
ＫＨ２ Ｐ Ｏ４ ２ ７ ． ２ ｍｇ ／ Ｌ、 ＫＮＯ３ １ ０ １ ｍｇ ／ Ｉ Ｍｇ Ｓ Ｏ， Ｉ ・７ Ｈ２ （ ） ２ ４ ６ ｍｇ ／ Ｌ、 ＫＩ １ ０ ． １ ６ ａｇ ｒ ／ Ｌ、 Ｃ ｕ Ｓ Ｏ ４・ ５ Ｈ２ Ｏ ０ ． ０ ２ ５ ａｇ ｒ ／ Ｉ
３ ． 新疆农 业科 学 院 微 生物应 用 研究 所 ， 新疆 乌鲁 木 齐 ８ ３ ０ ０ ９ １ ）
摘
要： 以苘麻 的叶片、 种子 为试材 ， 对苘麻 叶 肉原 生质体 游 离培 养过程 的影 响 因素进行 了
研 究。结果表 明： 采用无菌苗幼叶作为原 生质体分 离起始材料效果较好 ； 质壁分 离 ４ ｈ ， 纤维素酶
菌， 所有培养基 ｐ Ｈ 均为 ５ ． ８ ［ 。 表 １ 不 同 浓度 的酶 液 组合
１ ． ２ ． １ 野外采集叶片 的消毒
不同处理对新疆羊半腱肌嫩度的影响
不同处理对新疆羊半腱肌嫩度的影响作者：张文李芳达迪拉·买买提俞琴王琳张煜孔令明来源：《肉类研究》2016年第06期摘要：目的：寻求一种成本低、安全健康、嫩化效果好的嫩化方法。
方法：以剪切力、pH值、蒸煮损失、肌原纤维小片化指数（myofibrillar fraglllentation index，MFI）、胶原蛋白含量及其溶解度、羊半腱肌全骨架蛋白降解情况等为评价指标，研究腌制结合滚揉、真空滚揉及腌制结合真空滚揉对羊肉嫩度的影响。
结果表明：3 种处理对羊肉的剪切力、pH值、蒸煮损失、肌原纤维小片化指数均影响显著。
结论：采用真空滚揉对羊肉嫩化效果最佳。
关键词：腌制；真空；滚揉；羊肉；嫩度羊肉味甘、性温，能补血益气，温中暖肾，含有丰富的蛋白质、脂肪、磷、铁、钙、VB1、VB2和烟酸、胆甾醇等成分[1]。
羊肉的食用品质是指新鲜羊肉经加工处理之后，其制品的色泽和质构、嫩度以及营养成分等物化性质的总体映射[2]。
其中嫩度是消费者评价羊肉食用品质的重要指标之一[3]，而24 月龄以上的羊肉嫩度较差，其中后腿部半腱肌嫩度明显低于其他部位肌肉，需要对其采取嫩化处理，改善其食用品质。
目前肉品的物理嫩化方法包括自然熟化、机械嫩化、超声波、超高压和电刺激[4]；化学嫩化方法主要是使用化学试剂达到嫩化的目的，这些化学试剂主要有多聚磷酸盐、碳酸盐及钙盐[5-8]；生物学嫩化法则是通过添加蛋白酶的方法达到嫩化的效果，主要有木瓜蛋白酶嫩化法、菠萝蛋白酶嫩化法、中华猕猴桃蛋白酶嫩化法、无花果蛋白酶嫩化法、生姜蛋白酶嫩化法、真菌蛋白酶嫩化法等[9-17]。
生物嫩化成本较高，化学嫩化法很难消除消费者对添加剂的担忧，因此，选择一种成本低、安全健康的嫩化方法尤为重要。
本实验采用NaCl腌制结合滚揉、真空滚揉、NaCl腌制结合真空滚揉3 种方法对羊肉半腱肌进行嫩化，研究了不同处理后羊肉的剪切力、pH值、蒸煮损失、肌原纤维小片化指数（myofibrillar fraglllentation index，MFI）、胶原蛋白、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）的变化，选取一种嫩化效果好、成本低、安全健康的处理方法，为羊肉产业中羊肉的处理及销售提供理论依据和技术保障，为羊肉嫩化方法的进一步研究提供理论参考。
茶树叶肉原生质体的分离与纯化
茶树叶肉原生质体的分离与纯化刘艳丽;金孝芳;马林龙;曹丹;龚自明;韦朝领【摘要】In the present study,the effect of mannitolconcentration,combination of different enzyme (cellulase and macerozyme) solutions,and enzymolysis time on the separation of mesophyll protoplasts and purification of protoplasts from two high density separating solutions were studied in the leaves of tea seedlings.The results demonstrated that high quality mesophyll protoplasts were obtained from tea leaves subjected to enzymatic digestion in a solution containing 0.6 mol/L mannitol,1.5％ cellulase,and 2.5％ macerozyme for 16-18 h in the dark.In addition,protoplasts gathered into a band on the layer between 10％mannitol and25％ iodixanol.%以茶树幼苗叶片为材料,分析了甘露醇浓度、不同酶液组合、酶解时间等因素对叶肉原生质体分离及2种高密度分离液对原生质体纯化的影响.结果表明,叶片在含0.6 mol/L的甘露醇、1.5％的纤维素酶和2.5％的离析酶的酶解液中黑暗酶解16～18 h,叶肉原生质体的分离效果最好.此外,研究发现原生质体在10％的甘露醇与25％的碘克沙醇界面处聚集形成了一条带.【期刊名称】《植物科学学报》【年(卷),期】2017(035)006【总页数】4页(P908-911)【关键词】茶树叶片;原生质体;分离;纯化【作者】刘艳丽;金孝芳;马林龙;曹丹;龚自明;韦朝领【作者单位】湖北省农业科学院果树茶叶研究所,武汉430209;湖北省农业科学院果树茶叶研究所,武汉430209;湖北省农业科学院果树茶叶研究所,武汉430209;湖北省农业科学院果树茶叶研究所,武汉430209;湖北省农业科学院果树茶叶研究所,武汉430209;安徽农业大学茶树生物学与资源利用国家重点实验室,合肥230036【正文语种】中文【中图分类】Q945茶(Camellia sinensis (L.) O. Ktze.)是我国重要的叶用木本经济作物，也是世界三大无酒精饮料之一的资源植物。
一种香橼叶肉原生质体的分离方法[发明专利]
![一种香橼叶肉原生质体的分离方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/d448f1222cc58bd63086bd0c.png)
专利名称：一种香橼叶肉原生质体的分离方法专利类型：发明专利
发明人：张艳芳,温寿星,赵维峰,杨文秀
申请号：CN201910195356.8
申请日：20190314
公开号：CN109777764A
公开日：
20190521
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种香橼叶肉原生质体的分离方法，包括以下步骤：取香橼实生苗的幼嫩叶片进行预质壁分离处理、酶解、加入CPW洗液纯化，即可收集得到纯化后的原生质体沉淀。
本发明可获得高活性、高产量的原生质体，为开展香橼原生质体胞融合、遗传转化等研究提供实验材料，为香橼实生选种提供新途径。
申请人：福建省农业科学院果树研究所
地址：350013 福建省福州市晋安区新店镇埔党102号
国籍：CN
代理机构：福州元创专利商标代理有限公司
代理人：蔡学俊
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一种简便的植物单细胞显微操作分选方法
第39卷第1期2020年2月电㊀子㊀显㊀微㊀学㊀报Journal of Chinese Electron Microscopy SocietyVol.39,No.12020-02文章编号:1000-6281(2020)01-0086-04㊀㊀一种简便的植物单细胞显微操作分选方法鄂一岚1,2,何其邹洪1,2,李瑞丽1,2∗(1.北京林业大学林木分子设计育种高精尖创新中心,北京100083;2.北京林业大学生物科学与技术学院,林木育种国家工程实验室,北京100083)摘㊀要㊀㊀植物细胞具有刚性细胞壁,是植物进行单细胞分析的主要阻碍,选择适当的酶解方法去除细胞壁以后,分选出具有活性的原生质体是进行植物单细胞分析的关键㊂本文以84K 杨叶肉组织为材料,酶解4h 以后,稀释原生质体至适当密度㊂在光学显微镜下,使用微吸管㊁口吸管相互配合,直接进行显微操作分选㊂移动微吸管针口靠近目标原生质体,缓慢给予负压,将原生质体吸到微吸管内,给予正压释放,成功地分选出目标细胞,分选效率可达100%㊂该方法可以为多种植物的不同组织单细胞初步分选提供一种简便㊁快速的方法㊂关键词㊀㊀植物细胞分选;原生质体;显微操作;光学显微镜中图分类号:Q336㊀㊀文献标识码:B㊀㊀doi :10.3969/j.issn.1000-6281.2020.01.015收稿日期:2019-05-07;修订日期:2019-06-13基金项目:国家自然科学基金面上项目(Nos.31970182,31670182);国家重点研发计划课题(No.2016YFD0600102);中央高校基本科研业务费专项资助项目(No.2019ZY29);国家自然科学基金重点项目(No.31530084);国家自然科学基金国际(地区)合作与交流项目(No.31761133009).作者简介:鄂一岚(1990-),女(达斡尔族),天津人,博士研究生.E-mail:eyilan@ ∗通讯作者:李瑞丽(1981-),女(汉族),河南人,副教授.E-mail:liruili@㊀㊀多细胞生物中,不同细胞类型和细胞功能特异性的产生主要是基因差异表达的结果[1]㊂因此传统检测手段,仅采用检测群体水平特征的实验方法,会平均或稀释细胞之间的重要差异[2]㊂通过细胞类型的特异性方法来研究单细胞组学,理解多细胞生物体内不同类型的单个细胞基因表达特点及其适应环境变化的机制,是近几年研究的热点[3]㊂单细胞样品的获取一直是植物单细胞研究的一大技术瓶颈,其首要挑战是挑选正确的靶细胞㊂对于植物而言,细胞类型相对较少,可以直接采集的单细胞样本很少,大部分研究需要仔细对特定的细胞群进行分类㊂如果采取不当的分离方法,将使后续分析变得复杂,并造成很大误差[4]㊂本研究将84K 杨叶片㊁毛竹土培苗叶片㊁拟南芥叶片和拟南芥根等组织酶解,在光学显微镜下观察,使用微吸管直接将酶解后的目标原生质体吸取出来,从而实现植物细胞的可视化分选,为植物单细胞初步分选提供了一种简便的方法㊂与动物细胞相比,植物细胞具有刚性细胞壁,并由果胶质连接㊂通常,第一个分离步骤是酶解,使单个细胞游离在悬浮液中㊂但长时间酶解对植物细胞原生质体会造成损伤[5],因此不同植物的细胞渗透压及最佳酶解体系都需要进行单独摸索㊂获得悬浮液后,较为常用的单细胞分选方法有:有限稀释[1],光学镊子[6],荧光激活细胞分选(fluorescence-activated cell sorting,FACS)[7]和显微操作[8]等㊂连续稀释是分离单个细胞的最简单方法㊂在此过程中,将细胞连续稀释至每微升约一个细胞㊂然而,由于连续稀释的准确度低,这种方法在最近的单细胞分离中很少使用㊂光学镊子,有时也被称为单光束梯度力势阱,也是显微操纵的一种形式[9]㊂用高度聚焦的激光束产生吸引力或排斥力来夹取细胞㊁病毒㊁细菌,甚至是分子㊁原子㊂光学镊子能够不直接接触细胞进行操纵,然而激光束对细胞产生的热损伤和光损伤效应是不可避免的[10]㊂FACS 是最常用于富集具有特定表面标记的靶细胞或简单地从悬浮液中分选单个细胞的方法㊂但是,FACS 中用于将流体分解成单个液滴的强烈振动可能损坏细胞,导致膜渗漏㊁mRNA 或DNA 的损失,此外,FACS 需要相对大量的细胞作为起始材料[1]㊂显微操作技术在动物细胞分选领域应用较为成熟[2],在植物单细胞分选领域应用较少㊂Brad 等使用不同型号钝化的胰岛素针分别对0.3~1.5mm 的玉米孢子细胞和花粉母细胞进行分选,对植物生殖细胞原生质体进行了分离[11]㊂本实验所采用的显微操作法,使用微毛细管移液器人工吸取细㊀第1期鄂一岚等:一种简便的植物单细胞显微操作分选方法㊀㊀胞,不需要额外的设备,在可视条件下对多种植物细胞进行分选,是一种更简单且廉价的方法㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料植物选取84K杨30日龄组培苗㊁毛竹土培苗㊁15日龄拟南芥无菌苗,纤维素酶Cellulase R-10㊁果胶酶Pectolyase Y-23购于Yakult公司,甘露醇购于北京索莱宝科技有限公司,葡萄糖㊁KCl㊁CaCl2㊁NaCl㊁MES㊁BSA均为国产分析纯㊂1.2㊀方法1.2.1㊀原生质体的制备84K杨叶片酶解液:0.6mol㊃L-1甘露醇,0.1% BSA,10mmol㊃L-1CaCl2,10mmol㊃L-1MES, 20mmol㊃L-1KCl,纤维素酶1.5%(w/v),果胶酶0.5%(w/v),用0.45μm滤器过滤除菌㊂拟南芥根㊁叶片酶解液:0.4mol㊃L-1甘露醇, 0.1%BSA,10mmol㊃L-1CaCl2,20mmol㊃L-1MES,20 mmol㊃L-1KCl,纤维素酶1.5%(w/v),离析酶0.3% (w/v),用0.45μm滤器过滤除菌㊂毛竹叶片酶解液:0.6mol㊃L-1甘露醇,0.2% BSA,10mmol㊃L-1CaCl2,20mmol㊃L-1MES,20 mmol㊃L-1KCl,纤维素酶2%(w/v),果胶酶0.3% (w/v),半纤维素酶0.3%(w/v),离析酶0.7% (w/v)用0.45μm滤器过滤除菌㊂W5溶液:分别称取1.8g NaCl,2.774g CaCl2, 0.074g KCl,0.18g葡萄糖,0.06g MES,加dd H2O 定容至200mL,调节pH至5.7,高温高压灭菌㊂按照上述方法配制酶解液,将植物材料横向切成宽约1mm的长条,并立即放入酶解液中,黑暗酶解4h;在酶解液中加等体积提前冰置预冷的W5溶液终止反应,使用150目的细胞筛过滤酶液于50 mL圆底离心管中,4ħ,100g离心5min;原生质体富集于离心管底部,缓慢吸去上清液,加入10mL预冷的W5溶液,再次清洗,100g离心3min,去上清液,用预冷的W5溶液轻柔吹吸悬浮,吸悬浮液,继续加W5溶液稀释㊂1.2.2㊀微吸管制备使用显微注射针拉制仪将加热的玻璃毛细管拉细,采用二步法,分别设置两次不同的温度参数将毛细管拉长,显微注射针拉制仪生产于日本Narishige公司㊂1.2.3㊀单细胞分选取稀释后的原生质体悬浮液20~30μL置于培养皿上㊂选择10倍物镜,在视野下找到微吸管针口,移动针口靠近目标原生质体,通过口吸管缓缓给予负压,将原生质体吸到微吸管内,再缓慢把原生质体吹入PCR管中直接进行下一步实验或吹入下一步反应的缓冲液中洗涤,重复此操作再次吸取单个原生质体㊂2㊀结果与讨论2.1㊀分选样品制备将84K杨叶片组织在混合酶液中酶解,若分选出的单细胞后续用于单细胞转录组测序,长时间的酶解会对测序结果造成误差,可在酶解液中加入actinomycin D和cordycepin,抑制酶解过程中RNA 合成,避免长时间酶解产生新的转录本[12]㊂原生质体经W5溶液洗涤后,制成原生质体悬浮液,取20~ 30μL置于培养皿上,在镜下观察细胞数量,是否稀释至易于显微操作的密度,约0.5~1ˑ105个/mL (图1a,1b所示)㊂同时,作者还用同样的方法分离得到了毛竹土培苗叶片㊁拟南芥叶片和拟南芥根细胞的原生质体,并将其稀释至易于进行显微操作的浓度(图1c~e所示)㊂2.2㊀单细胞分选使用约100μm内径的微吸管,微吸管与口吸管相连㊂如图2a所示,在10倍物镜视野下找到微吸管针尖,移动针尖至目标原生质体附近,轻吸口吸管给予负压,目标原生质体缓慢移动至针尖内部(如图2b所示)㊂将微吸管放入缓冲液中或者PCR 管中,通过正压释放原生质体(如图2c所示)㊂如果需要对原生质体进行荧光成像或定位分析,可使用激光扫描共聚焦显微镜进行观察,以提高分选率㊂本方法同样适用于细胞特性表达分选㊁瞬时转化原生质体亚细胞定位分析等㊂3㊀结论本方法结合光学显微镜和显微操作技术,实现了植物细胞原生质体的快速㊁高效和可视化分选㊂本方法广泛适用于多种植物的不同组织,样品量少且目标细胞比例大的情况㊂本文旨在为科研人员进行单细胞分析提供一种植物单细胞初步分选的方法㊂4㊀显微操作在植物单细胞研究中的展望㊀㊀随着植物单细胞分析技术的发展,对植物单细78㊀㊀电子显微学报㊀J.Chin.Electr.Microsc.Soc.第39卷图1㊀植物原生质体的制备㊂Bar =100μma.84K 杨叶片原生质体初始密度;b.稀释后的84K 杨叶片原生质体;c.毛竹叶片原生质体;㊀㊀㊀㊀㊀d.拟南芥叶片原生质体;e.拟南芥根原生质体㊂Fig.1㊀Preparation of protoplasts in various plant tissues.a.Initial density of protoplasts of 84K poplar leaf;b.84K poplar leaf protoplasts after dilution;c.Protoplasts of Phyllostachys heterocycla leaf;d.Protoplasts of Arabidopsis thaliana leaf;e.Protoplasts of ㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀Arabidopsis thalianaroot.图2㊀植物单细胞分选㊂Bar =100μma.移动微吸管针尖至目标原生质体附近;b.给予负压,吸入目标原生质体;c.给予正压,释放目标原生质体㊂Fig.2㊀Separation of plant single cells.a.Move the micropipette tip to the target protoplast;b.Apply negative pressure to suck target protoplasts;c.Apply positive ㊀㊀㊀㊀pressure to release target protoplasts.胞分离技术的要求越来越高㊂植物转基因和基因编辑技术的进步,使得表达荧光标签的转基因植株更易获得,更有助于植物单细胞显微操作分选㊂以下几个方面将会是今后的的主要应用方向:(1)植88㊀第1期鄂一岚等:一种简便的植物单细胞显微操作分选方法㊀㊀物单细胞测序过程中目标细胞的初步分选[1];(2)对进行荧光成像㊁定位分析的细胞分选[13]㊂参考文献:[1]㊀YUXUAN Y,HUEYTYNG L,HU H F,et al.Single-cell genomic analysis in plants [J].Genes,2018,50(9):2-16.[2]㊀张晓兰,李春立,刘一苇,等.基于显微操作的单细胞分选方法[J].电子显微学报,2018,37(1):97-100.[3]㊀SHAPIRO E,BIEZUNER T,LINNARSSON S,et al.Single-cellsequencing-basedtechnologieswillrevolutionize whole-organism science [J ].Nat RevGenet,2013,14:618-630.[4]㊀GAWAD C,KOH W,QUAKE S R,et al.Single-cellgenome sequencing:current state of the science [J].Nat Rev Genet,2016,17:175-188.[5]㊀GUAN Y,QU H.A rapid method for isolating single cells from apple flesh[J].Acta Hort,2017,3:47-52.[6]㊀LANDRY Z C,GIOVANONNI S J,QUAKE S R,et al.Optofluidic cell selection from complex microbialcommunities for single-genome analysis [J ].MethodEnzymol,2013,531:61-90.[7]㊀SPANGRUDE G J,HEIMFELD S,WEISSMAN I L,etal.Purificationandcharacterizationofmousehematopoietic stem cells[J].Science,1988,241:58-62.[8]㊀SHAPIRO E,BIEZUNER T,LINNARSSON S,et al.Single-cellsequencing-basedtechnologieswillrevolutionize whole-organism science [J ].Nat RevGenet,2013,14:618-630.[9]㊀YATES L R,CAMPBELL P J,et al.Evolution of the cancer genome [J].Nat Rev Genet,2012,13:795-806.[10]㊀CHRIS H,ANNE O,IMOGEN A S,et al.Opticaltweezers for the micromanipulation of plant cytoplasmand organelles [J].Curr Opin Plant Biol,2010,13:731-735.[11]㊀BRAD N,VIRGINIA W.Defining the developmental program leading[J].Science,2019,364,52-56.[12]㊀马利刚.烟草二胞原胚顶㊁基细胞转录谱比较研究及AtMAN 7功能的初步分析[D ].武汉:武汉大学,2011.[13]㊀李叶,黄华平,林培群,等.激光扫描共聚焦显微镜的基本原理及其使用技巧[J].电子显微学报,2015,34(2):169-176.㊀㊀∗㊀Corresponding authorA simple method of sorting plant single cell bymicromanipulationE Yi-lan 1,2,HE Qi-zou-hong 1,2,LI Rui-li 1,2∗(1.Beijing Advanced Innovation Center for Tree Breeding by Molecular Design,Beijing Forestry University,Beijing 100083;2.National Engineering Laboratory for Tree Breeding,College of Biological Sciences and Technology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)Abstract ㊀㊀Plant cells have rigid cell walls,which are the main obstacles for the single-cell analysis of plants.After the removal ofcell walls by appropriate enzymatic hydrolysis,the separation of active protoplasts is the key to the single-cell analysis of plants.Here,we used 84K poplar as materials.After 4hours of enzymatic hydrolysis,we dilute the protoplasts to the appropriate density.Under the optical microscope,the micropipette and mouth pipette are used to cooperate with each other to conduct microscopic separation directly.Move the tip of the micropipette close to the target protoplast,slowly give negative pressure,draw the protoplast into the micropipette,and then give positive pressure to release.As a result,the target cells can be successfully sorted and the sorting efficiency can up to 100%,which provides a simple and fast method for the preliminary separation of plant single cells.Keywords ㊀㊀plant cell sorting;protoplast;micromanipulation;optical microscope98。
玉米叶肉原生质体瞬时表达系统建立与优化
玉米叶肉原生质体瞬时表达系统建立与优化摘要：原生质体瞬时表达系统（PIT）是一种有效的基因表达工具，可快速、高效地表达外源蛋白质。
本研究以玉米叶肉原生质体作为模型，建立了一套稳定可靠的PIT系统，并对其进行了优化。
结果表明，通过优化原生质体的获得和转化条件，可以显著提高表达效果。
该研究对于进一步研究外源蛋白质的功能和应用具有重要意义。
1. 引言在基因工程和生物医学领域，研究人员经常需要大量表达外源蛋白质来进行进一步的研究。
传统的表达系统如大肠杆菌等存在一些缺点，如蛋白质结构差异导致的不稳定、翻译后修饰不足等。
因此，发展一种高效、快速的外源蛋白质表达系统对于研究和应用具有重要意义。
原生质体瞬时表达系统（PIT）是一种将外源基因导入原生质体，通过原生质体自身的转录和翻译系统来表达蛋白质的方法。
相比传统的表达系统，PIT具有表达效果快、蛋白质结构稳定等优点。
近年来，越来越多的研究开始使用PIT系统进行外源蛋白质的表达。
玉米叶肉是一种常见的植物细胞，在PIT系统中被广泛应用。
本研究以玉米叶肉原生质体作为模型，建立了一套稳定可靠的PIT系统，并对其进行了优化。
2. 材料与方法2.1 玉米叶肉原生质体的获得玉米植株转基因过程中需要大量获得叶肉原生质体。
本研究优化了叶肉原生质体的提取方法，具体步骤如下。
首先，选择健康的玉米叶子，去除较硬的中脉。
然后，将叶片切成小片，并在含有酶解酶的培养基中进行酶解。
最后，收集酶解后的原生质体进行后续转化实验。
2.2 原生质体的转化与表达优化获得的玉米叶肉原生质体后，将目的基因导入原生质体中。
本研究采用高效的基因转化方法，如PEG （聚乙二醇）法和电击法等。
将目的基因与载体共转化到原生质体中，并进行转化。
转化后，通过适当的培养和筛选条件，筛选出表达目的基因的最佳原生质体克隆。
2.3 表达效果的评估本研究采用Western blot和免疫荧光染色法对表达的蛋白质进行检测和定量。
通过比较不同条件下的表达效果，评估优化后的PIT系统的表达效果。
玉米叶肉原生质体瞬时表达系统建立与优化
玉米叶肉原生质体瞬时表达系统建立与优化玉米是全世界最重要的粮食作物之一，也是许多国家的重要原料供应者，尤其是用于生产生物燃料和化工原料。
玉米叶肉细胞是进行基因表达和生物合成的重要细胞类型之一。
由于其高效的生物合成能力和丰富的蛋白质含量，玉米叶肉细胞已成为研究和生产的理想模型。
然而，传统的转染方法对基因的转导效率和表达量有一定局限性，限制了基因表达的研究和应用。
因此，发展一种高效、简便的玉米叶肉原生质体瞬时表达系统具有重要意义。
原生质体瞬时表达系统是在细胞质中直接转导外源基因并进行表达的一种方法。
相比于传统的转染技术，原生质体瞬时表达系统具有以下优势：(1) 相对较高的转导效率和表达量；(2) 无需耗时的细胞培养和稳定转化；(3) 更适用于高通量筛选和表达优化。
因此，建立一个高效的原生质体瞬时表达系统对于基因的功能研究和工业应用具有重要的意义。
在玉米叶肉细胞中，瞬时表达系统的关键步骤主要包括DNA导入、转导、表达和鉴定。
首先，合适的质粒载体和表达载体需要进行构建和优化。
质粒载体应包含适当的启动子、启动子增强子和终止子序列，以确保基因在转导后的高效表达。
此外，选择合适的选择标记基因，如绿色荧光蛋白（GFP）等，以便对转导效率和表达量进行评估。
其次，选择合适的转导方法。
在玉米叶肉细胞中，常用的转导方法包括基因枪转导、电转导和化学转导等。
不同的方法适用于不同的目的和实验条件，因此需要根据具体实验目的进行选择。
例如，基因枪转导适用于高通量筛选，电转导适用于较小规模的实验室研究。
为了提高转导效率，可以优化转导条件，包括DNA浓度、转导时间和转导介质等。
第三，对转导后的基因表达进行鉴定和分析。
通过荧光显微镜观察转导后的细胞在表达载体中是否产生荧光信号，以评估转导的效果。
此外，可以利用Western blotting、RT-PCR等技术对蛋白质和RNA进行定量分析。
然而，在建立和优化玉米叶肉原生质体瞬时表达系统时，仍然存在一些挑战和难题。
阿勒泰羊肌肉组织的免疫组化分析
阿勒泰羊肌肉组织的免疫组化分析彭新荣;刘晨曦;玛依拉;刘明军【摘要】[Objective] To compare the MyHC I content in the muscles of Altay mutton sheep. [Method] The muscle samples were collected from 8-month old Altay mutton sheep,Texel sheep and F1hybrid to analyze MyHC I content by using immunohistochemical method and com-pare it with Texel sheep and F1hybrid. [Result] MyHC I content in the muscles of Altay mutton sheep had significant differences with that in Texel sheep andF1hybrid(P<0.05). [Conclusion] The research results could provide theoretical basis for mutton sheep breeding and the i-dentification of muscle quality.%[目的]比较阿勒泰羊肌肉组织肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MyHC)I型肌纤维含量.[方法]收集8月龄阿勒泰羊、Texel羊和F1代肉羊肌肉组织,应用免疫组化方法分析阿勒泰羊MyHC I型肌纤维含量,并与Texel和F1代肉羊进行了比较.[结果]阿勒泰羊MyHC I型肌纤维含量与Texel肉羊、F1代肉羊差异显著(P<0.05).[结论]研究结果可为肉羊品种选育和肌肉品质鉴定提供理论依据.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2018(046)009【总页数】3页(P88-90)【关键词】阿勒泰羊;氧化型慢肌纤维;MyHCI型肌纤维;免疫组化【作者】彭新荣;刘晨曦;玛依拉;刘明军【作者单位】新疆畜牧科学院生物技术研究所,新疆乌鲁木齐830000;新疆畜牧科学院生物技术研究所,新疆乌鲁木齐830000;新疆畜牧科学院生物技术研究所,新疆乌鲁木齐830000;新疆畜牧科学院生物技术研究所,新疆乌鲁木齐830000【正文语种】中文【中图分类】S826.8阿勒泰羊俗称福海大尾羊，是新疆著名的肉脂兼用型地方品种，具有肉质细嫩、耐粗饲、抗病力强、适应高寒山区气候等优点，目前已经遍布新疆各地。
菜心原生质体游离条件的优化
菜心原生质体游离条件的优化菜心原生质体游离是一种常见但也比较复杂的分离纯化方法，在生物学和生物技术领域中常常被用于分离和提取细胞内部分子、酶和蛋白等物质。
然而，由于原生质体的易受外界变化的影响，游离过程容易受到多种因素的干扰而受损，从而影响纯化的效果和产物的质量。
因此，为了提高菜心原生质体游离的效果，需要对游离条件进行优化。
一、优化样品的处理方式首先，要对样品处理方式进行优化。
菜心的原生质体通常可以通过机械破碎等方式获取，但是这样得到的原生质体很容易受到机械伤害而流失，因此需要采取温和的方法来处理样品。
例如，可以采用低温贮存的方法，以减少细胞的代谢活动和细胞壁的分解。
此外，还可以采用渗透法来破坏细胞壁，有利于原生质体的提取。
二、优化游离条件的选择游离过程中的条件包括游离液的pH值、温度、浓度、离子强度和游离时间等因素。
这些因素都会影响原生质体的分离和纯化效果。
在选择游离条件时，需要针对不同的原生质体类型和目的来进行优化。
1、 pH值pH值是影响原生质体游离的关键因素之一。
不同的原生质体在不同的pH范围内具有不同的游离能力。
一般来说，大部分的菜心原生质体在pH6-7的范围内具有较高的游离能力。
在游离液中加入足量的缓冲剂，可以维持pH值的稳定性。
2、温度温度对原生质体的活力、稳定性和弹性都有很大的影响。
一方面，温度升高会导致原生质体的活力下降、易被破坏或凝集；另一方面，温度过低则会影响游离的速率和效果。
因此，需要进行试验验证，选择最适合的温度范围。
3、浓度和离子强度在实验中，浓度和离子强度是两个重要的游离条件。
一般来说，较低的浓度和离子强度有利于原生质体的游离，但是过低的浓度和离子强度则会影响游离效果和产量。
因此，需要进行不同浓度和离子强度的实验比较，选择最优游离液的浓度和离子强度。
4、游离时间游离时间是影响原生质体游离效果的重要因素之一。
一般来说，游离时间并不是越长越好，而是需要在一定时间范围内选择最优的时间。
菜心原生质体游离条件的优化
菜心原生质体游离条件的优化菜心（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee）是一种广泛种植的蔬菜作物，具有丰富的营养价值。
原生质体（Protoplast）是从植物细胞通过酶解法去除细胞壁后得到的裸细胞结构，具有丰富的利用价值。
优化菜心原生质体游离条件可以提高其利用效率和质量，下面将就此进行探讨。
一、选择酶解酶菜心原生质体游离的第一步是去除细胞壁，通常采用纤维素酶、果胶酶和胆甾醇酶等酶解酶。
在优化条件时，应考虑酶解效率和细胞存活率。
一般而言，纤维素酶能够有效去除细胞壁，但对细胞存活率有一定的影响，因此可尝试调整酶解酶的浓度和作用时间，找到适合的条件。
二、调节酶解液的渗透性酶解液的渗透性对裸细胞的游离效果影响较大。
一般而言，高渗透压酶解液有助于维持细胞的完整性，从而增加细胞存活率。
可以通过添加适量的蔗糖或甘露醇等渗透剂来提高酶解液的浓度和渗透性。
还可尝试在水溶液中添加一定浓度的聚乙二醇（PEG）来调节渗透性。
三、调节pH值pH值是影响原生质体游离效果的重要因素。
一般而言，pH值过高或过低都会对细胞存活率产生不良影响。
应选择合适的缓冲液体系来调节pH值。
常用的缓冲液体系有磷酸盐缓冲液、乙酸/醋酸缓冲液等。
在优化过程中，可以尝试不同pH值的缓冲液，找到适合的条件。
四、调节游离条件的温度和时间温度和时间是影响菜心原生质体游离效果的关键因素。
一般而言，较高的温度可以加速酶解反应，但过高的温度会造成细胞死亡。
一般情况下，30°C-37°C是较为合适的温度范围。
还应根据具体情况调整酶解时间，以保证细胞完全裂解并最大限度地保留细胞完整性。
菜心原生质体游离条件的优化需要考虑多个因素，如酶解酶的选择和浓度、酶解液的渗透性和pH值，以及游离条件的温度和时间等。
通过合理调节这些因素，可以提高菜心原生质体游离的效率和质量，为后续的研究和应用提供可靠的基础。
三倍体‘银中杨’叶肉原生质体制备的优化
三倍体‘银中杨’叶肉原生质体制备的优化宋少宇;张俊琦;王君【摘要】以三倍体杨树品种‘银中杨’(Populus alba×P.berolinensis Yinzhong)无菌苗叶片为材料,对其原生质体分离及纯化条件进行研究,为进一步通过细胞融合、基因工程等进行品种改良探索新的途径.结果表明:酶的种类及浓度、渗透压、酶解时间对‘银中杨’叶肉原生质体分离效果有显著影响,适宜的分离条件为CPW+3％Cellulase RS+0.5％ Macerozyme R-10+0.3％ Pectinse Y-23+ 0.6 mol/L甘露醇+0.6 g/L MES+1 g/L BAS,酶解时间为8h,原生质体产量和活力分别为2.13×10 7个/g和80.18％;‘银中杨’叶肉原生质体纯化最佳方法为上浮法蔗糖等密度离心,且蔗糖浓度为40％时原生质体产量最高(1.06×10 7个/g),可满足进一步的原生质体培养等技术的要求.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2015(035)009【总页数】7页(P1899-1905)【关键词】‘银中杨’;原生质体;分离;纯化【作者】宋少宇;张俊琦;王君【作者单位】北京林业大学林木育种国家工程实验室,林木花卉遗传育种教育部重点实验室,生物科学与技术学院,北京100083;北京林业大学公共分析测试中心,北京100083;北京林业大学林木育种国家工程实验室,林木花卉遗传育种教育部重点实验室,生物科学与技术学院,北京100083【正文语种】中文【中图分类】Q242;Q813.2植物原生质体是获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料，在植物快速繁殖、远缘遗传重组、转基因以及品种改良和创造新类型等方面具有广阔的应用前景[1-2]。
利用原生质体可以进行细胞融合和体细胞杂交，能有效克服植物有性杂交不亲和现象，扩大种、属间的基因交流，丰富种质遗传资源，是一种创造远缘杂种，获得同源或异源三倍体、四倍体以及双二倍体的新途径[3-4]；同时，原生质体又是植物基因工程的理想受体，可为外源基因、DNA片段、细胞器、染色体捕获创造一种新方法[5]。
新疆阿魏菇高效原生质体分离与再生体系的建立
新疆阿魏菇高效原生质体分离与再生体系的建立原慧;王勇;周继阳【期刊名称】《食用菌》【年(卷),期】2012(000)002【摘要】以新疆阿魏菇为材料，研究了阿魏菇原生质体分离、再生体系建立的影响因素，建立了稳定的新疆阿魏菇原生质体分离、再生体系，并通过出菇验证了该体系的可利用性。
结果显示，在35℃、0．6mol／LKCl稳渗剂条件下，菌龄为8d阿魏菇菌丝体（0．1g）在0．8mL酶解液中（1．5％离析酶＋0．5％纤维素酶＋2％溶菌酶）制备原生质体，酶解3h获得原生质体达5×10^6个／mL；在0．8mol／L蔗糖稳渗剂下，原生质体再生时间为16d，其再生率可达0．6％。
出菇试验表明，获得的原生质体具有较强的恢复能力，能够与对照组在同样条件下正常出菇。
从细胞水平上探索一条食用菌育种新途径，为发展和完善食用菌新菌株选育提供理论依据和技术借鉴。
【总页数】3页(P12-14)【作者】原慧;王勇;周继阳【作者单位】新疆师范大学分子生物学与生物信息研究室,新疆乌鲁木齐830053;新疆师范大学分子生物学与生物信息研究室,新疆乌鲁木齐830053;新疆师范大学分子生物学与生物信息研究室,新疆乌鲁木齐830053【正文语种】中文【中图分类】S968.42【相关文献】1.新疆陆地棉胚状体发生高效再生体系的建立 [J], 王芳;刘利君;张佩玲;文峰;姚源松2.新疆优质甜瓜高效离体再生体系的建立 [J], 钟俐;钟伶3.阿魏菇原生质体制备及再生条件的建立 [J], 周继阳;王勇;祝长青4.新疆甜瓜高效再生体系的建立及NPR1/HRP双价抗病基因转化 [J], 冯玉杰;王爱英;沈海涛;祝建波5.云南疣粒野生稻原生质体高效分离培养体系的建立 [J], 陈越; 王波; 张敦宇; 殷富有; 程在全; 王玲仙; 付坚; 陈玲; 肖素勤; 柯学; 钟巧芳; 赵才美; 余腾琼因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
‘石牌’广藿香叶肉原生质体的分离及纯化
‘石牌’广藿香叶肉原生质体的分离及纯化莫小路;邱蔚芬;黄珊珊;陈瑜珍;严振【期刊名称】《亚热带植物科学》【年(卷),期】2012(41)3【摘要】以‘石牌’广藿香无菌苗叶片为材料,对原生质体分离、纯化方法以及影响因素进行了研究.结果表明：以继代培养12~22 d 的无菌苗顶芽下第3对展开叶片为材料,用0.5%果胶酶、0.2%离析酶和1.5%纤维素酶作用8 h,渗透压调节剂为11%甘露醇,‘石牌’广藿香叶肉原生质体产量达1.85×107个/g fw,活力达89%；原生质体纯化以12%聚蔗糖(Ficoll)漂浮法效果最佳% Mesophyll protoplasts were isolated and purified from leaves of in vitro propagated Polgostemon cablin (Blanco) Benth. cv. shipaiensis, and different factors affecting protoplasts yield and activity were investigated. The results showed that young leaves of seedling subcultured for 12~22 days in the enzyme solution consisting of 0.5% (w/v) pectolyase Y-23, 0.2%(w/v) Macerozyme R-10 and 1. 5% (w/v) cellulase R-10, in 11% (w/v) mannitol buffered with 0.1% MES and 0.02%CaCl2 for 8 h, the yield was 1.85×107 protoplasts per gram leaves (fresh weight), the viability was above 89%.【总页数】4页(P25-28)【作者】莫小路;邱蔚芬;黄珊珊;陈瑜珍;严振【作者单位】广东省中药研究所,广东广州510520;广东省中药研究所,广东广州510520;广东省中药研究所,广东广州510520;广东省中药研究所,广东广州510520;广东省中药研究所,广东广州510520【正文语种】中文【中图分类】Q943.1【相关文献】1.石牌广藿香原生质体的分离及培养研究 [J], 莫小路;曾庆钱;黄珊珊;陈瑜珍;严振2.烟草叶肉原生质体分离和纯化研究 [J], 陈名红;熊立;陈学军3.茶树叶肉原生质体的分离与纯化 [J], 刘艳丽;金孝芳;马林龙;曹丹;龚自明;韦朝领;;;;;;4.茶树叶肉原生质体的分离与纯化 [J], 刘艳丽;金孝芳;马林龙;曹丹;龚自明;韦朝领5.苦荞叶肉细胞原生质体的分离纯化及瞬时转化 [J], 张钟仁;陈鹏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
菜心原生质体游离条件的优化
菜心原生质体游离条件的优化菜心是蔬菜中的一种营养丰富的绿色蔬菜，其中含有丰富的营养成分如维生素、矿物质、膳食纤维等，深受人们的欢迎。
然而，目前菜心的种植过程中存在许多问题，如土地的限制、病虫害的发生等，从而导致产量和品质的下降。
因此，通过利用原生质体技术来进行菜心的研究和培育，可以提高菜心的生长速度和产量，同时也能够保证菜心的品质和营养成分。
原生质体技术是一种重要的细胞生物学方法，通过去除细胞壁，使细胞中的溶胞体暴露在外，形成裸露的细胞膜，从而实现细胞的治疗性转化、基因修饰以及药物筛选等多种用途。
在菜心中，通过利用原生质体技术，可以实现高效的基因工程操作、生物反应器培养以及种子快速繁殖等功能。
而原生质体游离条件的优化，则是实现高效原生质体生成和发育所必需的重要步骤。
为了优化菜心原生质体游离条件，需要考虑到以下几个方面：细胞培养基的配制、酶解液的种类和浓度、酶解时间和温度、激素的添加等。
细胞培养基的配制对原生质体生成和发育具有非常重要的影响。
在制备细胞培养基时，需要考虑到菜心细胞的生长需求，添加适当的营养成分以提供细胞生长所需的营养物质。
在酶解液的种类和浓度上，可以选择一些酶解剂如纤维素酶、海藻酸酶、低甲氧基化果胶酶等，合理控制各种酶的浓度，可有效促进细胞壁的降解。
同时，酶解时间和温度也是影响原生质体生成和发育的重要因素。
合理调节酶解时间和温度，可以充分降解细胞壁，使原生质体得到充分暴露和释放。
此外，激素的添加也是优化原生质体游离条件的一个重要方面。
添加适量的激素可以刺激原生质体的生成和分裂，进而促进原生质体的发育和增殖。
在实践中，可以添加一些乙烯利、植物生长素等植物生长调节剂，来促进菜心原生质体游离过程的进行。
综上所述，优化菜心原生质体游离条件可以提高菜心的繁殖效率和产量，同时还能够保证菜心的品质和营养成分。
在具体实践中，需要注意对各项条件进行细致调节，找到最适宜的原生质体游离条件，从而实现高效的菜心原生质体培育。
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西北植物学报,2007,27(3):0509-0514Acta Bot.Boreal.2Occident.Sin. 文章编号:100024025(2007)03205092063新疆杨叶肉原生质体游离和纯化的研究景艳春,康向阳3,王 君,李代丽(北京林业大学林木花卉遗传育种教育部重点开放实验室,北京100083)摘 要:以新疆杨(Popul us alba L.var.p y rami dalis)无菌苗叶片为材料,就其原生质体游离、纯化方法及影响因素等进行了研究。
结果表明,cellulase R210、hemicellulase和pectolase Y223对原生质体产量有极显著影响。
适宜新疆杨叶片原生质体游离的条件为CPW+KM8P+3.0%cellulase R210+0.5%～1.5%macerozyme R210+0.5% hemicellulase+0.1%～0.5%pectolase Y223+0.6mol/L甘露醇,酶解温度27℃,酶解时间8h。
在此条件下,原生质体产量达1.57×107个/gFW,活力79.41%,而且蔗糖等密度离心法中的上浮法纯化原生质体效果最佳,最适蔗糖浓度为30%。
关键词:新疆杨;原生质体;游离;纯化中图分类号:Q503文献标识码:AIsolation and Purif ication of Mesophyll Protoplasts ofPopul us alba L.var.pyr amidalisJ IN G Yan2chun,KAN G Xiang2yang3,WAN G J un,L I Dai2li(Key Laboratory for Genetics and Breeding of Forest Trees and Ornamental Plant s,Ministry of Education,Beijing Forestry Uni2versity100083,China)Abstract:Protoplast s of Pop ul us alba L.var.p y rami dalis mesop hyll were isolated from leaves of sterile shoot.The different factors affecting t he p rotoplast s yield and different met hods of p urification were inves2 tigated.The result s showed t hat t here were highly significant differences among cellulase R210,hemicellu2 lase and pectolase Y223in t he p rotoplast s yield.The best enzyme solution contained CPW salt s,KM8P medi2 um,3.0%cellulase R210,0.5%～1.5%macerozyme R210,0.5%hemicellulase,0.1%～0.5%pectolase Y223,0.6mol/L mannitol incubated at27℃for8hours.The p rotoplast s yield was1.57×107/gFW and t he viability was79.41%under t he condition.Moreover,t he best protoplast s p urification met hod was ris2 ing met hod wit h sucro se isodensity cent rif ugation at concent ration of30%.K ey w ords:Pop ul us alba L.var.p y rami d alis;protoplast;isolation;p urification 自Cocking(1960)首次采用纤维素酶从番茄根分离获得原生质体以来[1],迄今已有320多种高等植物成功进行了原生质体分离、培养并获得再生植株[2]。
木本植物因起步晚、培养难度大而进展缓慢,仅柑橘、苹果、桑树、杨树、榆树、悬铃木、泡桐和猕猴桃等树种有所报道,其中用材树种只有6种[2]。
在杨属植物中,通过原生质体分离、培养并获得再生植株的有银白杨×大齿杨、欧洲黑杨×毛果杨、毛白杨、小叶杨、欧洲山杨、欧洲黑杨×辽杨、美洲黑杨×小叶杨等,并获得了美洲黑杨+胡杨、青杨+胡杨、3收稿日期:2006210220;修改稿收到日期:2007202206基金项目:国家林业局专项(2001266)资助作者简介:景艳春(1981-),女(汉族),硕士研究生,主要从事林木生物技术研究。
E2mail:jingyanchun_81@ 3通讯作者:康向阳,博士,教授,主要从事林木倍性育种与细胞遗传学研究。
E2mail:kangxy@美洲黑杨+青杨等体细胞杂种愈伤组织,但未得到杂种再生植株[3]。
新疆杨(P.alba L.var.p y rami dalis)为白杨派树种,具有速生、适应性强等优良性状,在我国北方广泛栽培。
目前通过组织培养已建立起新疆杨的植株离体再生体系[4],但尚未见有关原生质体方面的报道。
本实验对新疆杨叶片原生质体的分离及纯化方法进行了研究,以便为进一步的原生质体培养及细胞融合奠定基础。
1 材料和方法1.1 材 料新疆杨无菌苗。
1.2 原生质体游离的酶种类及浓度筛选1.2.1 材料处理 剪取苗龄20～40d的无菌苗第2～5片伸展叶片,切成0.5mm的细条,置于附加0.7mol/L甘露醇的CPW[5]盐溶液(p H5.7)中预质壁分离1～1.5h。
随后称取1g鲜重叶片放入经过滤灭菌的10mL由CPW盐溶液和KM8P[6]培养液等体积配制的混合酶液中[3],在27℃慢速摇床(30～40r/min)上黑暗酶解。
1.2.2 正交试验设计 采用4因素3水平正交试验设计(L9(34))筛选酶液中酶的种类及浓度(表1)。
1.2.3 单因子试验设计 由于正交试验筛选出cellulase R210(A)(纤维素酶,Yakult)和hemicellu2 lase(C)(半纤维素酶,Sigma)的浓度不能肯定是最佳浓度,我们对这2个因子再进行简单试验设计,筛选最佳处理浓度。
先将hemicellulase(C)固定为最佳浓度0.5%,而cellulase R210(A)设 3.0%、4.0%、5.0%等3个浓度梯度,筛选cellulase R210的最佳浓度;之后,将此最佳浓度固定,hemicellu2 lase设0.5%、0.3%和0.1%等3个浓度梯度;mac2 erozyme R210(B)(离析酶,Yakult)和pectolase Y223(D)(果胶酶,Yakult)的浓度选择正交试验筛选出的最佳浓度。
每个试验重复3次。
酶液中均附加甘露醇0.6 mol/L、M ES600mg/L、牛血清蛋白1g/L,p H 5.7。
酶解产物分别经200目和400目不锈钢滤网依次过滤,500r/min离心2.5min,用新鲜洗液洗涤3次,稀释到一定体积后进行计数并收集原生质体。
1.3 酶解时间和渗透剂浓度的筛选在由3.0%cellulase R210+1.0%macerozyme R210+0.5%hemicellulase+0.5%pectolase Y223组成的混合酶液中,对新疆杨叶片分别进行4、8、10和12h不同时间的酶解处理。
采用上述混合酶液,分别使用0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol/L的甘露醇作为渗透剂来调节渗透压,测定不同渗透压下原生质体分离的情况。
1.4 原生质体的纯化采用蔗糖等密度离心法、Ficoll漂浮法和Per2 coll密度梯度离心法对原生质体进行纯化[7,8]。
纯化后原生质体再用新鲜洗液洗涤3次,稀释至一定体积后进行计数。
1.5 原生质体产量与活力测定原生质体计数用血球计数板进行,每个样品计数5次,取平均值,最后按下式计算出原生质体产量:原生质体数(个/mL)=5个大格内原生质体总数×5×104×稀释倍数;原生质体产量(个/g)=[原生质体数(个/mL)×稀释后体积(mL)]÷叶片总质量(g)。
对获得的原生质体产量试验数据开平方根转换后,用DPS3.0专业版计算分析。
用0.01%FDA测定原生质体活力,每样品观测5次,取平均值。
按下式统计原生质体活力:原生质体活力=(发绿色萤光的原生质体数÷原生质体总数)×100%。
2 结果与分析2.1 原生质体游离的酶种及其浓度筛选酶是影响原生质体游离最重要的因素,主要降解构成植物细胞壁的纤维素、半纤维素和果胶质。
而酶解处理就是要用最低的酶浓度和最短的酶解时间获得大量有活力的原生质体。
在此,采用正交试验设计对新疆杨叶片原生质体游离所需要的酶种及其最佳处理浓度等进行筛选,正交试验结果见表1。
从表1极差值(R值)可以看出,cellulase R210的R值最大为619.86,表明cellulase R210是影响新疆杨原生质体游离产量最重要的酶种;而macer2 ozyme R210的R值最小,仅为145.32,表明其影响也最小。
各因子对新疆杨原生质体游离产量影响的顺序是:cellulase R210>hemicellulase>pectolase Y223>macerozyme R210,显示A3B2C1D2为最优组合。
在本实验中,第6个处理组合(A2B3C1D2)和第8个处理组合(A3B2C1D3)的原生质体产量较高,接近最优组合。
方差分析表明,A、C和D3个因子各水平间存在极显著差异(F0.05=3.63,F0.01=6.23),且A (23.6633)>C(8.9633)>D(7.6633);而B因子015西 北 植 物 学 报 27卷(1.28)各处理间差异不显著。
因此,需要进一步对cellulase R210、hemicellulase和pectolase Y223酶的浓度进行筛选,而macerozyme R210不同处理浓度间无显著差异,对原生质体游离的影响较小,应该选择最低处理浓度。
进一步进行多重比较可知(表2),A因子水平3、2与水平1之间达到极显著差异,但是水平2、3之间差异不显著;C因子的水平1与水平2、3之间达到极显著差异;而D因子的水平1与水平3之间达到极显著差异,水平2与水平3之间达到显著差异,但是水平1、2之间差异不显著。