副溶血性弧菌保藏条件研究
副溶血性弧菌标准的检验方法
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是广泛分布于海水、海底泥沙、浮游生物和鱼贝类中的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节的沿海地区，经常由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引起爆发性食物中毒。
在非沿海地区，因食用此菌污染的食品而引起中毒者亦时有发生。
为保障食品卫生质量和食用安全，根据副溶血性弧菌的特性，进行下列检验，以便鉴别诊断。
第一节副溶血性弧菌标准的检验方法一、检验方法（一）操作步骤1. 分离培养：首先称取样品25g，加225mL3.5％灭菌盐水，用均质器打碎或用乳钵磨碎，接种氯化钠琼脂平板和嗜盐性琼脂平板各一个，同时取10mL加入100mL增菌液中，放37℃8~16h培养后，涂上述平板进行分离，37℃培养18~24h取出观察，挑取可疑菌落，转种3.5％氯化钠三糖铁斜面，37℃、24h观察结果。
2. 涂片镜检：将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄（葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢，进行革兰氏染色镜检形态。
3. 嗜盐性试验：将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，3％，7％，10％）于37℃24h培养后观察生长情况，在无盐和10％盐的胨水中不生长，在3％和7％盐的胨水中生长良好者，继续进行下列有关试验。
4. 生化试验：分别接种下列各类生化培养基，葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、V-P，赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验，放37℃培养，除V-P、靛基质和甲基红试验培养48h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。
5. 动物试验：将上述符合各类反应的副溶血性弧菌，接种3.5％氯化钠胨水，经37℃、16~18h培养后，小鼠腹腔注射0.3mL，观察2~3d，将死亡小鼠进行解剖作分离培养。
（二）检验程序图6-1 副溶血性弧菌检验程序二、结果分析判定及注意事项（一）样品处理采样时应注意首选准备好灭菌用具及容器，以无菌手续取有代表性的样品，样品必须尽快送检，不宜存放时间过长，副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快，但不适于低温生存，在寒冷的情况下容易死亡，防止待检材料冷冻，以免影响检验结果。
副溶血性弧菌检测
副溶血性弧菌的分布与传播
分布
副溶血性弧菌主要分布在近海岸的海 水、海底沉积物和鱼贝类等海产品中 ，尤其在温带和亚热带地区的沿海水 域更为常见。
传播
副溶血性弧菌主要通过食用被污染的 海产品，尤其是生的或未煮熟透的鱼 、贝类等传播给人类。此外，也可通 过直接接触带菌的水或食物传播。
副溶血性弧菌的致病性
结果报告
根据检测结果，撰写并提交检测报告。
04 副溶血性弧菌检测的应用 与意义
在食品安全领域的应用
食品生产过程监控
副溶血性弧菌检测是食品安全监 控的重要环节，用于确保食品在 生产、加工和储存过程中的卫生
安全。
食品质量评估
通过检测食品中副溶血性弧菌的数 量和种类，评估食品的质量和安全 性，确保消费者健康。
提供科学决策依据
副溶血性弧菌检测数据可为政府和相关部门提供科学决策依据，促进 食品安全、环境保护和公共卫生领域的政策制定和实施。
05 副溶血性弧菌检测的挑战 与展望
当前面临的挑战
检测方法的局限性
目前常用的副溶血性弧菌检测方法，如培养法、免疫学方法和分子生物学方法，存在灵敏 度不高、特异性不强、操作繁琐等问题，难以满足快速、准确检测的需求。
分离培养法具有较高的特异性，但检测时间较长，且对操作人员的技术要求较高。
免疫学检测方法
免疫学检测方法利用抗体与抗原的特 异性结合来检测副溶血性弧菌，包括 间接免疫荧光法、酶联免疫吸附试验 等。
免疫学检测方法具有快速、简便的优 点，但可能出现假阳性或假阴性的结 果。
分子生物学检测方法
分子生物学检测方法利用DNA或RNA的特异性序列来检测副溶血性弧菌，如聚合酶 链式反应（PCR）、基因芯片等。
检测规范
低温贮藏条件下创伤弧菌和副溶血性弧菌失活模型的建立
有关 低温贮藏条件下对虾 中创伤弧菌 和副溶血性 弧菌失
活模 型的报道却 比较少 见。了解创 伤弧菌 、副溶血性弧 菌在对虾冷藏过程 中的失活特征 ，对建立 创伤弧菌 、副 溶血性弧菌的风险评估模型 ，提供对虾加工贮藏技术具 有理论指导意义 。本研究探讨 了 ５ ℃和． １ ８ ℃低温贮藏条 件下创伤弧菌和副溶血性弧菌的失活模型 的建立。
中国食物与 营养
２ ０ １ ３ ， １ ９ （ ２ ） ： １ ５ — １ ９
Ｆ ｏ ｏ ｄ ａ ｎ ｄ Ｎｕ ｔ ｉｔ ｆ ｉ ｏ ｎ ｉ １ ３ Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ
低 温 贮 藏 条 件 下创 伤 弧 菌 和
副 溶 血 性 弧 菌 失 活 模 型 的建 立
姬 华 ，陈 艳 ，刘秀梅 ，付 萍 ，李志刚 ，李敬光
显示 ，副溶血性弧菌是我 国上报食 源性疾病暴发事件 的 首要致病因素 。采用数学模型能够定量地 描述食 品特 性和环境 因素对致病菌生长和存活的影响 ，有助 于预测 食品的货架期 和微生物安全性 ，并 为风 险评估提供重要 的基础数据 。创伤弧菌和副溶血性弧菌 均属于低温敏 感性 细菌 ，国内外 已有研 究发现 ，在低 温贮藏 过程 中， 两种食源性弧菌 的可培养细胞数 均逐 渐下降 。但是 ，
菌Ｖ ｖ Ｆ Ｊ ０ ４ 、Ｖ ｖ Ｈ Ｂ ０ ９ 、Ｖ ｖ Ｓ Ｈ ０ ９ 。４株菌 均 在含 ３ ％ Ｎ ａ Ｃ ｌ 和４ ０ ％甘油的脑心浸液 肉汤 （ Ｂ Ｈ Ｉ ）中． ８ ０ ￣ Ｃ 保存 。菌株 接种于 含 ２ ％ Ｎ ａ Ｃ １ 的胰 蛋 白胨 大 豆 肉汤 （ Ｔ Ｓ Ｂ） 中 ， ３ ７ ￣ Ｃ 培养 ｌ ６ —２ ０ ｈ ，活化 ３代备用 。
胰蛋 白胨 大 豆 肉汤 （ Ｔ Ｓ Ｂ ） 、胰 蛋 白胨 大 豆 琼 脂 （ Ｔ Ｓ Ａ ） ，北 京陆 桥技 术有 限责 任公 司 ；脑 心 浸液 肉汤
副溶血性弧菌
副溶血性弧菌副溶血性弧菌是一种嗜盐性弧菌。
常存在于近海岸海水、海产品及盐渍食品中。
它是我国沿海地区最常见的食物中毒病原菌。
1.生物学特性（1）形态染色：革兰阴性菌，随培养基不同菌体形态差异较大，有卵圆形、棒状、球杆状、梨状、弧形等多种形态。
两极浓染。
菌体一端有单鞭毛，运动活泼。
无芽胞、无荚膜。
（2）培养特性：需氧，营养要求不高，在普通培养基中加入适量NaCl即能生长。
NaCl最适浓度为35g／L，在无盐培养基中不生长。
本菌不耐热，不耐冷，不耐酸，对常用消毒剂抵抗力弱。
生长所需pH为7. 0～9.5，最适pH为7.7.在液体培养基表面形成菌膜。
在35g／L NaCl琼脂平板上呈蔓延生长，菌落边缘不整齐，凸起、光滑湿润，不透明；在副溶血性弧菌专用选择培养基上形成1～2.5mm，稍隆起、混浊、无粘性、绿色菌落；在SS平板上不生长或长出1～2mm扁平无色半透明的菌落，不易挑起，挑起时呈粘丝状。
在羊血琼脂平板上，形成2～3mm、圆形、隆起、湿润、灰白色菌落，某些菌株可形成β溶血或α溶血。
在TCBS琼脂上不发酵蔗糖，菌落绿色。
（与霍乱弧菌相区别）（3）生化反应：本菌在30g／L NaCl和 70g／L NaCl培养基中生长，在无盐或100g／L NaCl培养基中不生长。
神奈川试验是致病菌株能使人或兔红细胞发生溶血，对马红细胞不溶血，称神奈川试验阳性。
2.微生物学检验1）标本采集：主要是患者的粪便、可疑食物、炊事用具的洗涤液等。
2）检验方法及鉴定：①增菌培养：取标本0.5～1ml接种40g／L N aCl蛋白胨水中，37℃培养，若有本菌存在，一般数小时即出现明显混浊，即可分离培养；②分离培养：将标本或增菌培养物接种副溶血弧菌选择培养基35℃培养18～24h观察结果。
菌落湿润、混浊无粘性，呈绿色；③鉴定：根据其形态、染色、多形性、活泼动力等特点，以及在选择培养基上的菌落特征，结合氧化酶试验阳性，在KIA上K/A，H2S （-）。
副溶血性弧菌
一、关于副溶血性弧菌副溶血性弧菌(又称嗜盐菌 Vibrio Parahaemolyticus)是革兰氏阴性多形态杆菌或稍弯曲弧菌。
该菌嗜盐畏酸，在无盐培养基上，不能生长，3%～6%食盐水繁殖迅速，每8～9分钟为1周期，低于0.5%或高于8%盐水中停止生长。
在食醋中1～3分钟即死亡，加热56℃5～10分钟灭活，在1%盐酸中5分钟死亡。
副溶血性弧菌分布极广，主要分布在海水和水产品中，我国华东地区沿岸的海水的副溶血性弧菌检出率为47.5%～66.5%，海产鱼虾的平均带菌率为45.6%～48.7%，夏季可高达90%以上。
海水是副溶血性弧菌的污染源。
海水弧菌包括很多种，主要分为5群：副溶血性弧菌，溶藻性弧菌(V.alginolyticus)，伤口弧菌(V.vulnificus)，梅契尼柯夫弧菌(V.Mechnikov)(CDC肠群16)，F群弧菌(CDC EF-6)。
副溶血性弧菌是胃肠炎的致病菌之一，但很少引起软组织感染和败血症。
上述5群嗜盐性弧菌生活于海水和海洋鱼、蟹、贝壳和甲壳类动物中，通常引起胃肠道感染，也可引起肠道外感染。
最近证明，这些弧菌能直接通过皮肤破口侵入引起软组织感染或经血液循环(败血症)播散至软组织而引起坏死性感染。
各种弧菌对人和动物均有较强的毒力，其致病物质主要有分子量42000的致热性溶血素(TDH)和分子量48000的类似溶血毒(TRH)，具有溶血活性、肠毒素和致死作用。
该菌有侵袭作用，其产生的TDH和TRH的抗原性和免疫性相似，皆有溶血活性和肠毒素作用，可引致肠袢肿胀、充血和肠液潴留，引起腹泻。
TDH对心脏有特异性心脏毒，可引起心房纤维性颤动、期前收缩或心肌损害。
主要病理变化为空肠及回肠有轻度糜烂，胃粘膜炎、内脏(肝、脾、肺)淤血等。
二、由副溶血性弧菌引起的对虾偷死病的症状事实证明，2010年爆发的对虾“偷死病”是由副溶血性弧菌引起。
在养殖池塘中，随虾苗或其它传染途径带入的高耐药性副溶血弧菌附着在饲料、残饵、有机碎屑、死藻上不断繁殖，对虾吃食后出现了副溶血性弧菌食物中毒，其症状：对虾少量进食或不进食，肠胃空无食物，肝胰脏明显萎缩，虾体不红（变得更透明）。
副溶血性弧菌的特征、分布及其致病风险评估研究概述
副溶血性弧菌的特征、分布及其致病风险评估研究概述作者：宫春波张良华陶文靖来源：《食品安全导刊》2019年第08期本文对副溶血性弧菌的个体形态、群体形态、生物学特征、食品中的分布情况及其快速检测方法进行了阐述。
同时，介绍了食品中副溶血性弧菌的致病因子，并阐述了致病风险的评估步骤，以期推进食品中副溶血性弧菌致病风险的预测，并对风险预警、风险交流以及防控措施的制定有所帮助。
副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，简称“VP”）是细菌性食源性疾病的主要致病菌之一，其为嗜盐性细菌，主要侵染海产品和盐含量较高的食品。
有研究表明，近年来淡水产品中VP的检出率呈现上升趋势，并表现出多物种、多环节以及季节性的高污染特征。
目前，VP已成为沿海国家和地区急性胃肠炎的重要病原菌之一。
在我国，副溶血性弧菌引起的食物中毒已高居微生物性食物中毒的第二位。
从食品类别来看，动物性水产品中VP的检出率一直维持在较高水平，并呈上升趋势——已连续多年成为我国主要的食源性水产品致病菌。
与此同时，引起副溶血性弧菌食物中毒的食物载体也由传统的海产品转向诸如咸菜、咸鸭蛋等多类别食品。
食用被VP污染的全生或半生以及未充分煮熟的食品是导致该菌食源性疾病暴发的主要因素。
VP的潜伏期为8～40h，最高可达96h，典型的临床症状是腹泻（水样便或血样便）、上腹部痉挛、恶心呕吐、发热等。
1 VP的生物学特征副溶血性弧菌个体形态多样，呈现棒状、弧状、卵圆状，G-，无芽孢，兼性厌氧，嗜盐、不耐热，50℃加热20min、65℃加热5min或80℃加热1min即可杀死该菌。
VP的生长温区为10～44℃，最适生长温度为30～35℃；生长pH值范围为4.8～11.0，最适生长pH值为7.6～8.6。
该菌能够在1%～8%的NaCl环境中存活，在低NaCl或无NaCl环境中停止生长或死亡。
但研究表明，淡水产品中VP污染率呈逐年上升趋势，为4.7%～41.4%。
副溶血弧菌及其检测方法
副溶血弧菌及其检测方法1.副溶血弧菌副溶血性弧菌(又称嗜盐菌Vibrio Parahaemolyticus)是革兰氏阴性多形态杆菌或稍弯曲弧菌。
本菌嗜盐畏酸，在无盐培养基上，不能生长，3%～6%食盐水繁殖迅速，每8～9分钟为1周期，低于0.5%或高于8%盐水中停止生长。
在食醋中1～3分钟即死亡，加热56℃5～10分钟灭活，在1%盐酸中5分钟死亡。
副溶血性弧菌食物中毒也称嗜盐菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品或盐腌渍品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等，其次为蛋品、肉类或蔬菜。
临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。
主要病理变化为空肠及回肠有轻度糜烂，胃粘膜炎、内脏(肝、脾、肺)淤血等。
已知副溶血弧菌有13种O抗原及65种K抗原，据其发酵糖类的情况可分为5个类型。
各种弧菌对人和动物均有较强的毒力，其致病物质主要有分子量42000的致热性溶血素(TDH)和分子量48000的TDH类似溶血毒(TRH)，具有溶血活性、肠毒素和致死作用。
2.副溶血弧菌的检测方法（1）溶血性试验我妻氏用高盐血琼脂培养基，在限定的条件下培养副溶血性弧菌时出现的溶血反应，称此溶血性能为“神奈川现象”。
此试验要求是用人或兔的新鲜红血球制备高盐血平板，经37℃、24h培养，如在单个菌落周围呈现透明溶血环或在菌落下面有明显溶血者，为“神奈川现象”阳性，若不出现透明溶血环或无明显溶血者，为“神奈川现象”阴性。
有致病性的副溶血性弧菌，多数为神奈川现象阳性，但亦有少数为阴性。
（2）血清学试验副溶血性弧菌有三种抗原，即O抗原（菌体抗原），Ｋ抗原（荚膜抗原）及Ｈ抗原（鞭毛抗原），其中血清学分类上有意义的是前两者：O抗原有13种血清群，K抗原有65种血清型。
进行副溶血性弧菌血清学鉴定时，可用O抗原分群，将18-24h的培养物，用3％食盐水作成较浓的菌悬液，121℃高压1h或100℃煮沸后，用此菌悬液进行O抗血清玻片凝集试验，同时用无菌生理盐水作对照，如O凝集反应阳性时，可用不经加热的菌悬液进行Ｋ抗血清玻片凝集反应分型判定。
中国医学微生物菌种保藏管理办法
中国医学微生物菌种保藏管理办法根据中国微生物菌种保藏委员会管理和组织条例的规定，为了加强医学微生物菌种(以下简称菌种)的保藏管理，特制定本管理办法。
第一条组织及任务在卫生部领导下，在中国微生物菌种保藏委员会指导下，设下列医学微生物菌种保藏管理中心:中国医学真菌菌种保藏管理中心:由中国医学科学院皮肤病防治研究所负责。
中国医学细菌菌种保藏管理中心:由卫生部药品生物制品检定所负责。
中国医学病毒菌种保藏管理中心:由中国预防医学中心病毒学研究所负责。
保藏管理中心的任务是:(一)负责本门类微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应;(二)开展菌种分类、鉴定及保藏管理的研究;(三)组织学术交流和经验交流;(四)办理国内外菌种交换;(五)编制保管的菌种目录。
保藏管理中心下设专业实验室，承担全国性的业务工作。
专业实验室对其直接领导机构和保藏管理中心负责，并定期向管理中心汇报工作情况。
其具体任务是:(一)负责本专业有关微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应;(二)承担本专业有关疑难菌种鉴定;(三)开展有关菌种分类、鉴定、保藏的研究，包括新技术、新方法的研究和应用;(四)办理对外交流和交换菌种。
各专业实验室科研技术人员的编制和经费由所属主管部门负责。
生物制品生产、检定用的菌种按"生物制品生产、检定用菌种、毒种管理规程"执行，统一由卫生部药品生物制品检定所办理。
第二条菌种的分类菌种的分类根据其危险性决定(包括实验室感染的可能性，感染后发病的可能性，症状轻重及愈后情况，有无致命危险及有效的防止实验室感染方法，用一般的微生物操作方法能否防止实验室感染、我国有否此种菌种及曾否引起流行、人群免疫力等情况)。
依其危险程度的大小，我国的菌种分为四类。
一类:实验室感染的机会多，感染后发病的可能性大，症状重并能危及生命，缺乏有效的预防方法，以及传染性强，对人群危害性大的烈性传染病，包括国内未发现或虽已发现，但无有效防治方法的烈性传染病菌种。
副溶血性弧菌使用说明
副溶血性弧菌编号 名称北京华越洋生物NRR00440 副溶血性弧菌基本信息：名称：副溶血性弧菌规格：300ul甘油菌储存温度：-‐80℃基因组：副溶血性弧菌简介：副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus，VP），为革兰氏阴性杆菌，呈弧状、杆状、丝状等多种形状，无芽孢。
副溶血性弧菌是一种嗜盐性细菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品。
此菌对酸敏感，在普通食醋中5分钟即可杀死，对热的抵抗力较弱，对常用消毒剂抵抗力很弱，可被低浓度的酚和煤酚皂溶液杀灭。
在对该菌进行培养的最适宜的培养基：温度为30℃—37℃，含盐2.5%—3%(若盐浓度低于0.5%则不生长)，pH 值为8.0—8.5。
操作说明：1，本品包含一份甘油菌，使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。
也可以完全融解后使用，但随着冻融次数的增加，细菌的活力会逐渐下降。
2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆菌落进行后续操作。
冷冻管开封：用浸过75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。
菌株复溶：无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取1ml 左右复溶液，加入到冷冻管中。
轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。
菌株复壮：用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。
做好标识，在适宜温度下培养。
细菌在30-‐35℃培养箱中培养24-‐48h，真菌在23-‐28℃培养箱中培养24-‐72h （必要时，可适当延长培养时间）。
菌株传代：将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量增大接种量：如用无菌吸管吸取≥50μl 新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。
注意事项：1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放置会导致菌种衰退；2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行；3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能正常生长；4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来电询问；5、某些厌氧菌的培养，自开封到接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧状态；培养过程中亦要保持厌氧状态；6、某些菌种，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需要5-‐10%CO2 促进生长；7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况，应停止使用对应产品。
副溶血弧菌的活化条件
副溶血弧菌的活化条件
副溶血弧菌是一种嗜盐细菌，必须在含盐%-8%的环境中才能生长，且最适宜的生长盐浓度为2%-4%。
这种细菌无法在无盐的培养基上生长，在含盐
浓度过高（10%以上）的培养基上也无法生长。
副溶血弧菌能在温度为5-44℃的范围内生长，但最佳的生长温度为30-35℃，当温度低于40℃时停止生长。
此外，该细菌适宜的pH值为，其中
最为适宜，在pH低于6的酸性条件下生长不佳。
副溶血弧菌对酸敏感，在食醋中3分钟即可死亡。
该菌不耐热，当温度达到56℃时，5分钟内即可死亡，90℃时，1分钟内即可失去活性。
在低温环境中，副溶血弧菌容易死亡。
以上内容仅供参考，建议查阅关于副溶血弧菌的文献资料或咨询微生物学家，获取更准确的信息。
副溶血性弧菌检测方法
副溶血性弧菌检测方法
副溶血性弧菌检测方法主要有以下几种：
1. 细菌培养：将样品（如血液、粪便等）在适当的培养基上进行培养，副溶血性弧菌会在适宜条件下生长繁殖，通过观察菌落形态和生理生化特性来鉴定是否存在副溶血性弧菌。
2. PCR检测：利用聚合酶链反应（PCR）方法，通过扩增副溶血性弧菌特异性基因片段，进行定性和定量检测。
这种方法具有高度的灵敏度和特异性。
3. 免疫学检测：利用副溶血性弧菌的特异性抗原与抗体的结合反应来进行检测。
常见的方法有免疫荧光、酶联免疫吸附试验（ELISA）等。
4. 纳米粒子检测：利用特定的纳米粒子与副溶血性弧菌的抗原或DNA结合，形成可见颜色或光信号，通过肉眼观察或仪器读取来检测副溶血性弧菌。
需要注意的是，不同检测方法的适用场景和准确性有所差异，因此在实际应用中需要根据具体情况选择合适的检测方法。
副溶血性弧菌生长特性及双因素预警模型的研究的开题报告
副溶血性弧菌生长特性及双因素预警模型的研究的开题报
告
研究背景：
副溶血性弧菌是一种常见的水生动物病原菌，对人类健康和经济造成了极大的威胁。
目前，副溶血性弧菌污染水产品的发生率逐年增加，已成为世界各地的公共卫生问题。
因此，开展副溶血性弧菌的生长特性与预警模型研究，对于保障水产品的质量与安全具有重要意义。
研究内容与目的：
本研究旨在探究副溶血性弧菌的生长特性及其影响因素，建立一种双因素预警模型。
具体研究内容包括：
1.研究副溶血性弧菌的生长特性，探讨温度和盐度等生理因素对其生长的影响规律；
2.探究不同来源的水产品中副溶血性弧菌的污染状况，并分析其与温度、盐度等环境因素的关系；
3.基于研究结果，建立副溶血性弧菌的双因素预警模型，为水产品的安全生产提供科学依据。
研究方法：
本研究将采用实验室和野外取样相结合的方法，分析不同来源的水产品中副溶血性弧菌的污染状况。
同时，对副溶血性弧菌在不同温度和盐度条件下的生长特性进行研究，得出其生长速率、最适生长温度和盐度等关键参数。
最后，基于实验数据，建立副溶血性弧菌的双因素预警模型。
预期成果与意义：
通过本研究，可建立副溶血性弧菌生长特性及预警模型，为水产品生产企业提供科学依据，帮助其制定更加严格的产品质量控制标准。
同时，研究结果可为副溶血性弧菌的监测和防控提供理论依据和技术支持，有助于提高水产品的质量和安全水平，保障消费者的健康和权益。
副溶血性弧菌保藏条件研究
副溶血性弧菌保藏条件研究作者：杨胜远韦锦李卓文等来源：《湖北农业科学》2014年第18期摘要：针对副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）在低温条件下容易进入不可培养状态，难以保藏的问题，通过平板菌落计数法对副溶血性弧菌的4 ℃冰箱保藏条件进行了探讨。
结果表明，NaCl对副溶血性弧菌4 ℃保藏有保护作用，其中以45 g/L NaCl保护效果最佳，而且45 g/L NaCl不影响副溶血性弧菌的生长。
将副溶血性弧菌细胞浸于45 g/L NaCl溶液或以含45 g/L NaCl的培养基培养后直接于4 ℃保藏，保藏90 d，活细胞数仅由109下降到106。
关键词：副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）；甘油；培养基；NaCl中图分类号：TS207.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）18-4395-04副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种嗜盐性细菌，广泛存在于世界各国的沿海地区，隶属于弧菌科弧菌属，是食源性疾病的重要病原菌，副溶血性弧菌引起的食物中毒已高居微生物食物中毒的首位[1，2]。
为了控制副溶血性弧菌引起的食源性疾病，国内外学者已对副溶血性弧菌的检测、预测模型及风险评估、群体感应、防控方法、致病机理等领域研究给予了极大关注[3–11]。
然而，由于副溶血性弧菌在低温条件下很容易进入不可培养状态[12，13]，采用常规的斜面或半固体培养基在4 ℃冰箱保藏的时间很短，通常4 ℃保藏15～30 d已无法通过国家标准GB/T 4789.7–2013的3%氯化钠碱性蛋白胨水培养基[14]或TCBS琼脂培养基活化。
一些研究或检验机构为了保藏副溶血性弧菌标准菌株，常采用室温保藏或-80 ℃冷冻保藏。
虽然室温保藏成本低，但是需要经常转接活化，不断传代容易发生菌种变异，难以满足菌种保藏“在一定时间内使菌种不死、不变、不乱”的基本要求；副溶血性弧菌是病原菌，需要执行双人双锁管理，频繁的转接菌种和培养操作，增加了菌种保藏和安全防护的工作量。
副溶血性弧菌生物被膜培养条件及优化(精)
副溶血性弧菌生物被膜的形成与优化渠宏雁孟良玉刘锦峰蔡文倩卢佳琨张霞兰桃芳励建荣(渤海大学化学化工与食品安全学院,辽宁省食品安全重点实验室,辽宁省高校重大科技平台“ 食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心” 辽宁锦州 121013摘要本文主要探讨了各种环境因子对副溶血性弧菌生物被膜形成的影响,旨在为以后控制细菌形成生物被膜提供依据。
选用副溶血性弧菌为研究对象,采用微孔板检测法,用酶标仪测得的 OD 630值确定副溶血性弧菌生成生物被膜的最佳条件。
试验结果表明:起始细菌浓度 7 logcfu/mL、培养温度 28℃、培养基 NaCl 含量3%、培养基起始 pH 8~9时,测得的 OD 630值最大;培养基中分别加入蔗糖、乳糖、葡萄糖, OD 630值均增加,且均在含量 2%时促进效果最明显;培养基未稀释时,测得的 OD 630值最大,且随着培养基稀释度的增加而减小; 培养基中添加 Ca 2+促进生物被膜的形成而添加 Mg 2+、 Cu 2+、 Fe 3+对生物被膜的形成有抑制作用。
因此,副溶血性弧菌能形成稳定而明显的生物被膜,且生物被膜的形成受温度、 NaCl 浓度、 pH 值等环境因子的影响。
关键词副溶血性弧菌;生物被膜;优化细菌生物被膜 (Bacterial biofilm,BF 是指附着于生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有机组织的细胞群体。
它们是细胞间相互协调,以多细胞群体形式组成的复杂结构,是许多微生物适应外界环境的一种生活方式 [1-4]。
据世界卫生组织估计,全世界每年数以亿计的食源性疾病患者中有 70%是由于食用各种致病性微生物污染的食品和水源造成的 [5]。
根据美国 CDC 统计,大约 65%的人类细菌性感染是由 BF 细菌引起的 [6]。
大量研究证实,几乎所有的细菌都可形成生物被膜。
形成生物被膜被认为是导致食品加工环境中细菌持续存在的一个主要原因 [7-9]。
基金项目:“ 十二五” 国家科技支撑计划(课题编号:2012BAD29B06 ;辽宁省食品安全重点实验室暨辽宁省高校重大科技平台“ 食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心” 开放课题(LNSAKF2011020 。
副溶血性弧菌拮抗菌的筛选及其拮抗条件
副溶血性弧菌拮抗菌的筛选及其拮抗条件杨胜远;韦锦【摘要】对分别分离自菜园土壤、大蒜植株、大豆植株、蔓花生植株、淡水湖淤泥、仙人掌植株、芹菜植株、细菌型豆豉和日本纳豆的可产抗大肠杆菌活性物质的42株细菌进行筛选，获得1株对副溶血性弧菌具有较强拮抗作用的菌株JNT02，其发酵液对副溶血性弧菌的抑菌圈直径为（20．87±0．83） mm ；经16S rDNA序列分析和系统发育分析，菌株JNT02与枯草芽孢杆菌位于同一簇群，同源性达100％，初步鉴定为枯草芽孢杆菌；枯草芽孢杆菌JNT02在改良兰迪培养基中24 h可完全杀灭共培养的副溶血性弧菌，并且种子液带入的抗菌物质对其拮抗作用有累积效应，在氯化钠碱性蛋白胨水培养基中枯草芽孢杆菌JNT02对副溶血性弧菌却只有一定抑制作用，在人工海水中没有拮抗作用；改良兰迪培养基有利于枯草芽孢杆菌JNT02产抗菌物质。
结果表明，枯草芽孢杆菌JNT02对副溶血性弧菌的拮抗作用主要依赖于其代谢产生的抗菌活性物质，取决于环境条件是否有利于其产生抗菌活性物质，而并非是否有利于其生长。
%The strain JNT02 ,which showed significantly inhibitory effects on the growth of Vibrio parah‐aemolyticus with (20 .87 ± 0 .83) mm diameter of antibiotic circle fermented broth for antimicrobial activity assay ,was screened from 42 bacterial strains isolated from vegetable garden soils ,garlicplants ,soybean plants ,vine peanut plants ,freshwater lake silts ,cactus plants ,celery plants ,bacterial soybean lobster sauce and Japanese natto especially producing antibiotic substances against Escherichia coli .The strain JNT02 was classified into Bacillus subtilis base on 16S rDNA sequence and phylogenic analysis .In the im‐proved Landymedia ,B .subtilis JNT02 completely killed the co‐culturedV .parahaemolyticus in 24 h , and the enhancement of antagonistic effects of the antimicrobial substances brought from the B .subtilis JNT02 seed broth were also demonstrated .However ,B .subtilis JNT02 showed weak inhibitory effects a‐gainst the growth of V . parahaemolyticus in alkaline‐pepto ne‐water media and no antagonistic effects in artificial seawater .The improved Landy media were propitious to the antimicrobial substance production of B .subtilis JNT02 .The findings indicated that the antagonistic action of B .subtilis JNT02 against V . parahaemolyticus was via the antimicrobial substance producing ,and depended on the conditions of the an‐timicrobial substance production ,in stead of the growth of B .subtilis JNT02 .【期刊名称】《水产科学》【年(卷),期】2014(000)012【总页数】7页(P807-813)【关键词】副溶血性弧菌;拮抗菌;拮抗条件;枯草芽孢杆菌【作者】杨胜远;韦锦【作者单位】韩山师范学院生物学系，广东潮州 521041;韩山师范学院图书馆，广东潮州 521041【正文语种】中文【中图分类】S917.1副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)为嗜盐性细菌，广泛存在于世界各国的沿海地区，隶属于弧菌科弧菌属，是食源性疾病的重要病原菌[1]，也是海洋生物的主要病原菌之一[2-3]。
副溶血性弧菌保藏条件研究
副溶血性弧菌保藏条件研究杨胜远;韦锦;李卓文;方晓旋;赖演莲;杨娜;陈晓屏【摘要】针对副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolytic us)在低温条件下容易进入不可培养状态,难以保藏的问题,通过平板菌落计数法对副溶血性弧菌的4℃冰箱保藏条件进行了探讨.结果表明,NaCl对副溶血性弧菌4℃保藏有保护作用,其中以45g/L NaCl保护效果最佳,而且45 g/L NaCl不影响副溶血性弧菌的生长.将副溶血性弧菌细胞浸于45 g/L NaCl溶液或以含45 g/L NaCl的培养基培养后直接于4℃保藏,保藏90 d,活细胞数仅由109下降到106.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2014(053)018【总页数】4页(P4395-4398)【关键词】副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus);甘油;培养基;NaCl【作者】杨胜远;韦锦;李卓文;方晓旋;赖演莲;杨娜;陈晓屏【作者单位】韩山师范学院生物学系,广东潮州521041;韩山师范学院图书馆,广东潮州521041;韩山师范学院生物学系,广东潮州521041;韩山师范学院生物学系,广东潮州521041;韩山师范学院生物学系,广东潮州521041;韩山师范学院生物学系,广东潮州521041;韩山师范学院生物学系,广东潮州521041【正文语种】中文【中图分类】TS207.4副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种嗜盐性细菌，广泛存在于世界各国的沿海地区，隶属于弧菌科弧菌属，是食源性疾病的重要病原菌，副溶血性弧菌引起的食物中毒已高居微生物食物中毒的首位［1，2］。
为了控制副溶血性弧菌引起的食源性疾病，国内外学者已对副溶血性弧菌的检测、预测模型及风险评估、群体感应、防控方法、致病机理等领域研究给予了极大关注［3–11］。
然而，由于副溶血性弧菌在低温条件下很容易进入不可培养状态［12，13］，采用常规的斜面或半固体培养基在4℃冰箱保藏的时间很短，通常4℃保藏15～30 d已无法通过国家标准GB／T 4789.7–2013的3%氯化钠碱性蛋白胨水培养基［14］或TCBS琼脂培养基活化。
副溶血性弧菌7种保藏方法比较
副溶血性弧菌7种保藏方法比较张永华;李怡;范斌;宋增福;张庆华【摘要】@@%采用7种不同方法对副溶血性弧菌的保藏效果进行研究,以菌种的保藏时间、存活率、生物学特性及毒力指标比较保藏效果.结果表明:保藏时间由长到短依次为:冷冻真空干燥保藏法＞-20℃脱脂牛奶保藏法＞室温液体石蜡保藏法＞4℃液体石蜡保藏法＞-20℃甘油保藏法＞室温斜面保藏法＞4℃斜面保藏法.7种方法保藏前后,副溶血性弧菌革兰氏染色,氧化酶,0 NaCl、4％ NaCl及10％ NaCl盐度生长试验,TCBS培养基上生长性状及溶血性试验等基本生物学特性均无影响.冷冻真空干燥法毒力稳定,其他保藏方法超过12个月后毒力出现不同程度的下降.采用室温斜面法保藏2个月,菌种生物学特性和毒力均稳定,操作最简便,适宜短期保藏；采用冷冻真空干燥法保藏24个月以上,或采用-20℃脱脂牛奶法保藏20个月,菌种生物学特性均稳定,这2种方法适宜长期保藏.【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2012(040)010【总页数】3页(P209-211)【关键词】副溶血性弧菌;保藏方法;保藏时间;存活率;毒力【作者】张永华;李怡;范斌;宋增福;张庆华【作者单位】上海海洋大学水产与生命学院/省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海201306;上海海洋大学水产与生命学院/省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海201306;上海海洋大学水产与生命学院/省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海201306;上海海洋大学水产与生命学院/省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海201306;上海海洋大学水产与生命学院/省部共建水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海201306【正文语种】中文【中图分类】Q93-336副溶血性弧菌 (Vibrio parahaemolyticus)是一种嗜盐性细菌，隶属于弧菌科弧菌属，是人畜共患病的病原[1]。
副溶血性弧菌增菌培养方法
用 途：用于副溶血性弧菌增菌培养。
副溶血性弧菌，进食含有该菌的食物致可食物中毒，也称嗜盐菌食物中毒。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。副溶血性弧菌是一种海洋细菌，主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品。
原 理：蛋白胨和提供碳源、氮源、维生素培养基配方(每升)：
蛋白胨10
氯化钠60
最终pH 7.2±0.2
使用方法
1、称取本培养基70g，加入蒸馏水或去离子水1L，分装试管，每管10ml，121℃高压灭菌15min，备用。
2、选择3个连续适宜的稀释度，各吸取1mL稀释液，加入10mL培养基中，每一稀释度接种3管，于36℃±1℃培养18～24h。
质量控制：
下列质控菌株接种后于36℃±1℃培养18～24h结果如下：
菌 名 菌 号 生长状况 培养特征
副溶血性弧菌 ATCC17802 良好 肉汤浑浊
大肠埃希氏菌 ATCC25922 部分抑制 ----
贮 存：贮存于避光、阴凉干燥处，用后立即旋紧瓶盖。贮存期三年。
规 格：250g
中国医学微生物菌种保藏管理办法
《中国医学微生物菌种保藏管理办法》中文名中国医学微生物菌种保藏管理办法颁布单位卫生部颁布时间1985.03.23实施时间1985.03.23中国医学微生物菌种保藏管理办法根据中国微生物菌种保藏委员会管理和组织条例的规定，为了加强医学微生物菌种（以下简称菌种）的保藏管理，特制定本管理办法。
第一条组织及任务在卫生部领导下，在中国微生物菌种保藏委员会指导下，设下列医学微生物菌种保藏管理中心：中国医学真菌菌种保藏管理中心：由中国医学科学院皮肤病防治研究所负责。
中国医学细菌菌种保藏管理中心：由卫生部药品生物制品检定所负责。
中国医学病毒菌种保藏管理中心：由中国预防医学中心病毒学研究所负责。
保藏管理中心的任务是：（一）负责本门类微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应；（二）开展菌种分类、鉴定及保藏管理的研究；（三）组织学术交流和经验交流；（四）办理国内外菌种交换；（五）编制保管的菌种目录。
保藏管理中心下设专业实验室，承担全国性的业务工作。
专业实验室对其直接领导机构和保藏管理中心负责，并定期向管理中心汇报工作情况。
其具体任务是：（一）负责本专业有关微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应；（二）承担本专业有关疑难菌种鉴定；（三）开展有关菌种分类、鉴定、保藏的研究，包括新技术、新方法的研究和应用；（四）办理对外交流和交换菌种。
各专业实验室科研技术人员的编制和经费由所属主管部门负责。
生物制品生产、检定用的菌种按“生物制品生产、检定用菌种、毒种管理规程”执行，统一由卫生部药品生物制品检定所办理。
第二条菌种的分类菌种的分类根据其危险性决定（包括实验室感染的可能性，感染后发病的可能性，症状轻重及愈后情况，有无致命危险及有效的防止实验室感染方法，用一般的微生物操作方法能否防止实验室感染、我国有否此种菌种及曾否引起流行、人群免疫力等情况）。
依其危险程度的大小，我国的菌种分为四类。
一类：实验室感染的机会多，感染后发病的可能性大，症状重并能危及生命，缺乏有效的预防方法，以及传染性强，对人群危害性大的烈性传染病，包括国内未发现或虽已发现，但无有效防治方法的烈性传染病菌种。
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副溶血性弧菌保藏条件研究作者：杨胜远韦锦李卓文等来源：《湖北农业科学》2014年第18期摘要：针对副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）在低温条件下容易进入不可培养状态，难以保藏的问题，通过平板菌落计数法对副溶血性弧菌的4 ℃冰箱保藏条件进行了探讨。
结果表明，NaCl对副溶血性弧菌4 ℃保藏有保护作用，其中以45 g/L NaCl保护效果最佳，而且45 g/L NaCl不影响副溶血性弧菌的生长。
将副溶血性弧菌细胞浸于45 g/L NaCl溶液或以含45 g/L NaCl的培养基培养后直接于4 ℃保藏，保藏90 d，活细胞数仅由109下降到106。
关键词：副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）；甘油；培养基；NaCl中图分类号：TS207.4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）18-4395-04副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种嗜盐性细菌，广泛存在于世界各国的沿海地区，隶属于弧菌科弧菌属，是食源性疾病的重要病原菌，副溶血性弧菌引起的食物中毒已高居微生物食物中毒的首位[1，2]。
为了控制副溶血性弧菌引起的食源性疾病，国内外学者已对副溶血性弧菌的检测、预测模型及风险评估、群体感应、防控方法、致病机理等领域研究给予了极大关注[3–11]。
然而，由于副溶血性弧菌在低温条件下很容易进入不可培养状态[12，13]，采用常规的斜面或半固体培养基在4 ℃冰箱保藏的时间很短，通常4 ℃保藏15～30 d已无法通过国家标准GB/T 4789.7–2013的3%氯化钠碱性蛋白胨水培养基[14]或TCBS琼脂培养基活化。
一些研究或检验机构为了保藏副溶血性弧菌标准菌株，常采用室温保藏或-80 ℃冷冻保藏。
虽然室温保藏成本低，但是需要经常转接活化，不断传代容易发生菌种变异，难以满足菌种保藏“在一定时间内使菌种不死、不变、不乱”的基本要求；副溶血性弧菌是病原菌，需要执行双人双锁管理，频繁的转接菌种和培养操作，增加了菌种保藏和安全防护的工作量。
-80 ℃冷冻保藏可以抑制副溶血性弧菌的代谢，菌种不易发生变异，但是超低温冰箱价格贵，能耗高，普通实验室无法满足保藏条件，而且菌种使用前需解冻，使用不便，反复冻融操作还会导致菌种死亡。
普通冰箱价格相对便宜，一般实验室均具备，因此如能解决副溶血性弧菌在低温条件下易进入不可培养状态的问题，实现4 ℃冰箱保藏将对相关的研究和检验工作具有极大的推动作用。
本研究旨在对副溶血性弧菌的4 ℃冰箱保藏条件进行研究，探寻一种方便的副溶血性弧菌短期保藏方法。
1 材料与方法1.1 材料菌株：副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）CP1由广东海洋大学孙力军教授惠赠。
试剂：TCBS琼脂培养基，青岛海博生物技术有限公司生产；其他试剂均为市售国产生化试剂或分析纯试剂。
仪器：LRH-250型恒温培养箱，上海-恒科学仪器有限公司；HZQ-X100型恒温双层振荡培养箱，太仓市实验设备厂；VX-200型漩涡混合仪，美国Labnet公司。
培养基：30 g/L氯化钠碱性蛋白胨水琼脂培养基（Alkaline Peptone Water Agar， APWA）及30 g/L氯化钠碱性蛋白胨水（Alkaline Peptone Water， APW）参照文献[14]进行配制，其中APWA培养基的琼脂用量改为10 g/L，APW培养基只对氯化钠浓度进行相应调整。
1.2 试验方法1.2.1 副溶血性弧菌的培养从副溶血性弧菌斜面挑取1环菌苔接入装有100 mL 30 g/L NaCl-APW 培养基的250 mL三角瓶，于37 ℃、120 r/min摇床培养12 h，作为种子液和保藏所需的培养液。
1.2.2 副溶血性弧菌计数取待测样品1 mL加入9 mL NaCl溶液（30 g/L）中，旋涡混匀，记为10-1；取10-1稀释液1 mL加入9 mL NaCl溶液（30 g/L）中，旋涡混匀，记为10-2；如此依次进行10倍梯度稀释至10-8。
分别取适宜稀释度的稀释液1 mL于无菌培养皿中，倾注冷却到50 ℃左右的30 g/L NaCl-APWA培养基15 mL，混匀、静置凝固，于37 ℃倒置培养18 h，进行菌落计数。
每个稀释度重复3块平板，取平均值作为该稀释度的菌落总数。
1.2.3 不同保护剂对副溶血性弧菌保藏的影响将副溶血性弧菌培养液分别与无菌水、无菌30 g/L NaCl溶液、无菌40 g/L甘油水溶液、无菌30 g/L NaCl-40 g/L甘油复合溶液按体积比1∶1进行混合，再用漩涡混合仪充分混匀，然后分装2 mL无菌Eppendorf离心管，加盖密闭作为保藏管。
分为3组，分别置于25、4 、-20 ℃下保藏，定时取样测定副溶血性弧菌数。
1.2.4 NaCl浓度对副溶血性弧菌保藏的影响将副溶血性弧菌培养液分别与10、20、30、40、50、60、70 g/L的无菌NaCl溶液按体积比1∶1进行混合并用漩涡混合仪充分混匀，然后分装2 mL无菌Eppendorf离心管，加盖密闭作为保藏管，置于4 ℃保藏，定时取样测定副溶血性弧菌数。
均设3个平行试验。
由于原培养基含有30 g/L NaCl，因此混合液的NaCl终浓度理论值分别为20、25、30、35、40、45、50 g/L。
1.2.5 NaCl浓度对副溶血性弧菌生长的影响分别取5 mL副溶血性弧菌种子液接入含NaCl 浓度分别为30、35、40、45、50 g/L的APW培养基，于37 ℃、120 r/min摇床培养24 h，然后测定各培养液副溶血性弧菌数。
1.2.6 副溶血性弧菌4 ℃保藏条件验证分别取1 mL副溶血性弧菌种子液接入45 g/L NaCl-APW培养基，于37 ℃、120 r/min摇床培养24 h，然后置于4 ℃冰箱保藏，间隔30 d取样测定副溶血性弧菌数；从副溶血性弧菌斜面挑取1环菌苔于45 g/L NaCl-APWA斜面，于37 ℃恒温培养24 h，加入5 mL无菌45 g/L NaCl溶液覆盖斜面的菌苔，然后置于4 ℃冰箱保藏，间隔30 d摇匀后用接种环随机沾取菌悬液1环于45 g/L NaCl-APWA斜面和TCBS斜面进行划线，于37 ℃恒温培养24 h，定性观察副溶血性弧菌数生长情况。
2 结果与分析2.1 保护剂对副溶血性弧菌保藏的影响不同保护剂对副溶血性弧菌保藏的影响见图1。
由图1可知，加无菌水和30 g/L NaCl25 ℃保藏较4 ℃和-20 ℃保藏残存的副溶血性弧菌活菌数高，但由于副溶血性弧菌在25 ℃仍处于旺盛的代谢繁殖状态，在保藏过程中一直处于不断分裂，传代次数越多，菌种发生变异的几率也越大，因此仍以低温保藏更具价值。
图1显示，4 ℃和-20 ℃低温保藏条件下，加无菌水组的细胞存活率非常低，而加30 g/L NaCl组的细胞存活率较高，保藏30 d，残存活菌数仍可达到107。
结果表明，一定浓度的NaCl有利于减缓副溶血性弧菌的冷伤害。
甘油常作为菌种冷冻保藏的冷冻保护剂，添加40 g/L甘油和30 g/L NaCl-40 g/L甘油复合溶液的试验组结果显示，甘油对副溶血性弧菌影响很大，25 ℃保藏30 d已检测不到活菌，虽然4 ℃和-20 ℃保藏30 d仍有副溶血性弧菌存活，但残存活菌数很低，已由原来的108下降到103。
从方便使用和短期保藏的角度考虑，选择NaCl作为保护剂，对副溶血性弧菌4 ℃保藏条件进行进一步探讨。
2.2 NaCl浓度对副溶血性弧菌保藏的影响由图2可知，4 ℃保藏条件下，保藏菌液NaCl终浓度对副溶血性弧菌影响较大。
当NaCl 浓度低于45 g/L，随着NaCl浓度的增加，副溶血性弧菌的存活细胞数也增加；当NaCl浓度超过45 g/L，副溶血性弧菌的存活细胞数呈下降趋势。
当NaCl终浓度为45 g/L时，保藏效果最佳，保藏30、60、90 d副溶血性弧菌的存活细胞数分别达到107、106和105。
因此，选择保藏菌液的NaCl终浓度为45 g/L较为适宜。
2.3 NaCl浓度对副溶血性弧菌生长的影响图2已表明保藏菌液的NaCl终浓度为45 g/L时有利于副溶血性弧菌4 ℃保藏，图3对不同浓度NaCl对副溶血性弧菌生长的影响进行了探讨，结果表明，当APW培养基的NaCl浓度在30～50 g/L范围内，副溶血性弧菌均生长良好。
因此，结合图2和图3的结果，选择45 g/L NaCl-APW作为培养基对副溶性血孤菌进行培养，培养后直接置于4 ℃进行保藏即可。
2.4 副溶血性弧菌4 ℃保藏条件验证从图4可见，采用45 g/L NaCl-APW培养基培养后直接置于4 ℃冰箱进行保藏，保藏90 d，副溶血性弧菌的存活细胞数仅由109下降到106。
采用45 g/L NaCl溶液覆盖斜面的菌苔，于4 ℃保藏90 d，以接种环沾取菌悬液划线接种，结果保藏的菌种在TCBS斜面和45 g/L NaCl-APWA斜面上均生长良好。
验证结果表明，将副溶血性弧菌细胞置于45 g/L NaCl溶液或含45 g/L NaCl的培养基中进行4 ℃保藏，可有效防止低温对细胞的冷伤害，4 ℃保藏可达90 d。
3 小结与讨论甘油对副溶血性弧菌有副作用，不宜作为副溶血性弧菌的冷冻保藏的保护剂。
NaCl对副溶血性弧菌4 ℃保藏有保护作用，其中以45 g/L NaCl保护效果最佳，而且45 g/L NaCl不影响副溶血性弧菌的生长。
将副溶血性弧菌细胞浸于45 g/L NaCl溶液或以含45 g/L NaCl的液体培养基培养后直接于4 ℃保藏，可有效防止低温对细胞的冷伤害，保藏90 d，副溶血性弧菌活菌数仅由初始的109下降至106。
副溶血性弧菌4 ℃保藏具体方法可通过2种方式实现：①先以45 g/L NaCl-APWA斜面培养，再以5 mL 45 g/L无菌NaCl溶液覆盖，然后置于4 ℃保藏；②以45 g/L NaCl-APW液体培养基培养，取出直接4 ℃保藏。
其中以②保藏法更为方便。
4 ℃斜面菌种保藏法具有方法简便、使用方便、条件容易实现等优点，已成为菌种短期保藏常用的方法，然而副溶血性弧菌斜面于4 ℃保藏15～30 d，副溶血性弧菌就因发生菌种死亡或转变为不可培养状态而难以再活化，实际工作中往往造成研究中断或需要反复购买标准菌株，菌种保藏难的这一问题一直困扰着研究和检验人员。
本研究表明，NaCl浓度对副溶血性弧菌影响较大，以含45 g/L NaCl的液体保藏方式，4 ℃可保藏3个月。
该方法简便，可以通过以45 g/L NaCl-APW液体培养基培养后取出置于4 ℃保藏或以45 g/L无菌NaCl溶液覆盖副溶血性弧菌斜面后置于4 ℃保藏2种简便方法实现低温保藏，该法可供研究和检验人员借鉴。