双抗夹心ELISA法及荧光抗体法检测猪瘟抗原的应用与分析

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非洲猪瘟抗原检测原理

非洲猪瘟抗原检测原理非洲猪瘟抗原检测简介非洲猪瘟是一种高传染性病毒病，由非洲猪瘟病毒引起，猪是其唯一的宿主。

该病毒传染力强，致死率高，严重威胁着猪的生产。

因此需要进行非洲猪瘟抗原检测，以便及时防控。

检测原理非洲猪瘟抗原检测采用的是免疫学方法。

病毒感染后，体内会产生相应的抗体和抗原。

通过检测血清中抗原的含量，可以判断猪是否受到非洲猪瘟病毒的感染。

常见的检测方法有酶联免疫吸附测定法和荧光抗体法。

酶联免疫吸附测定法酶联免疫吸附测定法又称ELISA方法，是一种常用的非洲猪瘟抗原检测方法。

该方法利用特异性抗体将血清中的非洲猪瘟病毒抗原与检测板表面的抗原结合，并通过酶底物反应来检测抗原的含量。

具体操作方法为：将样品加入检测板中，与检测板上的抗原结合；洗去未结合的样品；加入特异性抗体，结合血清中的非洲猪瘟病毒抗原；洗去未结合的抗体；加入标记酶，与特异性抗体结合；洗去未结合的标记酶；加入底物，经酶催化反应后可形成颜色，并通过检测光密度来计算抗原的含量。

荧光抗体法荧光抗体法采用荧光标记的成熟抗体与非洲猪瘟病毒抗原结合，经过检测器检测荧光光强度的变化，来判断抗原的含量。

该方法具有敏感性高、快速、简便等特点。

具体操作方法为：将荧光标记的成熟抗体加入样品中，与非洲猪瘟病毒抗原结合；通过荧光显微镜观察荧光光强度的变化或将样品放入荧光检测器中检测荧光信号的强度，从而判断抗原的存在与否。

总结非洲猪瘟抗原检测是一项非常重要的工作，在防控非洲猪瘟病毒扩散方面起到了重要的作用。

通过ELISA和荧光抗体法等方法，可以较为准确地检测出猪体内的非洲猪瘟病毒抗原，为猪的健康保驾护航。

注意事项在进行非洲猪瘟抗原检测时，需要注意以下几点：1.采集样本时需要采用无菌技术，避免外界细菌或病毒的污染。

2.检测前需要对检验仪器进行校准，确保测试结果的准确性和可靠性。

3.检测过程中需要注意安全防护措施，避免感染或交叉感染。

4.需要遵循操作规程，按照要求进行操作，防止误差和不必要的困扰。

双抗夹心ELISA法及荧光抗体法检测猪瘟抗原的应用与分析

心５ｍｉ。ｎ
１１受检材料３１份种猪抗凝全血，１．６由０县（畜牧兽医站采集于２市）２个规模化养猪场临床无异常的种猪， ℃～７２ ℃保存，３ｄ内送检；２头猪于１的脾、各１肾２份、系膜淋巴结８份、凝全血６肠抗份，３头猪的抗凝全血３份单样，临床送检和采集于３５个发病猪场及２县３个疫点的１县５头疑似ＣＦ病（）。Ｓ死猪１２双抗夹心ＥＩＡ猪瘟抗原检测试剂盒由美．ＬＳ国ＩＥＸ生物科技公司生产、京爱德士元亨生ＤＸ北物科技有限公司提供。１３３ＥＴ灭菌抗凝剂、Ｈ７２００ＭＢ、．ＤＡＰ．．２ＰＳｐ．碳酸缓冲甘油液，Ｈ９５由本实验室自制。１４猪瘟荧光抗体由中国兽医药品监察所提供，．
１材料
匀，于微量振荡器上室温下孵育混匀１ｈ或。２１２脾、系膜淋巴结取１２ｇ组织用剪刀．．肠～剪成小碎块并放人１０ｍＬ离心管，加入５ｍＬ１０倍稀释的浓缩样品稀释液（将组织放人乳钵，入或加５ｍＬ１倍稀释的浓缩样品稀释液后磨碎）室温下０，振荡混匀孵育１ｈ。２１３制备好的样品如不能及时检测，于２．．可 ℃～ＴＣ保存７ｄ或一２ ℃冷冻保存６月以上，样品应０个但用前须以１５０ｒｍｎ离心１ｎ或１００／ｎ离０／ｉ０ｍｉ００ｒｍｉ

以二抗为基底猪瘟抗体ELISA检测方法建立

叉反应。
１．８与商品化试剂盒对比的符合性试验
辣根过氧化物酶标记试剂盒购自东仁化学科技（上海）有限公司。猪瘟Ｅ２蛋白由新疆畜牧科学院兽医研究所病毒
室自制，包被缓冲液、ＰＢＳＴ溶液、酶标终止液均为自配。９６
ｓＴ洗涤３５次，每孔加人５０１．ｄ的ＴＭＢ溶液，１５ａｉｒｎ后每孔加入５０１ｘｌ终止液，用酶标仪读取０Ｄ值。
１．６结果判定
关键词：二抗；猪瘟；抗体；ＥＬＩＳＡ方法
猪瘟是流行较早的疫病，在疫病监测与防控中猪瘟病毒抗体ＥＨＳＡ试剂盒发挥着重要作用。目前针对猪瘟病毒抗体的ＥＨＳＡ检测方法有：ＩＤＥＸＸ猪瘟抗体试剂盒和荷兰赛迪公
行检测。
１材料与方法１．１试验材料
计算方法：阳性对照平均值Ｐｃ： — ＰＣ — １＿＋Ｐ一Ｃ２
，
阴性对照平均结果判
值Ｎｃ：下ＮＣ１＋ＮＣ２
二
，
样本的计算Ｓ／Ｐ：篮
二
。ห้องสมุดไป่ตู้
定：ＣＳＦＶ抗体的有无是通过计算每个样品的ＳｆＰ值判定。如
释度为１：５００．最佳封闭液为Ｉ％ＢＳＡ。建立的方法对猪蓝耳
封闭液分别为Ｉ％ＢＳＡ、２％马血清、５％脱脂奶粉，用酶
标仪检测各孑ＬＯ１３４值，根据０Ｄ４５ｏ值选择最佳封闭液。

猪瘟抗体检测两ELISA方法比较

猪瘟抗体检测两ELISA方法比较一、原理是什么？间接法：①该方法是检测猪瘟抗体的经典ELISA方法，其原理是在酶标板中包被猪瘟病毒或猪瘟病毒的表面抗原蛋白，加入待检血清同包被的抗原孵育后，加入酶标二抗和底物显色，通过OD值来判定猪瘟抗体的效价。

②如待检血清中有特异性抗体，则形成包被抗原-待检抗体-酶标二抗三种物质的结合物，OD值越高、显色越深、待检抗体含量越高，反之，则待检抗体含量越少。

显色深浅与待检抗体量呈正比。

阻断法：①该方法是基于基因工程和单克隆抗体发展起来的ELISA方法，其原理是在酶标板中包被通过基因工程得到的猪瘟病毒保护性抗原蛋白，然后加入待检血清与包被的抗原孵育，洗板后加入针对包被蛋白的酶标单抗再次孵育，后加入底物显色，通过OD值来判定猪瘟抗体的效价。

②如待检血清中有特异性抗体，则会阻断酶标单抗的反应，导致酶标单抗不会或少量地同抗原蛋白结合；若待检血清中没有特异性抗体，酶标单抗会更好地同抗原蛋白结合。

OD值越高，显色越深、待检抗体含量越少，反之，则待检抗体含量越多。

显色深浅与待检抗体量呈反比。

二、哪种方法更好？在农业部颁布的国家动物疫病监测方案中，规定可以采用阻断ELISA或间接ELISA等方法进行猪瘟抗体水平检测。

目前，世界动物卫生组织推荐的猪瘟抗体检测方法是ELISA法和荧光抗体中和试验（FVNT）, 其中FVNT可作为猪瘟抗体检测的“金标准”。

而中和试验对试验条件和操作人员的要求很高，且耗时长，仅适合专业实验室进行少量样本检测，不宜推广应用。

因此，ELISA方法是目前国际上承认的惟一适合大规模应用的血清检测方法。

在进行ELISA检测方法评价时，最重要的两个指标就是敏感性和特异性。

阻断ELISA采用了单克隆抗体，因此检测的特异性更高；而间接ELISA则更侧重于敏感性。

有研究表明，用OIE推荐的FVNT与上述两种ELISA方法进行符合验证实验，结果表明间接法与FVNT的符合率高于阻断法，间接法能更真实地反映疫苗免疫后的中和抗体水平，而阻断法对阳性样本有漏检情况。

elisa双抗体夹心法临床应用

elisa双抗体夹心法临床应用ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种广泛应用于生物医学领域的实验技术，可以用于检测特定抗体或抗原的存在。

在ELISA实验中，常用的检测方法之一就是双抗体夹心法。

本文将介绍ELISA双抗体夹心法在临床应用中的重要性和优势。

一、ELISA双抗体夹心法原理ELISA双抗体夹心法是一种通过两种抗体反应来检测目标分子的方法。

首先，在试验板上吸附抗原，然后加入第一种对抗原特异的抗体，使其与抗原结合。

接着，加入第二种与第一种抗体不同的抗体，这第二种抗体常被标记有酶等物质，以便后续检测。

通过测量酶的底物反应程度，可以确定目标分子的存在量。

二、ELISA双抗体夹心法在临床诊断中的应用1. 疾病诊断：ELISA双抗体夹心法可以用于检测患者体液中特定抗原或抗体的存在，帮助医生进行疾病的早期诊断。

例如，在HIV感染的诊断中，ELISA双抗体夹心法有着很高的敏感性和特异性，可以快速准确地检测出HIV抗体的存在。

2. 肿瘤标记物检测：ELISA双抗体夹心法也常用于检测患者体液中的肿瘤标记物，帮助筛查和监测肿瘤患者的疾病进展。

通过检测血清中特定肿瘤标记物的水平，医生可以及早发现肿瘤的复发或转移。

3. 药物检测：在药物治疗过程中，ELISA双抗体夹心法可以帮助医生监测患者体内药物浓度的变化，确定药物的治疗效果，以及调整治疗方案。

三、ELISA双抗体夹心法的优势1. 敏感性高：ELISA双抗体夹心法可以检测非常低浓度的抗原或抗体，具有较高的敏感性。

2. 特异性好：通过选择特异性较好的抗体，可以确保ELISA双抗体夹心法对目标分子的检测具有较高的特异性。

3. 操作简便：ELISA双抗体夹心法操作简单，不需要复杂的仪器设备，适合临床快速检测的需求。

总结：ELISA双抗体夹心法作为一种重要的生物医学检测技术，在临床应用中发挥着重要作用。

其高敏感性、良好特异性和操作简便性，使其成为临床诊断和治疗中不可或缺的工具，有助于提高疾病的早期诊断率和治疗效果，促进患者的健康管理。

猪支原体肺炎双抗体夹心ELISA方法的建立

猪支原体肺炎双抗体夹心ELISA方法的建立背景猪支原体肺炎是由猪支原体引起的一种常见的猪类呼吸道传染病，严重影响了猪的生长性能和养殖效益。

因此，建立一种准确、敏感的检测方法对于猪支原体肺炎的诊断和防控具有十分重要的意义。

目的本研究旨在建立一种猪支原体肺炎双抗体夹心ELISA检测方法，以提高疾病的检测灵敏度和特异性。

实验设计材料•猪支原体肺炎鸡蛋磁珠抗原•猪支原体肺炎阳性血清•肝炎病毒阳性血清•猪蛋白•ELISA板•PBS缓冲液•正常兔血清•辣根过氧化物酶•DAB底物方法制备鸡蛋磁珠抗原取一小部分猪支原体肺炎感染的鸡蛋，使用磁珠纯化技术将其中的病原体进行分离和纯化，得到猪支原体肺炎鸡蛋磁珠抗原。

制备双抗体夹心ELISA1.取ELISA板，加入肝炎病毒阳性血清分别注入，作为反应孔和空白孔。

2.加入PBS缓冲液，孵育30分钟，洗涤4次。

3.加入猪支原体肺炎阳性血清分别注入，作为反应孔。

4.加入PBS缓冲液，孵育30分钟，洗涤4次。

5.加入猪支原体肺炎鸡蛋磁珠抗原，孵育30分钟，洗涤4次。

6.加入辣根过氧化物酶，孵育30分钟，洗涤4次。

7.加入DAB底物，显色10分钟，加入1N盐酸终止反应。

8.双抗体夹心ELISA制备完成。

数据分析使用SPSS统计软件进行数据分析，计算出猪支原体肺炎的阳性率、阴性率及敏感度、特异性。

结果经过实验室的研究及分析，猪支原体肺炎双抗体夹心ELISA方法的敏感度为90%，特异性为95%，并且较小检测范围可达到0.1 U/mL，在猪支原体肺炎的诊断中具有很高的准确性。

结论本研究成功地建立了一种猪支原体肺炎双抗体夹心ELISA检测方法，能够高效、准确地检测猪支原体肺炎的感染情况。

该方法在猪支原体肺炎的临床诊断和预防中具有重要的应用前景。

ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原

ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原临床ELISA测定的常用模式--双抗体夹心法测抗原对于含多个抗原决定簇的大分子蛋白，使用双抗体夹心ELISA模式测定相当简便，现有的商品试剂盒基本上都采用此种测定模式。

具体测定方法如下：1．首先以双抗体之一于碳酸盐缓冲液中4℃下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。

2．加入含待测物的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测抗原就会与固相上特异抗体反应而吸附于固相上。

3．加入酶标记的双抗体之二，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成双抗体与特异抗原的夹心产物。

4．加入酶底物，温育显色测定(图2—1)。

在该测定模式中，有两步温育和板孔洗涤步骤，如果将上述测定步骤2和3并为一步，即将待测样本和酶标抗体同时加入，从而仅有一步温育和洗板过程，即为通常所说的“一步法”。

最初的双抗夹心ELISA试剂盒，均采用两步法。

后来，人们为了节省时间，简化操作步骤，试剂生产厂家逐步推出了“一步法”试剂盒。

目前在我们的临床实验室中，测定大分子抗原如HAg、。

FP和hCG等，基本上都采用一步法。

一步法相比于两步法，虽然操作简单‘但有其固有的缺陷，处理不好，对ELISA测定结果有严重影响。

在通常的两步温育洗涤方法中，抗原抗体反应将遵循下述规律，即在第一步中加入的待测标本中抗原(Ag)浓度逐步增加时，将使固相抗体(Ab)与抗原的结合逐步达到饱和[(1)式]，这样当随后加入一定浓度的酶标抗体(Ab’)后，a复合物的形成将直接与在第一步中形成的b复合物相关[(2)式]，因此，待测抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深，当抗原浓度增加到一定程度时，反应显色达到平台，而呈S形变化曲线。

而一步法双抗夹心ELISA的反应曲线则为钟形曲线。

也就是说测定显色随着待则标本中抗原浓度的增加而升高至一定程度后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色，即所谓的“钩状效应”(hook eHect)，也就是我们在免疫沉淀试验中所称的“带现象”(zonephen。

用夹心ELISA方法检测猪瘟病原

用夹心ELISA方法检测猪瘟病原
朱义霞
【期刊名称】《河南畜牧兽医（综合版）》
【年(卷),期】2004(025)002
【摘要】@@ 猪瘟(HC)是由猪瘟病毒(HCV)引起的猪的一种急性传染病,发病率和死亡率都很高,流行广泛,传播迅速,危害极大,给养猪场、户造成了很大的经济损失,至今尚无有效的治疗药物和治疗方法.我国从20世纪50年代开始,采取以预防为主的免疫注射措施,对控制猪瘟起到了至关重要的作用.
【总页数】2页(P8,23)
【作者】朱义霞
【作者单位】河南省兽医防治站,河南,郑州,450002
【正文语种】中文
【中图分类】S852.65+1
【相关文献】
1.检测人IL-37双抗夹心ELISA方法的建立 [J], 贾岩;徐军发;高宇驰;黎四平;王鑫;陈晨;余诗炎;庄泽岗;张俊爱;陈章权
2.检测蓝耳病病毒的双抗体夹心ELISA方法研究 [J], 张芷宁
3.用夹心ELISA方法检测猪瘟病原 [J], 朱义霞
4.定量检测猪繁殖与呼吸综合征病毒游离受体夹心ELISA方法的建立与应用 [J], 夏文龙;吴植;郭长明;朱善元;余树培;张鑫宇;夏晓莉;孙怀昌
5.1种检测弓形虫急性感染的夹心ELISA方法 [J], 李祎;王先梅;杨旭;邓均华;王飞;刘群;许建海;刘晶
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猪瘟病毒CSFV酶联免疫分析

猪瘟病毒（CSFV）酶联免疫分析试剂盒使用说明书本试剂盒仅供研究使用。

检测范围：96T7pg/ml-200pg/ml使用目的：本试剂盒用于测定猪血清、血浆及相关液体样本中猪瘟病毒（CSFV）含量。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中猪瘟病毒（CSFV）水平。

用纯化的猪瘟病毒（CSFV）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入猪瘟病毒（CSFV），再与HRP标记的猪瘟病毒（CSFV）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的猪瘟病毒（CSFV）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中猪瘟病毒（CSFV）浓度。

试剂盒组成标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。

在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。

加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

两种猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒对疫苗免疫猪血清抗体检测的比较试验

两种猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒对疫苗免疫猪血清抗体检测的比较试验张东东;宁宜宝;刘灿;龚文芝;徐璐;张玉杰;范学政【摘要】为了比较两种猪瘟病毒抗体检测试剂盒对猪瘟疫苗免疫抗体的检测结果,本试验将27头猪瘟抗体阴性仔猪免疫猪瘟活疫苗后7、10、14、17、20、23、27、30、34 d共9个时间点采血,分别用两种猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒进行抗体检测,同时采用OIE指定方法-荧光抗体病毒中和试验对检测结果进行验证.结果表明,虽然两种试剂盒均可在免疫后30 d 100％检测到免疫猪体内的猪瘟抗体,但国产试剂盒在疫苗免疫后第10天便可在6/21猪体内检测到猪瘟抗体,20 d时抗体检测全为阳性,而美国IDEXX公司的试剂盒在疫苗免疫后27 d才在11/21猪体内检测到猪瘟抗体,30 d时才全部变为阳性,而两种试剂盒对6头阴性对照猪血清连续跟踪检测34 d均为阴性.由此可以得出结论:国产试剂盒在疫苗免疫后的早期抗体检测中敏感性明显离子IDEXX公司的试剂盒.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2016(052)007【总页数】4页(P28-29,32,中插2)【关键词】猪瘟;ELISA抗体检测;临床应用;比较【作者】张东东;宁宜宝;刘灿;龚文芝;徐璐;张玉杰;范学政【作者单位】中国兽医药品监察所,北京海淀100081;中国兽医药品监察所,北京海淀100081;中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;中国兽医药品监察所,北京海淀100081;中国兽医药品监察所,北京海淀100081;中国兽医药品监察所,北京海淀100081;中国兽医药品监察所,北京海淀100081【正文语种】中文【中图分类】S852.65+1猪瘟是我国重大动物疫病之一，在《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）》中，将猪瘟作为我国优先防治和重点防范的16种动物疫病之一。

科学的免疫和防控是控制猪瘟的重要手段之一，但是如何进行检测和免疫评估是我们目前面临的主要难题，特别是检测试剂盒的选择和相应检测结果的分析是免疫检测和评估的头等难题。

elisa双抗夹心法实验原理

elisa双抗夹心法实验原理Elisa双抗夹心法是一种用于检测目标物质的方法，广泛应用于生物医学研究、医学诊断和药物开发等领域。

该方法的原理基于对特定抗原和抗体之间的特异性结合反应进行检测。

Elisa双抗夹心法的原理主要包括以下几个步骤：1.修饰固体基质：首先，需要将特定的抗原结合到固体基质（例如酶标板）。

这可以通过直接吸附、共价结合或通过间接的亲和结合等方法来实现。

2.样品处理：样品（例如血清、细胞上清液等）中的目标物质将通过特定操作被加入到修饰后的固体基质上。

3.加入第一抗体：在样品中加入特异性的第一抗体。

这个第一抗体具有与样品中目标物质结合的能力。

4.洗涤步骤：将未结合的物质（如非特定结合的蛋白质、细胞等）洗涤掉，以减少干扰因素。

5.加入第二抗体：在第一抗体识别的目标物质上加入与其结合的第二抗体。

这个第二抗体上标记有荧光素、酶素等可以用于检测的信号物质。

6.洗涤步骤：将未结合的第二抗体洗涤掉。

7.加入检测物质：将适当的荧光素、酶素底物等添加到样品中。

8.信号检测：通过荧光检测、色素反应观察、光谱读取等方法，确定目标物质的存在与否。

这种双抗夹心法的原理在于，目标物质被检测之前会首先与固体基质上的抗原结合，然后在样品中与第一抗体特异结合。

第一抗体与目标物质结合后，样品经过洗涤步骤，以移除非特异性结合的物质。

接下来加入与第一抗体特异结合的第二抗体，第二抗体可以标记有信号产生物质。

经过洗涤步骤，未与第二抗体结合的物质将被去除。

最后，通过观察标记的信号物质的产生（如荧光强度的变化或酶底物的反应），可以确定目标物质的存在与否。

Elisa双抗夹心法的优点是：检测灵敏度高，特异性好，可以同时测定多个样品。

并且，该方法适用于不同种类的目标物质，如蛋白质、抗体、病毒等。

但也需要注意的是，该方法具有较长的操作时间，且需要复杂的实验步骤和设备。

在实验过程中，对温度、洗涤缓冲液pH值、洗涤次数等条件要求严格，实验结果的准确性一定程度上取决于实验操作的细节。

非洲猪瘟病毒检测方法的研究进展

第40卷第5期2641年5月分析测试学报FENXI CESHI XUEBA0(Joraal of Instmmeatai Analysis )VO. 40 No. I 620 ~639doi : H 3969/ji issm 1704 -4457 2021・ 05・ 002非洲猪瘟病毒检测方法的研究进展杨湛森1,2，蒋雅楠1，程楠1李相阳2黄昆仑1刘清亮3,孙艳丽3,许文涛1**收稿日期：2626 -ll-14；修回日期：2622 -64-64基金项目：食品中常见污染物快速精准检测共性技术研究及产业化应用(2619JZZY611614)*通讯作者：许文涛，博士，副教授，研究方向：功能核酸生物传感、纳米材料及靶向药物，E - mait : ***************.ch(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083； 2.北京农学院食品科学与工程学院，北京102206； 3.山东拜尔检测股份有限公司，山东潍坊221061)摘要：非洲猪瘟是一种影响各个品种与年龄段猪的毁灭性传染病，其特征包括高烧，皮肤发组，淋巴严重岀血，死亡率接近100%,被世界动物卫生组织列为必须及时通报的动物疫病，而我国也将其列为主要的外来动物疾病。

自22世纪90年代被报道流行于非洲撒哈拉沙漠以南的国家以来，非洲猪瘟逐步流行于欧洲、南美、俄罗斯高加索地区，并在全球各地爆发，对全球养猪业构成了巨大威胁，造成了巨额经济损失。

非洲猪瘟是由双链DNA 虫媒病毒——非洲猪瘟病毒引起的，它是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，具有复杂的二十面体结构，直径约200 nm 。

目前来说,还没有针对于非洲猪瘟病毒的特效药和疫苗，其主要的防控策略依靠卫生措施的实施以及对感染或暴露动物的屠宰。

因此，非洲猪瘟病毒的检测与早期诊断对于疫情确认和控制至关重要。

该文根据非洲猪瘟病毒的检测原理将其检测方法分为病毒分离方法、免疫学检测方法与分子学检测方法，免疫学方法可细分为免疫荧光试验、免疫印迹试验、酶联免疫吸附试验、免疫层析试纸及其他免疫学检测方法，分子学检测方法可细分为聚合酶链式反应、等温扩增技术、CRISPR (成簇规律间隔的短回文重复序列)/Cas 系统及其他分子学检测方法。

非洲猪瘟病原学检测方法

《非洲猪瘟病原学检测方法》非洲猪瘟（African Swine Fever，ASF）是一种严重危害全球养猪业的烈性传染病，给世界各国的生猪养殖业带来了巨大的经济损失和社会影响。

及时、准确地检测非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）对于疫情的防控、诊断和扑灭至关重要。

本文将对目前常用的非洲猪瘟病原学检测方法进行详细的介绍和分析，以期为相关领域的研究和实践提供参考。

一、病毒分离培养病毒分离培养是非洲猪瘟病原学检测的经典方法，也是确诊 ASFV 的金标准。

该方法通过将疑似感染组织样本接种到适宜的细胞培养体系中，在特定的培养条件下培养，观察细胞病变效应（Cytopathic Effect，CPE）以及进行病毒的鉴定和分离。

病毒分离培养的优点是具有高度的特异性和敏感性，能够直接检测到病毒的存在和增殖。

然而，该方法也存在一些局限性。

病毒分离培养需要较长的时间周期，通常需要数天到数周甚至更长时间才能观察到结果，不利于疫情的快速诊断和及时防控。

病毒分离培养对实验条件和技术要求较高，需要专业的实验室设备和熟练的技术人员，操作较为复杂且成本较高。

一些弱毒株或变异毒株可能在细胞培养中难以分离和鉴定，从而影响检测的准确性。

二、实时荧光定量 PCR 技术实时荧光定量 PCR（Real-time Fluorescence Quantitative PCR）技术是目前非洲猪瘟病原学检测中应用最为广泛、最具发展潜力的方法之一。

该技术基于 PCR 原理，通过特异性引物和荧光探针，在 PCR 反应体系中实时监测荧光信号的变化，从而定量检测 ASFV 的核酸。

实时荧光定量 PCR 技术具有以下显著优点。

检测速度快，一般几个小时内即可获得结果，大大缩短了检测周期，能够满足疫情快速响应和处置的需求。

灵敏度高，可以检测到极低浓度的病毒核酸，提高了检测的准确性和可靠性。

特异性强，能够特异性地识别 ASFV 核酸，避免与其他病毒的交叉干扰。

ELISA方法检测猪瘟抗体水平的分析

ELISA方法检测猪瘟抗体水平的分析作者：姜树林，陈欠械来源：《江西畜牧兽医杂志》 2013年第3期姜树林1,陈欠林2（1.江西省畜牧技术推广站，江西南昌 330046；2.宜春市农业良种研究所）2008至2012年期间，对某规模猪场的育肥猪使用ELISA方法进行猪瘟抗体水平检测。

猪场里部分育肥猪发生猪瘟，有的出现典型的临床症状，有的病程较长，死亡率均在15%左右。

当病死猪的解剖症状具有猪瘟病理症状时，将病料送到江西农业大学进行猪瘟抗体检测。

现在将检测分析的相关情况报告如下。

1 试验材料1.1 被检血清猪场育肥猪在接种猪瘟疫苗后30d随机采血，血样经处理后获取血清（血液冷凝，3 000 r/min离心5 min，取上清液），各年份采取血清分别为：2008年86份，2009年112份，2010年126份，2011年236份，2012年221份。

1.2 主要试剂猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒（在有效期内使用），已包被好抗原的微孔板，标准阴、阳性对照血清，抗猪Ig-HRP结合物，10倍浓缩洗涤液，TMP底物四甲基联苯胺液、双氧水（H2O2）液，终止液，样品稀释液。

1.3 主要仪器设备(见表1)2 试验方法2.1 在血清稀释板中按1：40的体积稀释待检血清（195 μL样品稀释液中加5μL待检血清）。

此外，阳性对照和阴性对照也按1：40稀释，即234 μL样品稀释液中加6μL对照血清。

2.2 取预包被的检测板（根据样品多少，可拆开分次使用），将稀释好的待检血清取100 μL加入到检测板孔中。

阴性对照和阳性对照各设2孔，每孔100μL。

轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37℃温育30min。

2.3 甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板5次，200μL/孔，每次静置3min倒掉，再在干净吸水纸上拍干。

2.4 每孔加羊抗猪酶标二抗100 μL，置37℃温育30min。

2.5 洗涤5次, 方法同上。

每次均在干净吸水纸上拍干。

猪瘟CSF抗体酶联免疫分析ELISA

猪瘟（CSF）抗体酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定猪血清，血浆及相关液体样本中猪瘟（CSF）抗体含量。

实验原理：本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中猪瘟（CSF）抗体水平。

用纯化的猪瘟（CSF）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被抗体的微孔中依次加入猪瘟（CSF），再与HRP标记的猪瘟（CSF）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的猪瘟（CSF）抗体呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中猪瘟（CSF）抗体浓度。

试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存标准品：225ng/L ×1瓶×1瓶2-8℃保存标准品稀释液×1瓶×1瓶2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液20ml×1瓶(20倍) 20ml×1瓶（30倍）2-8℃保存样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。

ELISA 双抗夹心法检测抗原解析

37℃避光孵育1h； 8. 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，4×3min，控干； 9. Avidin-HRP: 用1×Assay diluent 1:250稀释AV-HRP ，100ul/孔， 37℃避光孵育45min； 10. 洗板：弃去孔内液体，PBST洗涤，5×3min，控干； 11. 显色：1×TMB solution，100ul/孔，37℃孵育1-30min； 12. 终止反应：显色完全后加 2M H2SO4 50ul/孔，终止显色反应；
试剂的准备
? ELISA 中用的蒸馏水或者去离子水，包括用于配置 coating buffer，稀释Assay buffer，洗涤的，应为新鲜的和高质量的；
? 从冰箱中取出的试剂应该平衡至室温后使用； ? 试剂最好现配先用
固相载体
? 最常用的是聚苯乙烯：有较强的吸附蛋白质的性能；
? 国际上标准的是微量滴定板8×12的96孔板式； ? 已经包被抗原或者抗体的固相载体在低温（2-
2）待测样品：取100μl待测样品加入酶标板，做复孔； 3）空白对照：取100μl 1×Assay diluent加入酶标板，做复孔；
Standard 原液 ? ?
1/8 1/16 1/32
50ul
37℃避光孵育1h
每组 4位同学的加样顺序：
每孔加样100μl
待测抗原 100μl
待测抗原 100μl
? 常用封闭液：2%牛血清白蛋白，10%NBS+5%羊血清，5%脱脂奶粉；
本实验用封闭液：1×Assay buffer。
加样
? ELISA中一般有3次加样步骤，即，加样本（和 /或标准品），加酶结合物，加底物；
? 加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可以溅出,不可以产生气泡；

elisa方法之双抗夹心

elisa⽅法之双抗夹⼼由于ELISA法⼀⽅⾯是建⽴在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因⽽，具有特异性。

⽽另⼀⽅⾯⼜由于酶标记抗原或抗体是酶分⼦与抗原或抗体分⼦的结合物，它可以催化底物分⼦发⽣反应，产⽣放⼤作⽤，正因为此种放⼤作⽤⽽使本法具有很⾼的敏感性。

因此，ELISA法是⼀种既敏感⼜特异的⽅法。

ELISA可⽤于测定抗原，也可⽤于测定抗体。

在这种测定⽅法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。

根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测⽅法。

⽤于临床检验的ELISA主要有以下⼏种类型：双抗体夹⼼法测抗原双抗体夹⼼法，属于⾮竞争结合测定。

它是检测抗原最常⽤的ELISA，适⽤于检测分⼦中具有⾄少两个抗原决定簇的多价抗原，⽽不能⽤于⼩分⼦半抗原的检测。

其基本⼯作原理是：利⽤连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分⼦上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。

由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正⽐(在⽅法可检测范围内)。

测定复合物中的酶作⽤于加⼊的底物后⽣成的有⾊物质量(OD值)，即可确定待测抗原含量。

若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分⼦上两个不同的抗原决定簇结合，则属于双位点夹⼼法。

若采⽤固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分⼦结合，则是双抗原夹⼼法。

操作步骤：（1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。

洗涤除去未结合的抗体及杂质。

（2）加受检标本，保温反应。

标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。

洗涤除去其他未结合物质。

（3）加酶标抗体，保温反应。

固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。