western blot
医学Western blot(细胞蛋白)
Western blot （细胞蛋白）1.取细胞：若细胞为贴壁细胞，先将细胞用胰酶消化下来（至L5ml EP管）；若为悬浮细胞，可直接抽取一部分细胞至EP管，离心（我们实验室小离心机4500rpm, 5min,具体可调节），去上清。
2.洗：加ImlPBS充分混匀，离心（同上，具体可调节），去上清。
3.裂解：加 80T20ul 裂解液（RIPA:PMSF： COCK TAIL=100:1:1）,充分混匀，冰上裂解30mino4.离：12000rmp,4℃, 10min o将上清转移至另一 L5ml EP 管。
5.定量（BCA法）6.加蛋白上样缓冲液（5X）,即步骤三所加裂解液的量4二所加蛋白上样缓冲液的量。
充分混匀。
7.沸水煮lOmin,取出冷却4℃,可放-20℃保存。
8.配胶：先配下层胶，按需求选择板子（1.0或1.5）,配完立即加无水乙醇等待30min凝（天冷时间可延长）。
上层胶，配完立即插梳子等20-30min （天冷时间可延长）。
9.加样第一孔加marker （3. 5-4ul）第二孔以后加样品，最后一个可再加marker（1.5-2. OuD&B：在电泳液中加样；电压80V. 30min,等到在压缩胶的作用下，处于同一水平线或看到marker红蓝分离，可调电压至120v （40-50min）0电泳液是IX SDSo10.切胶根据因子分子量（可扩大切胶范围，以防出现误差）11.转膜海绵用遇冷的转膜液浸湿，PDF膜用甲醇激活lmin.放置顺序海绵-膜-胶-海绵-电极板,注：赶气泡,然后通电12.封闭5%脱脂奶粉（比如称0. 5g奶粉，取10ml IX TBST） 2h.然后IX TBST洗13.孵育一抗，摇30min-lh后放4℃冰箱过夜。
14.回收一抗，IX TBST洗膜，洗3次，lOmin/次，转速130左右15.孵育二抗2h 2ml左右（转速70）16.回收二抗TBST洗膜，洗3次，10min/次17.显影（1:1）,每个膜2001d左右。
western blot 详解
原理：BCA(bicinchonininc acid二辛可宁酸)与二价铜 离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成 为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋 白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合 二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复 合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
Cathode + 带有负电荷的蛋白质从上 到下运动（负极到正极）， 分开
四 转膜
准备物品：转移槽 黑红夹子 NC膜 滤纸 海绵垫 转
膜缓冲液 （1） 转一张膜需准备6张滤纸和1张NC膜。 切滤纸 和膜时一定要戴手套。将切好的NC膜和滤纸置于1X 转模缓冲液浸湿。 • 10X转膜缓冲液 甘氨酸（MW75.07） 151.1g Tris（MW121.14） 30.3g 蒸馏水至 1000ml 溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至 20%
（2）夹子黑的一面：海绵-3张滤纸-胶-NC膜-3张滤纸海绵 ①将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵 垫。在垫子上垫三层滤纸，固定滤纸,擀去其中的气泡。 ②刮去玻璃板上的浓缩胶，小心剥下下层胶，用手调整 使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将NC膜盖于 胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除 去气泡。膜盖下后不可再移动。最后盖上另一个海绵垫， 擀几下就可合起夹子。
配胶方法同上，各种溶液加入到烧杯中，后 震荡。
灌浓缩胶：用1ml的移液枪将玻璃板中的剩余 空间灌满浓缩胶，灌胶时也要使胶沿玻璃板 流下以免胶中有气泡产生。将剩余空间灌满 浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。 灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气 泡产生。插梳子时要使梳子保持水平。
冰箱过夜 待浓缩胶凝固后，取保险膜铺平于桌上，另取两张草 纸铺于保鲜膜上。用ddH2O浸湿草纸。取玻璃板放 于草纸上，包好。放入4℃冰箱过夜。
western blot原理
western blot原理
Western Blot是一种常用的分子生物学实验技术，旨在检测和
分离特定蛋白质的方法。
该技术基于蛋白质的分子量差异和亲和性分离效应。
首先，蛋白质样品需要经过电泳分离，通常是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离。
SDS-PAGE中，样品中的
蛋白质会被不带电的SDS包膜所覆盖，使得蛋白质带有负电荷。
之后，这些带有负电荷的蛋白质会被电场引力依据其分子量大小而迁移，从而在聚丙烯酰胺凝胶上分离得到。
然后，将经过分离的蛋白质转移到一个膜上，通常是聚乙烯二醇或聚维尼尔丙烯酰胺膜。
这个过程被称为电转移。
转移到膜上的蛋白质保持了相同的排列方式，以便进行后续的检测。
接下来，膜被孔隙充满的非特异性蛋白质、胶原蛋白等阻塞物浸泡，以防止非特异性的蛋白质与特定抗体非特异地结合。
在这之后，将特定的一抗（一种针对感兴趣蛋白质的抗体）加入膜上与特定的蛋白质结合形成复合物。
经过洗涤，使非特异性抗体被彻底洗除。
为了检测复合物，通常需要给予一抗一个标记。
通常使用放射性同位素（如^125I），酶（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光标记剂。
标记剂的选择取决于进一步检测的方法。
最后，利用放射活性计数器、酶连显色法或荧光显微镜等设备
对膜进行成像，可量化检测特定的蛋白质。
总之，Western Blot技术利用蛋白质的分子量差异和亲和性分离效应，将蛋白质分离、转移到膜上、与特定抗体结合，并通过标记剂检测来获得特定蛋白质的信息。
这是一种广泛应用于生物学研究中的分析工具。
westen blot原理
westen blot原理Western blot（又称为蛋白质印迹）是一种重要的蛋白质检测方法，它可以用于检测蛋白质的相对分子质量、数量和抗原特异性。
Western blot是通过将蛋白质样品经SDS-PAGE电泳分离后，将其迁移至膜上，然后使用特异性抗体对目标蛋白进行检测的技术。
Western blot 能够检测样品中可能存在于微量的蛋白质，并且能够区分具有不同结构或特征的不同蛋白质。
Western blot 的原理是：将蛋白质样品经SDS-PAGE电泳分离后，将其转移到聚丙烯酰胺或聚乙烯膜上，然后使用荧光素或辐射的能量使膜上的蛋白质变得容易检测。
Western blot 检测使用的抗体通常是标记有辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素的二抗或其他特异性抗体。
其中辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶可以清晰地显示特异信号，并且可以通过开发和显色识别来显示相对定量。
Western blot 主要用于检测特定蛋白质，如抗体和结构蛋白，但是与其他定量蛋白质方法相比，Western blot 需要相应的蛋白质特异性抗体。
尽管Western blot已成为一种常见的蛋白质分析方法，但是它的应用也因其灵敏性、帮助诊断某些疾病和进行药学研究而备受欢迎。
Western blot 的优点包括：1. 可检测特定蛋白质，能够区分不同的蛋白质。
2. 可在单个实验中同时检测多个蛋白质。
3. 可定量检测蛋白质。
4. 可在不同样品中比较蛋白质表达水平。
Western blot 检测的主要步骤包括制备蛋白质样品、SDS-PAGE电泳、转膜和检测。
下面我们就将分别介绍这些步骤。
1. 制备蛋白质样品Western blot 检测的首要步骤是样品的制备。
样品的制备是决定Western blot检测结果是否准确的关键。
在制备样品时，鼓励使用相同的样品制备方法和提取技术，包括细胞溶解、组织破碎和蛋白质提取等技术。
样品的制备要求能够尽可能避免蛋白质的失活和降解。
western blot一抗二抗原理
western blot一抗二抗原理Western blot，也叫蛋白印迹，是目前常用的一种蛋白质分析方法。
它的原理是利用抗体特异性识别目标蛋白质，从而检测出目标蛋白质的存在与否、大小以及数量等信息。
Western blot分为以下几个步骤。
1. 蛋白质电泳分离Western blot的第一步是将待检测蛋白质进行电泳分离。
蛋白质在电场中根据其分子量（大小）不同而被分离为不同的带状条带，这些条带被称为蛋白质谱图。
2. 转印分离完毕后，我们需要将带状条带转移到聚丙烯酰胺酰膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）上，以便后续的蛋白质定位和检测。
转印过程使用电泳原理，在之前的电泳装置上将PVDF或NC膜和分离完毕的蛋白质谱图叠在一起，经过一定的电流和时间，蛋白质被转移到膜上。
3. 阻断非特异性结合在转移完毕后，需要将膜进行阻断，避免非特异性结合发生。
一般采用的方法是在膜上浸泡含有蛋白质的阻断液（如牛血清白蛋白BSA 或马血清白蛋白MSA）中，这样就能够避免非特异性抗体反应。
4. 第一次抗体孵育接下来就是第一次抗体孵育。
在这一步，我们需要使用目标蛋白质的特异性抗体，将其与膜上的蛋白质结合。
第一次抗体要与目标蛋白质结合，从而使后续反应中的第二次抗体只能结合到第一次抗体上，不会与膜上其他蛋白质结合。
通常在孵育完毕后，需要进行多次的洗涤步骤，去除未结合的第一次抗体。
5. 第二次抗体孵育第二次抗体孵育是Western blot中的关键步骤之一。
这里的第二次抗体是针对第一次抗体的特异性抗体。
第二次抗体的发光物质（如酶或化合物）通常与第二次抗体结合，使其结合的部位出现发光，从而证明目标蛋白质的存在与否。
总之，Western blot的原理是通过特异性抗体的结合实现蛋白质定位和检测。
这种分析方法广泛用于分子生物学研究中，尤其是蛋白质鉴定和分析方面。
它是一种可靠、有效的检测方法，同时也具有一定的局限性，需要根据实际情况进行优化和改进。
最详细的Western_Blot过程步骤详解
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤与问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:一、原理二、分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLECFiv.底物DAB呈色三、主要试剂四、主要步骤五、实验常见的问题指南1.参考书推荐2.针对样品的常见问题3.抗体4.滤纸、胶和膜的问题5.Marker的相关疑问6.染色的选择7.参照的疑问8.缓冲液配方的常见问题9.条件的摸索10.方法的介绍11.结果分析一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型与其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
蛋白提取及Western blot 原理及步骤
蛋白质提取原理：使用机械法破坏细胞膜，将细胞内的蛋白质释放到溶液中，然后通过离心或过滤的方法去除细胞碎片、细胞核和细胞碎片等杂质，以得到较为纯净的蛋白质上清液→通过加入盐或有机溶剂等物质，使蛋白质发生沉淀，然后通过离心将沉淀的蛋白质分离出来→通过柱层析、电泳、凝胶过滤等方法进一步纯化蛋白质，去除其他蛋白质、核酸、小分子物质等杂质，使目标蛋白质得到更高纯度。
方法：组织液氮冷冻，研磨成粉末状→加入适量蛋白提取液，冰上放置20 min→4℃，12000 rpm离心10 min→吸上清，在通风橱加入5×Loading Buffer，99 ℃加热10 min，冰上冷却用于Western bolt 或-20℃保存。
5×Loading Buffer配方：①Tris-HCl (250 mM)：Tris-HCl 是一种缓冲盐，用于维持溶液的酸碱平衡，常用于蛋白质提取过程中调节pH 值的作用；②SDS (10%)：SDS （十二烷基硫酸钠）是一种离子型表面活性剂，具有溶解蛋白质和破坏细胞膜的作用，常用于蛋白质提取和电泳分析中；③BPB (0.5%)：BPB（溴酚蓝）是一种染色剂，常用于帮助观察蛋白质电泳分析结果，以检测样品前进方向和监测蛋白质迁移速度；④甘油(50%)：甘油是一种保护剂，可以增加蛋白质提取液的粘度和稳定性，有利于蛋白质的溶解和保存；⑤β-巯基乙醇(5%)：β-巯基乙醇（巯基乙醇）是一种还原剂，可以断裂蛋白质之间的二硫键，有助于蛋白质的还原和解聚。
Western bolt原理及步骤原理：Western Blot是一种常用的蛋白质检测技术，它能够检测复杂蛋白混合物中的某个蛋白的存在，还可以确定其大致分子量，检测其表达水平变化等。
WB以组织或细胞中的蛋白质为研究对象，经过SDS-PAGE分离蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
2-Western blot技术
目录
目录
电泳
目录
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转膜
目录
目录
目录
目录
封闭
目录
抗体孵育
室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
目录
ECL显影
暗室操作！
A液 B液 ECL工作液
混合
1
:
1
膜
目录
定性结果分析
E-cadherin
目录
注意的问题
为达到较好的凝胶聚合效果，缓冲液的pH值要准确，10%AP在一周内使 用。室温较低时，TEMED或AP的量可加倍。 未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒性，应注意防护。
目录
SDS-PAGE胶的考马斯亮蓝染色
目录
3. 转膜
• 定义：要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例 如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。 • 电泳转移方法：湿转和半干转。
• 转移膜的选择：硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜
聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF） 尼龙膜、DEAE纤维素膜
蛋白大小，形状和电荷)系统中加入一定量的十二烷
基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要 取决于蛋白质的分子量大小？
目录
2. SDS-PAGE
SDS能破坏蛋白质分子的二级、三级结构，在含有强
还原剂的溶液中可与蛋白质形成 SDS-蛋白质复合物。
1.4g SDS/1g 蛋白质
SDS 带负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”， 蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了，从而起到消除 各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用，蛋白质 在SDS-PAGE胶中的迁移率主要取决于其分子量的大 小。
(最新整理)westernblot详解
蒸馏水至 1000ml
溶解后室温保存,用时稀释10倍，并加入甲醇至
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20%
（2）夹子黑的一面：海绵-3张滤纸-胶-NC膜-3张滤纸海绵
①将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵 垫。在垫子上垫三层滤纸，固定滤纸,擀去其中的气泡。
②刮去玻璃板上的浓缩胶，小心剥下下层胶，用手调整 使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将NC膜盖于 胶上，要盖满整个胶并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除 去气泡。膜盖下后不可再移动。最后盖上另一个海绵垫， 擀几下就可合起夹子。
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具体情况依照说明书
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灌分离胶： 用1ml的移液枪吸取1ml胶沿玻璃放出，溶液缓 慢加入到装配好的玻璃板中至凝胶高度为6cm左 右，预留1.5cm高度配制浓缩胶。 用1ml的移液枪吸取1ml左右的异丙醇，压平。 沿玻璃放出，注意速度要慢，否则胶会被冲变形 。 温箱放置0.5-1h左右至聚合完全。
注意：边配边平摇烧杯混匀，配好胶后迅速灌胶， 灌胶速度须缓慢，避免产生气泡 灌胶之上轻轻加一层异丙醇，用来压平
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灌制分离胶
隔绝空气
ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%
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二 配制浓缩胶
准备物品： 移液枪 烧杯（ 1 ml 200ul 20ul） Tips： 30%Acrylamide 1M （4度冰箱）， Tris-HCL 溶液（PH=6.8）， ddH2O 10%AP （-20冰箱） ， TEMD（4度） ，SDS（常温）
制作标准曲线 （插入表格）
检 测 样 品 蛋 白 含 量 ： 取 一 管 考 马 斯 亮 蓝 +95 l
WesternBlot操作步骤
WesternBlot操作步骤1.样品处理：-收集样品：从细胞培养物中收集细胞或从组织中收集组织样品。
-破碎细胞：使用合适的细胞破碎缓冲液将细胞破碎并释放蛋白质。
-甲醇沉淀：向破碎细胞中加入冷甲醇，以沉淀蛋白质，并将混合液冷冻在-20℃或-80℃下，使形成沉淀物。
-洗涤：使用冷丙酮洗涤蛋白质沉淀物，去除甲醇等杂质。
-干燥：在室温下或低真空下干燥蛋白质沉淀物，以去除水分。
2.SDS-：-制备凝胶：根据待分离蛋白的大小范围选择合适的凝胶浓度，如8%-12%聚丙烯酰胺凝胶。
- 制备样品：将样品加入样品缓冲液，如Laemmli缓冲液，并将其煮沸，以使蛋白质样品被变性和解聚。
-样品加载：将样品以适当的体积加载到凝胶孔中。
-电泳：将凝胶浸泡在预冷的电泳缓冲液中，并进行电泳（通常为100-200V），直到样品达到所需的分离程度。
-目视观察：在电泳结束后，可以通过染色或蛋白质染色来可视化分离的蛋白质带。
3.电转印：-制备膜和垫纸：将两张蛋白质转移膜和一片垫纸切割成与分离凝胶相同大小的形状。
-准备电转印池：将电转印池中的电转印缓冲液注满，并将蛋白质转移膜、垫纸和凝胶按顺序放入电转印池中，保持它们之间的紧密接触。
-转印：应用恒定的电流（通常为300mA）进行电转印，以将蛋白质从凝胶转移到膜上，通常需要1-2小时。
-验证电转印的效果：将凝胶和膜进行一致性染色或蛋白质染色，以判断蛋白质是否转移到膜上，是否均匀。
4.膜上抗体反应：-阻断：将膜放在牛血清蛋白（如5%脱脂奶粉）或胶原蛋白（如2%BSA）的阻断缓冲液中，以阻止非特异性的抗体结合。
-一次抗体：加入适当稀释的一次抗体，针对待检测蛋白的抗体。
将膜和一次抗体一起在冰箱中孵育，使二者结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗涤膜，以去除非特异性结合的抗体。
-二次抗体：添加适当稀释的二次抗体，该抗体与一次抗体结合，并标记有辅助酶或荧光标记物。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗涤膜，以去除未结合的二次抗体。
western blot检测细胞凋亡蛋白原理
一、前言在细胞生物学和分子生物学研究中，western blot（蛋白免疫印迹）是一种常用的技术，用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达水平。
其中，检测凋亡蛋白是western blot中的重要应用之一。
本文将介绍western blot检测细胞凋亡蛋白的原理，以帮助读者更深入地理解该技术的工作机制。
二、细胞凋亡概述1.细胞凋亡的概念细胞凋亡是一种程序性逝去过程，又称为细胞自我杀死，是机体内原有的一种生理性消亡方式。
在凋亡过程中，受损或老化的细胞通过一系列分子信号通路最终导致细胞逝去，而不会引起周围组织的炎症或损伤。
2.凋亡与细胞凋亡蛋白细胞凋亡是由一系列蛋白质调控的复杂过程，其中包括凋亡抑制蛋白和凋亡诱导蛋白。
检测这些蛋白的表达水平有助于了解细胞凋亡的调控机制和相关疾病的发生。
三、western blot的基本原理1.western blot的步骤western blot技术主要分为蛋白样本制备、SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白、转膜、免疫印迹和膜显色等步骤。
其中，免疫印迹是最关键的步骤，用于检测目标蛋白的存在和表达水平。
2.细胞凋亡蛋白的western blot检测通过western blot技术可以检测凋亡相关蛋白，如Bcl-2家族、caspase家族和PARP等蛋白的表达水平。
主要流程包括：a) 细胞裂解并提取蛋白样本b) SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白c) 将分离的蛋白转膜到聚丙烯酸膜上d) 使用特异性抗体结合目标蛋白e) 使用辅助抗体结合一定的酶标记物f) 基于酶标记物的光学信号检测蛋白带四、western blot检测细胞凋亡蛋白的原理1.选择特异性抗体western blot的关键是选择特异性抗体，以保证目标蛋白的特异性检测。
通常可以通过文献资料或商业抗体公司获取针对目标蛋白的特异性抗体。
2.抗原和抗体结合在免疫印迹过程中，特异性抗体与其结合的抗原蛋白发生反应形成复合物。
这一步骤是确保检测凋亡蛋白的关键步骤，需要保证抗体的特异性和蛋白的完整性。
westernblot实验报告
westernblot实验报告西方印迹（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析技术，广泛应用于生物医学研究领域。
本文将介绍Western Blot实验的原理、步骤以及其在科研中的应用。
一、实验原理Western Blot是一种通过将蛋白质分离、转移、固定和检测的技术。
首先，将待检测的蛋白质样品经过电泳分离，然后将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接下来，将膜固定并与特定抗体反应，以检测目标蛋白质的存在和表达水平。
二、实验步骤1. 样品制备：将待检测的蛋白质样品加入蛋白负荷缓冲液，经过煮沸和离心处理，使样品变性并去除杂质。
2. 凝胶电泳：将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，通电使蛋白质在凝胶中按照大小被分离。
3. 转印：将凝胶中的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通过电流使蛋白质迁移。
4. 固定膜：用甲醛等化学物质固定膜上的蛋白质，以保持其位置和结构。
5. 抗体反应：将特异性抗体加入到膜上，与目标蛋白质结合形成特异性免疫复合物。
6. 信号检测：通过添加酶标记的二抗或荧光标记的二抗，使免疫复合物发出可检测的信号。
7. 结果分析：使用成像设备或荧光显微镜观察和记录蛋白质的表达水平。
三、应用领域Western Blot技术在生物医学研究中有着广泛的应用。
首先，它可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，帮助科研人员了解蛋白质的功能和调控机制。
其次，Western Blot还可以用于检测特定蛋白质的修饰状态，如磷酸化、甲基化等，以研究这些修饰对蛋白质功能的影响。
此外，Western Blot还可以用于检测蛋白质的亚细胞定位，研究蛋白质在细胞中的分布情况。
Western Blot技术的优点在于其高灵敏度和特异性。
通过选择合适的抗体，可以实现对特定蛋白质的检测和定量。
此外，Western Blot还可以同时检测多个蛋白质，从而提高实验效率。
然而，Western Blot也存在一些局限性。
首先，由于其操作步骤较多，需要较长的实验时间。
Western Blot
Western BlotWestern Blot中文一般称为蛋白质印迹。
它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。
通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。
目录一、发明者蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治·斯塔克（George Stark）。
在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。
二、原理Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
三、分类Western Blot显色的方法主要有以下几种：i.放射自显影ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECFiv.底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
四、操作步骤（一）蛋白样品制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
westernblot煮蛋白要点
westernblot煮蛋白要点Western blot煮蛋白是一种常用的蛋白质检测技术，通过分离蛋白质、转移到膜上、染色等步骤，可以检测特定蛋白质在混合蛋白质中的存在和表达水平。
下面将详细介绍Western blot煮蛋白的要点。
第一要点：样品制备在进行Western blot煮蛋白实验前，首先需要提取蛋白质样品。
常用的方法包括细胞裂解液裂解、组织研磨、血清、尿液等来源的蛋白质提取。
在提取过程中需要添加蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂，以保护蛋白质的完整性和活性。
第二要点：SDS-PAGE电泳提取的蛋白质样品需要进行SDS-PAGE电泳分离。
SDS-PAGE电泳是一种以聚丙烯酰胺凝胶为分离介质，通过电场作用将蛋白质按照大小分离的方法。
在电泳过程中，蛋白质会从凝胶上向下迁移，最终形成蛋白质条带。
第三要点：转印完成SDS-PAGE电泳后，需要将分离的蛋白质转移到膜上。
这个步骤称为电泳转印。
常用的转印方法有湿式转印和半湿式转印。
转印过程中，蛋白质会被转移到膜上并固定在上面，为后续的染色和检测提供条件。
第四要点：染色转印完成后，需要对膜上的蛋白质进行染色。
染色可以选择各种染色剂，如Ponceau S染色、Coomassie蓝染色或银染色。
染色后的膜上会出现蛋白质条带，可以根据条带的位置和强度进行进一步的分析。
第五要点：免疫检测Western blot的关键步骤是免疫检测。
在此步骤中，需要将膜与特异性抗体反应，通过抗体与蛋白质的结合来检测特定蛋白质的存在和表达水平。
免疫检测的结果可以通过化学发光或荧光等方法来观察和记录。
第六要点：数据分析最后一步是数据分析。
通过Western blot的结果，可以得到目标蛋白质的表达水平和其他相关信息。
通过比较不同样品之间的差异，可以得出结论并进行进一步的实验设计和研究。
总结：Western blot煮蛋白作为一种常用的蛋白质检测技术，具有高灵敏度和特异性，广泛应用于生物医学研究中。
Western_blotting
3. 显色反应
ECL超敏发光液
辣根过氧化物酶在过氧化氢存在的条件下催化鲁米诺，生成一种不稳定的中间 产物，当其衰变时即可发光。
二抗结合漂洗后，加入ECL超敏发光液，避光发光3-5分钟。
曝光
发出的光可使标准X-光片感光，产生较易识别的图像。
发光3-5分钟后，将膜夹如透明薄膜中，置于曝光夹（感光屏）中 曝光3min左右，然后进行显影液显影，定影液定影（和洗照片是 一样的）
方法一: 直接法
优点： 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的 非特异性条带 缺点： 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便
抗原抗体反应
方法二: 间接法
优点： 1.免疫特异性不受标记影响 2.信号放大,灵敏度高（多个二抗
结合位点） 3.多种标记的二抗可供选择
免疫印迹的基本步骤
➢ 蛋白质样品的制备 ➢ 蛋白质的SDS-PAGE电泳 ➢ 蛋白质的膜转移 ➢ 封闭与抗原抗体反应 ➢ 显色（显影）反应
实验流程
样品收集制备 SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白
剥胶并电转移
封闭
一抗4℃孵育过夜 第二天，二抗37℃孵育1小时，显影曝光
条带灰度分析定量
蛋白质样品的制备
1. 电转移相关问题： 滤纸、胶、膜之间的大小。 滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成断路。 膜必须随时保持湿润（干膜法除外）。 系统降温
2. 抗体的性质 影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识 别的表位的性质。只有那些能识别耐变性表位的抗体可与抗 原结合。
常见问题及解决办法
3 .样品中待检测蛋白质的含量 采用目前的技术，浓度低至0.1ng的蛋白亦可被检出 4. 背景问题 非特异性条带的来源一般有两种：一种是由于制剂中存在的非特异 抗体产生的背景条带，另一种则是由于特异性抗体与含有与待测抗原 类似表位的多肽发生的交叉反应 ① 弥散性高背景：可能原因是二抗产生,解决办法:缩短二抗孵育时 间；用高浓度的蛋白质来吸附二抗（二抗内加3％BSA）；使用另外的 二抗；缩短一抗和二抗的孵育时间；延长每次清洗时间。
westernblot实验原理
westernblot实验原理
Western blot实验是一种常用的蛋白质分析技术，其原理涉及蛋白质的分离、转移和检测。
首先，样品中的蛋白质会被电泳分离成不同大小的片段，然后将这些片段转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接着，膜上的蛋白质会与特定的抗体结合，形成蛋白质-抗体复合物。
最后，通过添加特定底物，可以观察到这些复合物的位置和强度，从而定量分析蛋白质的表达水平。
这项技术在生物医学研究和临床诊断中被广泛应用，可以帮助科研人员和医生了解蛋白质的表达及其在疾病发生发展中的作用。
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存在时与蛋白结合）
机械强度
强
干的膜易脆
软而结实
溶剂抗性
强
差
差
使用前是否需要浸
100%甲醛润湿
缓冲液润湿
缓冲液润湿
润
适用染色方法
胶体金、丽春红、酰胺黑、印度 胶体金、丽春红、 不 能 用 阴 离 子
墨汁、考马斯亮兰
酰胺黑、印度墨汁 染料
适用检测方法
显色法、化学发光、荧光、放射 显 色 法 、 化 学 发 显 色 、 化 学 发
常用的转移膜类型有：PVDF 膜、硝酸纤维素膜（NC 膜）和尼龙膜， 其中 PVDF 和 NC 膜的使用频率最高。各种膜的技术参数及比较如下：
PVDF 膜
NC 膜
尼龙膜
灵敏度和分辨率
高
高
高
背景
低
低
较高
蛋白结合能力
100-200ug/cm2（适用 于 SDS 80-100ug/cm2
>400ug/cm2
一、蛋白提取
蛋白提取的质量直接决定着 WB 结果的好坏，因此，根据标本类型和 检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的！
使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特 定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可 以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用商业化的试剂盒进 行抽提。
根据待测蛋白分子量大小确定分离胶的浓度
蛋白分子量（kDa）
凝胶（分离胶）浓度（％）
4-40
20
12-45
15
10-70
12.5
15-100
10
25-200
8
选择合适的阳性对照： 阳性对照为已经明确表达目的蛋白的细胞或组织提取物，同时电泳，
杂交，以确定检测结果的准确性以及判定抗体的有效性。Abcam 抗体说明 书中一般有推荐的阳性对照类型，同时 Abcam 还提供大量的细胞和组织裂 解物，可用作 WB 的阳性对照。
021-61130227/8/9
规格
价格
500test 2160
４
我要抗体 51AB
51AB 无忧抗体
3、在检测时使用内参抗体，以检测蛋白提取的质量
4、提取蛋白后进行蛋白的定量，以对后续操作进行监控（比如半定量，确 定蛋白上样量等）
蛋白质的快速定量方法主要依靠蛋白质本身的发色基团，或其与其它 显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量。目前常用的主要有直接紫外吸收 法、Bradford 法和 Lorry 法三种。也有市售的商业化的蛋白定量试剂盒，可 直接购买使用。
021-61AB 无忧抗体
WB 第 2 步：PAGE 电泳分离蛋白和转膜、封闭
一、电泳分离
制备凝胶 SDS-PAGE 凝胶可以购买商业化的也可以自行配制，不论选择哪种，
确定合适的凝胶浓度是十分关键的。凝胶的浓度取决于目的蛋白的分子量 大小，目的蛋白分子量越大，则凝胶浓度越低。参阅下表
抑制剂名称
作用蛋白酶/磷酸酶 名称
终浓度
储存液 (保存在 -20℃)
Aprotinin
胰蛋白酶、糜蛋白 酶、纤溶酶
用水溶解, 10 mg/ml 2μg/ml 不可反复冻融
Leupeptin
溶酶体酶
5-10 μg/ml
用水溶解。不可反复 冻融。
Pepstatin A
天冬氨酸蛋白酶
1μg/ml 用甲醇溶解, 1mM。
Na Orthovanadate 酪氨酸磷酸酶
1mM
用水溶解。不可反复 冻融。
Sodium orthovanadate 制备:用双蒸水制备100 mM的溶液；用HCl调整pH值到
9.0，然后煮沸到溶液无色，冷却到室温；再次调整pH值到9.0，再煮沸到溶液
无色。如此反复调整煮沸直到pH值维持在9.0不再变化。用双蒸水调整到初始体
二、样品处理（提取后蛋白处理）
1、变性、还原标本： 在标本中加入含有SDS的上样缓冲液，然后在95-100℃煮沸5-15分钟，
以充分变性蛋白，保证蛋白从空间结构变为一级结构（多聚体解散为单聚 体，氧化状态转化为还原状态等）。有时也可以在70°C加热5-10分钟，尤其 适用于多次跨膜蛋白的检测（这些蛋白在煮沸状态下容易聚集，而聚集状 态则会影响标本进入凝胶的效率）。
蛋白质分子量 Marker 蛋白质分子量 Marker 的使用，是检测电泳效果和确定待测靶蛋白分子
量大小和正确与否的保证！预染 Marker 更方便直接观察电泳和转膜效果。
相关产品信息 目录号 产品描述 ab41746 protein Molecular Weight Marker ab48854 protein Molecular Weight Marker
前言
Western Blot 是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白根据分子量大小分开， 然后转移到固相载体（杂交膜）上，最后通过抗原抗体反应检测杂交膜上 的靶蛋白是否存在，从而检测到靶蛋白在待测标本中的表达情况。目前 Western Blot 已经是蛋白检测的最常用和成熟的技术之一。
要成功完成 Western Blot 检测，必须满足 4 个条件：
积。分装然后保存在-20°C
注意：在煮沸过程中液体体积避免变化太大，可加瓶盖以免溶液过渡蒸发。需
在通风橱中操作。溶液变黄后即丢弃。
相关产品信息
目录号
产品描述
ab65621
Protease Inhibitor Cocktail (Aprotinin,Leupeptin,Pepstatin A,PMSF)
测
测。0.1um 膜适用 白、糖蛋白、蛋
于 7kDa 以下蛋白 白多糖、核酸检
测常用
价格
高
较低
低
备注：PVDF膜需要小心预处理：将膜剪成合适的大小，在甲醇中浸润1-2分钟 后，在预冷的转膜buffer中孵育5分钟，凝胶也需要在预冷的转膜buffer中平衡3 －5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形
• 二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性 • 内参对照：检测标本的质量和二抗系统 • 空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果
本手册从按照 Western Blot 操作的基本过程来解析一些主要的要点和 注意事项、常见问题分析，旨在能为各位老师在进行实验时提供点滴参考。
还原，不变性
含β-巯基乙醇或 DTT，不含SDS
不含SDS
Oxidized Denatured
不还原，变性
不含β-巯基乙醇或 DTT，含SDS
含SDS
Oxidized - Native
不还原，不变性 不含β-巯基乙醇或 DTT，不含SDS
不含SDS
备注：除非说明书有特殊说明，一般 WB 均为变性和还原电泳条件。
规格 500ul 500ul
价格 1860 1860
分子量范围 14.6-112kDa 8.5-70kDa
021-61130227/8/9
７
我要抗体 51AB
51AB 无忧抗体
上样与电泳 将处理后的标本直接上样到 SDS-PAGE 胶加样孔内即可。为了便于观
察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，通常选择蛋白质分子 量 Marker（市售有不同大小的预染和非预染蛋白 Marker）。
成功进行 Western Blot 检测，设置合适正确的对照是必不可少的，只 要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到 Western Blot 的问题所在， 并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：
• 阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作 效率
• 阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异 性
性、化学荧光、快速免疫检测 光、荧光、放射性 光、放射性
适用范围
普通蛋白 WB、糖蛋白检测、蛋 普通蛋白 WB、氨 低 浓 度 小 分 子
021-61130227/8/9
８
我要抗体 51AB
51AB 无忧抗体
PVDF 膜
NC 膜
尼龙膜
白质测序、氨基酸分析、重复检 基酸分析、重复检 蛋 白 、 酸 性 蛋
1、根据检测蛋白的位置选择合适的裂解 buffer：
蛋白位置
推荐 buffer
全细胞
NP-40 或 RIPA
胞浆（可溶性蛋白）
Tris-HCl
胞浆（骨架结合蛋白）
Tris-Triton
膜蛋白
NP-40 or RIPA
核蛋白
RIPA or 核蛋白提取试剂盒
线粒体蛋白
RIPA or 线粒体分离试剂盒
线粒体/细胞浆蛋白分离试剂：该试剂盒提供独特的试剂可从多种哺乳 动物细胞（包括凋亡和非凋亡细胞）中分离出线粒体部分和胞浆部分，得 到的蛋白保持了原有的生物学活性，可直接用于分析线粒体组份在胞浆和 线粒体中分布的变化，如：WB，ELISA 等。操作过程简单、方便，不使用 有毒的物质，无需超速离心。该试剂盒也可用于分离完整的线粒体架构。
Laemmli 2X buffer 的配方： 4% SDS 10% 2-mercaptoehtanol 20% glycerol 0.004% bromophenol blue 0.125 M Tris HCl
021-61130227/8/9
５
调整 pH 值到 6.8
而有些抗体只能识别蛋白的非还原状态如氧化状态，对此类标本，就 需要将缓冲液和凝胶中的还原剂 DTT 和 β-巯基乙醇去除。
先根据待测蛋白状态确定电泳条件：
待测蛋白状态
凝胶条件
上样buffer
电泳buffer
Reduced Denatured
还原，变性
含β-巯基乙醇或 DTT，含SDS
含SDS