第三十二章抗微生物药物和敏感性试验
微生物实验 药物敏感实验
微生物药物敏感实验
⏹一、实验目的
⏹1、熟悉和掌握圆纸片扩散法检测细菌对抗菌药物敏感性的操作程序和结果判断方
法。
⏹2、了解药敏试验在实际生产中的重要意义
二、实验原理
⏹将含有定量抗菌药物的纸片（药敏纸片）贴在已接种待检菌的琼脂平板表面特定部
位。
药物借其分子的扩散力向周围琼脂中扩散，形成了随着离纸片距离加大，琼脂中的药物浓度逐渐减少的梯度浓度。
其纸片周围一定区域琼脂内的药物浓度高于抑制待检菌所需浓度时，则该区域内细胞不能生长，形成透明抑制圈。
抑菌圈的大小可以反映待检对测定药物的敏感程度，抑菌圈愈大，说明该菌对此药物越敏感三、实验器材
⏹1．菌种大肠埃希菌。
⏹2．培养基牛肉膏蛋白胨培养基。
⏹3．试剂无菌生理盐水，抗菌药物纸片：
包括青霉素、氨苄西林、土霉素、链霉素等。
⏹4．其他无菌棉拭子、镊子、毫米尺、接种环。
四、实验方法和步骤
⏹1．菌液制备
菌浓合适，一般为106
⏹2．接种
细菌悬液制备后15min内接种至倒好的牛肉膏蛋白胨培养基平板中，接种量0.1-0.2mL。
涂布均匀。
⏹3．贴药敏纸片
⏹涂布后的平板在室温下干燥3~5min，用纸片分配器或无菌镊子将纸片贴于琼脂表面
并轻压，使纸片与琼脂表面完成接触。
各纸片中心相距应大于24mm，纸片贴上后就不能再移动位置。
⏹4．培养
⏹将平板倒置放入37℃培养箱培养，16~18h读取结果。
五、实验结果
六、思考题
⏹ 1.圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项？
⏹ 2. 试述药敏试验的意义。
抗菌药物敏感性试验与耐药检测ppt生物技术实验教学中心课件
8.联合药物敏感试验
1）方法很多，其中纸片法最为常用。先将试验菌均 匀涂布于培养基表面，盖好平皿，放置5分钟，待 平板表面水分吸收后，将两种含药纸片贴于平板 上，两纸片中心距离2--4mm左右。然后35℃ 孵育 过夜，取出观察结果。
2）结果判断 联合药物敏感试验可出现四种结果： A.无关作用： 甲+乙=甲单或乙单 B.拮抗作用： 甲+乙＜甲单或乙单 C.相加作用： 甲+乙=甲单+乙单 D.协同作用： 甲+乙＞甲单+乙单
三、实验操作步骤
（一）纸片扩散法：
1. M-H平板：直径为90mm，厚度 4mm。 2. 菌悬液制备：无菌挑取菌落于无菌生理盐水中，校
正浊度至0.5 麦氏。 3. 用无菌棉签浸入细菌悬液中，将棉签在试管壁上轻
轻挤压以挤去过多的菌液，用棉签以连续划线的方 式均匀涂抹琼脂平板表面三次（每次转60℃）使 菌液均匀分布，最后沿平板内缘涂抹一周。盖上 平板的盖子，放置3~10min。
一、实验目的：
1. 掌握纸片扩散法（K-B法）的原理、操作方法、结 果的判读及临床意义。
2. 了解各种稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作 方法、结果判读和临床意义。
3. 掌握纸片扩散法的质量控制，了解稀释法的质量 控制。
二、实验原理
1. 抗菌药物敏感性试验是测定抗生素或其他抗 微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力。这 种能力可以通过稀释或扩散方法来测定。
六、影响因素：
1. 培养基：厚度，PH，离子浓度，成份，添加剂； 2. 抗菌药物的配制方法，纸片的含量，大小，
渗透性，保存方式等； 3. 细菌的接种量； 4. 培养的环境，温度与时间； 5. 结果的判断及解释标准等。
4.每个孔加入100ul浓度为105菌悬液（大肠或金 葡），混匀，胶布封口，37°C培养。
药物敏感性实验
药物敏感性实验●学习内容●药物敏感实验¡ª¡ª纸片法●学习要求●掌握药物敏感实验的原理、方法及注意事项。
●抗菌药物敏感性试验（AST，简称药敏试验）：●用于测试抗菌药物在体外对病原微生物有无抑制作用。
常用最低抑菌浓度（MIC）表示，即体外能够抑制细菌生长的最低药物浓度。
通常根据MIC结合常用剂量时体内该药所能达到的血药浓度，划定细菌对各种抗生素敏感或耐药的界限，给出S（敏感）、I（中介）、R（耐药）等定性的结果，方便临床用药。
●检测病原菌对各种抗生素的敏感性，指导临床合理用药。
用于流行病学调查及院内感染的监控，控制和预防耐药菌株的流行。
为经验用药提供参考依据。
●方法：扩散法（纸片法）、稀释法（琼脂稀释法、宏量液体稀释法、微量液体稀释法）●药敏纸片的人工制作●定性滤纸用打孔器打成直径6mm的圆片，每100片放入一小瓶中，160℃干热灭菌1～2小时，或用高压灭菌（6.8kg 30min）后在60℃条件下烘干。
（此应提前做好）●抗菌药物的浓度（指有效药物浓度）青霉素200U/mL 其它抗菌药物1000ug/mL磺胺类药物10mg/mL 中草药制剂1g/mL庆大霉素4万单位/mL，稀释为1000单位/mL。
●（临床上可按照药品使用说明书，如上面标明5g本品可拌50kg饲料，其换算方法为lg本品可拌10kg饲料，也就是1g本品拌l0000g饲料，相当于药品浓度为lg本品加l0000mL蒸馏水。
）●用无菌操作法将欲测的抗菌药物溶液1mL，加入100片纸片中，泡5～10分钟。
●培养皿烘干法：用无菌镊子将浸有抗菌药液的纸片摊平在培养皿中，于37℃的温箱内保持2～3小时即可干燥，或放在无菌室内过夜干燥。
●将制好的各种药物纸片装入无菌小瓶中，置冰箱内保存备用。
●干燥的药敏纸片可保存6个月。
●纸片法●每组约5个平皿（每人1个），每个平皿约20毫升琼脂培养基，即约120mL。
每平皿约5张纸片。
抗微生物药物和敏感性试验-精品医学课件
菌落数（CFU）/ cm2 = 菌落数/ 采样面积
2.压印法
用直径5cm的特制平皿（Rodac平皿），倾注于16.5ml琼 脂后可使培养基高出平皿口1~2mm，凝固后将平皿上的琼 脂直接压贴于物体表面10~20s，接触面积为19.63平方厘米。
2.对居住环境、特殊病房、实验室、无菌车间等场所空气质量 的细菌学评价。
实验目的
掌握医院感染的微生物监测方法
目的与要求
器材与试剂
器材与试剂
普通琼脂平板（直径90mm及60mm)、无菌生理盐水、无菌 棉拭子等。
步骤与方法
一、空气中细菌含量的检测
1.检测对象：医院各个科室的空气，手术室、新生儿室、产房、 烧伤病房、重症监护室等空气污染的检测，应成为医院感染 管理中特别关注的重点。
2. 用无菌棉拭子蘸取菌液,在管内壁将多余菌液旋转 挤去后在琼脂表面均匀涂布接种3次,每次旋转平板 60度,最后沿平板内缘涂抹1周。
3. 平板置室温下3-5分种后，用纸片分离器或无菌镊 将含药纸片贴于琼脂表面,各纸片中心相距应大于 24mm,纸片距平板内缘应大于15mm。（纸片选 择参照实验书p39）
药敏实验与医院感染的检测
一、抗菌药物敏感试验
抗菌药物敏感性试验
纸片琼脂扩散法
经世界卫生组织推荐,目前各国临床微生物学实验 室广泛采用的标准纸片扩散法是由Kirby和Bauer 所建立的纸片琼脂法,即Kirby-Bauer法(K-B法纸 片琼脂扩散法)
实验原理
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板 上,纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片 周围扩散形成递减的梯度浓度,在纸片周围抑菌浓度范围内 测试菌的生长被抑制,从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌 圈.抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度。
抗菌药物敏感性试验的技术要求
抗菌药物敏感性试验的技术要求1 范围本标准规定了临床抗菌药物敏感性试验的技术要求，包括常规药敏试验的药物选择和报告、药敏试验方法、各种属细菌药敏试验、常见菌特殊耐药表型检测、药敏试验的质量控制、商品化药敏试验检测系统的性能验证。
本标准适用于开展临床微生物学检验的各级临床实验室。
2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
2.1抗微生物药物敏感性试验Antimicrobial susceptibility testing检测微生物（本文件特指细菌）对抗微生物药物（本文件特指抗菌药物）的体外敏感性，以指导临床合理选用药物的微生物学试验，简称药敏试验。
2.2最低抑菌浓度Minimal inhibitory concentration；MIC在琼脂或肉汤稀释法药物敏感性检测试验中能抑制肉眼可见的微生物生长的最低抗菌药物浓度。
2.3折点Breakpoint能预测临床治疗效果，用以判断敏感、中介、剂量依赖型敏感、耐药、非敏感的最低抑菌浓度（MIC）或者抑菌圈直径（mm）的数值。
2.3.1敏感Susceptible；S当抗菌药物对分离株的MIC值或抑菌圈直径处于敏感范围时，使用推荐剂量进行治疗，该药在感染部位通常达到的浓度可抑制被测菌的生长，临床治疗可能有效。
2.3.2中介Intermediate；I当菌株的MIC值或抑菌圈直径处于中介时，该数值接近药物在血液和组织中达到的浓度，从而治疗反应率低于敏感菌群。
该分类意味着采用高于常规剂量治疗时或在药物生理浓集的部位，临床治疗可能有效。
该分类同样可作为“缓冲域”，以防止由微小、不可控的技术因素导致的重大偏差，尤其是毒性范围较窄的药物。
2.3.3剂量依赖型敏感Susceptible-dose dependent；SDD细菌菌株对抗菌药物的敏感性依赖于抗菌药物的剂量。
当某种药物对菌株的MIC或抑菌圈直径在SDD 范围时，临床可通过提高剂量和（或）增加给药频率等修正给药方案以达到临床疗效。
抗微生物药物和敏感性试验
临床常用抗生素
青霉素类 头孢菌素类 其他β-内酰胺类抗生素 其他 内酰胺类抗生素 氨基糖苷类 喹诺酮类 大环内酯类 四环素、 四环素、氯霉素和林可霉素类 糖肽类 磺胺类 其他合成抗菌药物
临床常用抗生素
注： 抗微生物新药不断涌现,给感染性疾病的治疗带来福 音。 抗菌药物的使用不当可促进耐药菌在病人体内和医 院环境中定殖繁衍导致交叉感染和内源性感染。 合理使用抗菌药物的前提是重视感染病原学的实验 室检查和监控抗感染治疗的药物选择.
（二）分类：1.液体稀释法 分类： 液体稀释法
2.琼脂稀释法 琼脂稀释法
抗菌药物敏感性试验
其他
1.结核杆菌的药敏试验 结核杆菌的药敏试验 2.厌氧菌的药物敏感试验 厌氧菌的药物敏感试验 3.真菌的药物敏感试验 真菌的药物敏感试验
抗菌药物敏感性试验
特殊耐药菌检测 （一）耐甲氧西林葡萄球菌检测
金葡菌： 苯唑西林抑菌圈 苯唑西林抑菌圈≦ 金葡菌：1ug苯唑西林抑菌圈≦10mm或MIC≧0.4ug/ml 或 ≧ 凝固酶阴性葡萄球菌： 苯唑西林抑菌圈≦ 凝固酶阴性葡萄球菌： 1ug苯唑西林抑菌圈≦17mm 苯唑西林抑菌圈
抗菌药物敏感性试验
(七) 质量控制 七
采用标准菌株金葡菌ATCC25923,大肠埃希菌 大肠埃希菌ATCC25922 采用标准菌株金葡菌 大肠埃希菌 和铜绿假单胞菌ATCC27853等与测试菌在同一条件下做药 和铜绿假单胞菌 等与测试菌在同一条件下做药 敏试验 标准菌株的抑菌圈应落在预期范围内.如果超出范围 如果超出范围,则不应 标准菌株的抑菌圈应落在预期范围内 如果超出范围 则不应 发出报告,及时检查原因 予以纠正 发出报告 及时检查原因,予以纠正 及时检查原因 每日标准菌株的测定结果应以抑菌圈直径为纵坐标,天数为 每日标准菌株的测定结果应以抑菌圈直径为纵坐标 天数为 横坐标绘制室内质控图,要求每天抑菌圈变化数不得超过 横坐标绘制室内质控图 要求每天抑菌圈变化数不得超过 2mm 标准菌株应每周在MH琼脂上传代一次 ℃保存 琼脂上传代一次,4℃ 标准菌株应每周在 琼脂上传代一次
微生物抗药性耐药性
微生物对抗微生物药的敏感性和耐药性微生物对抗微生物药的敏感性和耐药性【抗微生物敏感性】细菌为常见的重要病原微生物，各种病原菌对不同的抗菌药物有不同的敏感性。
测定敏感性的方法称为药物敏感试验，即在体外通过被检测药液的稀释（试管法、微量法、平板法）或扩散（纸片法），测定抗菌药物对病原微生物有无抑制或杀灭作用。
在试管法中以抑制细菌生长为评定标准时可用最低抑菌浓度( Minimal Inhibitorv Concentra-tion，MIC)表示，在一批实验中能抑制50%或90%受试菌所需MIC，分别称为MICso 和MIC90。
以杀灭细菌，使活菌总数减少99%或99 .9%以上为评定标准时，称为最低杀菌浓度(MinimalBactericidal Concentration，MBC)。
其单位均为/ig/mL或mg/L。
通常根据抗菌药物对某一细菌的MIC．结合该药的常用剂量所能达到的血药浓度划定细菌对各种抗菌药物敏感或耐药的界限。
其标准是当一种细菌引起的感染用某种药物的常用量治疗有效，即常规用药时达到的平均血药浓度超过MIC5倍以上者为高度敏感；当细菌引起的感染仅在应用高剂量药物时才有效，即常规用药时达到的平均血浓度相当于或略高于MIC为中度敏感；低于MIC或细菌能产生灭活抗菌药物的酶时均判定该菌对该药为耐药。
纸片法操作较简单，适用于生长较快的需氧菌和兼性厌氧菌的药敏测定。
细菌对抗菌药物的敏感度以纸片周围抑菌圈直径大小为标准，其直径与药物对细菌的MIC成反比，抑菌圈越大，说明细菌对该抗菌药物愈敏感，一般的判定标准为：抑菌圈直径> 20mm 为极度敏感，15.1 - 20mm为高度敏感。
10 - 15mm为中度敏感，<lOmm为耐药。
抗菌药物一般按常用量在血液和组织中的药物浓度所具备的杀菌或抑菌性能，分为杀菌剂和抑菌剂两类。
前者MBC约等于其MIC，包括青霉素类、头孢菌素类、氨基糖苷类、多黏菌素类等；后者的MBC远大于其MIC，包括四环素类、大环内酯类、磺胺类等。
临床医学检验：抗微生物药物和敏感性试药真题及答案一
临床医学检验：抗微生物药物和敏感性试药真题及答案一1、判断题A群链球菌对杆菌肽的敏感率几乎100%，所以一旦试验结果敏感即可确认该链球菌为A群，敏感判定标准为抑菌环直径＞10mm。
()正确答案：对2、单选（江南博哥）目前最强的抗绿脓杆菌抗生素是（）A.普鲁卡因青霉素B.羧苄青霉素C.先锋霉素ⅣD.头孢他啶E.头孢呋辛正确答案：D3、多选关于抗菌药物敏感试验，说法正确的是()A．监测耐药性B．提供所选择药物的依据C．其结果总与体内用药结果相一致D．可预测抗菌治疗的效果E．指导医师选择使用抗生素正确答案：A, B, D, E4、单选下列药物中哪种抗铜绿假单胞菌作用最强（）A.羧苄西林B.替卡西林C.阿莫西林D.呋苄西林E.双氯西林正确答案：D5、单选液体稀释法不适合做药敏试验的是()A．头孢噻肟B．磺胺C．氧氟沙星D．万古霉素E．红霉素正确答案：B6、单选对革兰阳性菌作用弱，对革兰阴性菌包括绿脓杆菌作用强的药物是（）A.第一代头孢菌素B.第二代头孢菌素C.第三代头孢菌素D.第四代头孢菌素E.碳青霉烯类抗生素正确答案：C7、问答?患者刘某，女，40岁，尿频、尿急、尿痛1周，体检：体温38.5℃，明显肾区叩痛，双下肢无水肿。
实验室检查：尿WBC3(+)/HP，偶见白细胞管型。
中段尿培养为大肠埃希菌＞10万CFU/L，纸片扩散法药敏试验结果为头孢噻肟6mm，头孢噻肟/棒酸26mm，头孢他啶21mm，头孢他啶/棒酸27mm，呋喃妥因25mm(中介判定值为15～16mm)。
根据题目中所给出的药敏实验结果，可判断此株菌存在哪种耐药机制，由于这种耐药机制的存在，临床抗生素应用方面应注意哪些问题?正确答案：根据头孢噻肟和头孢他啶加棒酸后比不加棒酸的抑菌环直径均＞5mm，确定此株菌产生超广谱β-内酰胺酶(ESBL)。
临床抗生素应用方应避免使用青霉素类、头孢菌素类和氨曲南，即使这些药物的体外实验显示敏感，临床上也可能治疗无效。
抗微生物药物敏感性试验执行标准
抗微生物药物敏感性试验执行标准抗微生物药物敏感性试验是评价抗菌药物对微生物的作用和微生物对抗菌药物的敏感性的重要手段。
正确执行抗微生物药物敏感性试验，对于指导临床用药、控制细菌耐药性具有重要意义。
本文将详细介绍抗微生物药物敏感性试验的执行标准。
1. 试验菌株的选取。
试验菌株的选取是抗微生物药物敏感性试验的第一步。
应根据临床感染的部位和病原菌的种类，选择相应的菌株进行试验。
同时，应注意菌株的来源、保存和传代方式，以保证试验结果的准确性和可重复性。
2. 试验方法的选择。
根据不同的抗菌药物和微生物，选择合适的试验方法进行抗微生物药物敏感性试验。
常用的试验方法包括纸片扩散法、微量稀释法等。
在选择试验方法时，应考虑到试验的灵敏度、特异性和操作的简便性，并严格按照相关标准进行操作。
3. 试验条件的控制。
试验过程中，应严格控制试验条件，包括温度、湿度、培养基的配制和质量等。
试验操作人员应具备良好的实验操作技能，严格按照操作规程进行操作，避免外界因素对试验结果的影响。
4. 试验结果的解读。
试验结束后，根据试验结果进行解读。
应根据相关标准和临床实际，判断微生物对抗菌药物的敏感性，确定抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）等参数。
同时，应注意对试验结果的统计学分析，确保结果的科学性和可靠性。
5. 结果报告和数据保存。
试验结果应及时进行报告，包括试验方法、试验菌株、试验条件、试验结果等内容。
同时，应将试验过程中的原始数据进行保存，以备查验。
在报告中应注明试验人员、试验时间、试验地点等信息，确保结果的可追溯性和可信度。
6. 质量控制和质量保证。
在抗微生物药物敏感性试验过程中，应严格执行相关质量控制和质量保证程序。
包括对试验菌株的鉴定、对试验方法的验证、对试验条件的控制等方面进行严格管理，确保试验结果的准确性和可靠性。
7. 相关标准和法规的遵守。
在执行抗微生物药物敏感性试验时，应严格遵守相关的标准和法规，包括药典规定、临床实验室质量管理规范等。
抗微生物药物和敏感性试验
（3）分子试验 PCR直接检测mecA基因 （4）酶试验 Nitrocefin、ESBL检测
精选ppt
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（五）结果的解释和报告
▪ R、I、S、MIC ▪ 时间依赖性：β-内酰胺类，缩短投药间隔 ▪ 浓度依赖性：氨基糖苷类，日剂量1次应用
精选ppt
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（一）实验原理
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的 琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分 溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度， 在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制， 从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程 度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
未经解释、就事论事的报告经过解释、全面的报告
表型的检测耐药机制的检测、耐药流行病学分析
临床用药
Medical choice Bacteriological choice精选ppt17
二、AST的意义***
▪ 可预测抗菌药物治疗的效果，即AST实验“敏感”时，
治疗可能有效；实验结果为耐药时，使用该药物治疗 肯定失败；
精选ppt
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三要素 药物、机体、病原菌
相关性 体外和体内，抑菌和杀菌，单独和联合
预测性 耐药表型(个体)→耐药机制→耐药表型(同类)
(预测药物)
(同类药物)
重点监测的耐药菌株：MRS, PRP, VRE, ESBL
发出有选择、有解释的报告，与医师直接对话
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小结
药敏试验
ASTART，用体外试验预测体内结果
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(二）苛养菌药敏试验抗生素的选用
抗微生物药物敏感试验
1. β ～内酰胺酶检测
1）碘淀粉法
原理 ：
β -内酰胺酶能裂解青霉素的β -内酰胺酶环形成青霉 素噻唑酸，它与淀粉竞争游离碘，破坏了碘和淀粉的蓝色 复合物，使蓝色变为无色。
结果判定：
当含青霉素培养基内的待测菌加入可溶性淀粉和碘液 后，10分钟内能使蓝色完全消退的待测检为产β -内酰胺 酶阳性株。
2）临床意义 MRS不论其体外药敏试检结果， 所有的β -内酰胺类药物和β -内酰胺抑制剂均无临 床疗效；绝大多数的MRS常示多重耐药，包括氨基 糖苷类、大环内脂类、四环素类。
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3.耐青霉素肺炎链球菌检测 1)定义 当对1μg苯唑西林纸片的抑菌圈直径
＜20mm或MIC＞0.06应视为耐青霉素肺炎 链球菌（vancomycin resistant enteroccoccus, VRE）
2）微量稀释法（microdilution broth method） 采用微量稀释孔（0.1ml肉汤）
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结果判定
以在试管内或小孔内完全抑制细菌生长 的最低药物浓度为MIC（μ g/ml）。微量稀 释法时，常借助于比浊计判别是否细菌生 长。
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临床意义
临床上较为广泛使用的定量耐药性检测 方法。尤其是微量稀释法，已有商品化的 微量稀释板。
菌种的鉴定，并作为医院流行病学调查的 手段之一。
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体外药敏试验的抗菌药物选择： 结合
本单位、本地区常用的抗菌药物 常见病原菌的耐药现状
确定体外药敏试验抗菌药物的品种。
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抑菌试验
（一）.纸片扩散法 K-B纸片琼脂扩散法 :是目前各国临床微生物实验
室广泛采用的标准纸片扩散法。
1）原理 ：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接
抗微生物药物敏感性试验执行标准
出版 CLSI 的文件是作为标准、指南或委员会报告出版的。 标准 已达成共识并明确规定了对材料、方法或实施的具体的、基本的要求，不允许变更使用的文 件。另外，标准也肯定包含有不符合的因素。 指南 已达成共识并叙述了用于一般操作实践、步骤和材料的标准，要求自愿使用的文件。使用者 可以按指南的书面规定使用，也可按需要变更使用。 报告 由董事会发布的尚未经一致评议的文件。
Mary Jane Ferraro, Ph.D.,M.P.H. Jana M.Swenson, M.M.Sc.
M100-S16 ISBN 1-56238-556-9 ISSN 0273-3099
抗微生物药物和敏感性试验
小结
1.培养基 MH 肉汤 2.药物稀释 原液配制 稀释抗菌药物的制备 3.菌种接种 4.结果判断 MIC
（二） 琼脂稀释法
将不同浓度抗菌药物分别混匀于琼脂培 养基中，配制出含各种浓度药物的平板， 使用微量多头接种仪接种细菌，孵育后 观察细菌在含不同浓度药物的平板上的 生长情况，以抑制细菌生长的平板所含 的药物浓度测得最低抑菌浓度（MIC）。
四、E 试验（Epsilometer test）
是一种结合了稀释法和扩散法的原理和特 点测定细菌对抗菌药物的敏感度的定量技 术。
（一）原理
E试条是一条5mm×50mm无孔试剂载体， 一面固定有一系列预先制备的浓度呈连续 指数增长稀释抗菌药物，另一面有读数和 判别的刻度。
抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀 释浓度的宽度范围。
4.挑选18~24h的菌落置M-H肉汤增 菌4~6h。
5.制备0.5麦氏比浊管，然后 1:200稀释，使之最终浓度105 CFU/ml。
6.用微量加样器接种 100μ l菌液到96孔中，盖 上盖板。
同时作阳性、阴性对照。
7.手工看浊度或仪器自动 判读。 按照CLSI标准报告细菌 对某抗菌药物为敏感、 耐药和中介。
量 对某些耐药细菌引起的严重感染，联合用
药比单一用药时效果更好。
2.抗菌药物联合用药可出 现4种结果
无关作用 拮抗作用 累加作用 协同作用
(二)联合抑菌试验
棋盘稀释法
第四节 分枝杆菌的药物敏感性试验
第五节厌氧菌体外药物敏感性试验
从左到右依次为常见菌、苛养菌、厌氧菌、酵母菌和其他霉菌的 E 试验结果
五、联合药物敏感性试验
联合药物敏感试验意义 联合抑菌试验 最低杀菌浓度测定
微生物检验实验室药物敏感性试验标准操作规程
微生物检验实验室药物敏感性试验标准操作规程1．目的规范药物敏感性试验标准操作规程，确保药敏结果准确。
2．原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断的向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
3．试剂M-H培养基、无菌生理盐水、药敏纸片、无菌棉签、35℃孵育箱、标准比浊管或比浊仪。
4．质控4.1 常用细菌药敏质控标准菌株参见CLSI规定。
4.2 质控菌株每日随临床标本一起进行药敏试验，测定质控菌株的抑菌环。
质控菌株的抑菌环在允许范围之内，说明结果可信。
4.3 质控的频率由于纸片法药敏试验是很稳定的，在不失控的时候，可以每周作1～2次质控菌株的测定。
如果发现有失控的情况，就必须每日做1次，寻找失控的原因并予以纠正。
如果连续30日失控<3次的，可以恢复每周1次。
5.操作步骤5.1 挑取4～5个纯培养菌落，接种于3～5ml M-H肉汤（0.5麦氏单位）中，经35℃培养6～8h。
5.2 用无菌生理盐水或M-H肉汤校正菌液浊度，使其与标准比浊管的浓度相同。
5.3 用无菌棉拭蘸取校正过的菌液，在试管壁上挤压几次，压去多余的菌液，涂布整个M-H平板表面，再重复两次，每次旋转平板60°，使整个平板涂布均匀，最后用棉拭涂布平板四周缘一圈。
5.4 涂布菌液的平板于室温中干燥3～5分钟后，用纸片分配器或无菌镊子取药敏纸片，贴于平板表面，并用镊尖轻压一下纸片，使其贴平。
每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm，直径90mm的平板宜贴6张药敏纸片。
5.5 将贴好纸片的平板置35℃孵育18～24小时后，用卡尺量取抑菌圈直径。
个别菌孵育温度，时间及条件应按照CLSI规定。
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药敏试验用抗菌药物的分组
为了防止抗菌药的滥用而造成细菌耐药的发生，
同时也考虑药物的上市情况、抗菌效果、副作用 及其价格，通常将抗菌药的临床应用划分为一、 二、三线 。 一线抗菌药为常用的、价格较便宜 的、已有一定使用时间的有效抗菌药；三线抗菌 药常为新开发的抗生素，效果较好，价格通常亦 较贵；一些效果好而副作用较大的抗菌药，通常 也不放在第一线。
药敏试验用药的选择和分组
3.药物的活性和毒性 全面了解各种抗菌药物的抗菌活性及其不良反应， 权衡利弊，优先选用高效低毒的抗菌药物。 4.药物的价格及其供应情况 从经济学和商业的角度考虑，选用价格便宜，供 应充足的抗菌药物。
药敏试验用药的选择和分组
5.代表药物的正确选择 ⑴分析各种抗菌药物的结构特点、作用机制及其抗菌谱， 对于常见致病菌具有相同作用机制和相同抗菌谱的一类药 （cluster of comparable agents），可选其中一个作 为代表药
抗生素的分类
五、喹诺酮类抗生素（环丙、氧氟、培氟、诺氟沙 星，左氧氟、司帕沙星）
六、大环内酯类抗生素（红霉素、克拉霉素、罗红 霉素、阿齐霉素）
七、四环素、氯霉素和林可酰胺类抗生素（四环素、 米诺环素，氯霉素，克林霉素）
八、糖肽类抗生素（万古霉素、替考拉宁） 九、磺胺类药物及增效剂 十、其他合成抗菌药
（a single strain）流行提供依据。
抗菌药物敏感性试验的指征
1． 必须进行药敏试验的情况
当某些致病菌或条件致病菌的药敏特点不能从其 种属特征上了解时，或其药敏结果易变时，这些 菌的临床分离株必须进行药敏试验。如：肠杆菌 科的细菌、革兰阴性葡萄糖非发酵菌、葡萄球菌 属和肠球菌属的细菌等。
（一）硝基呋喃类（呋喃坦啶） （二）硝基咪唑类（甲硝唑、替硝唑）
第二节 抗菌药物敏感性试验
抗菌药物敏感试验
抗菌药物敏感性试验 （antimicrobial susceptibility test， AST）简称药敏试验，是在体外测定 抗菌药物抑制或杀灭细菌的能力，亦 即是测定细菌对抗菌药物敏感性（或 耐药性）的试验。
抗生素的分类
三、其他ß -内酰胺类抗生素 （一）单环ß -内酰胺类抗生素（氨曲南） （二）头霉素类和氧头孢烯类抗生素（头孢西丁、 头孢替坦） （三）碳青霉素类抗生素（亚胺培南、美洛培南） （四）ß -内酰胺酶抑制剂（克拉维酸、舒巴坦、 他唑巴坦）
四、氨基糖苷类抗生素（链、妥布、庆大、阿米卡 星）（大观霉素、丙大观霉素）
抗菌药物敏感性试验的目的
• 测定细菌对抗菌药物的敏感性，为临床提供有
效抗菌药物的选用信息以控制感染；
• 综合某地区某种属致病菌一定数量群体的药敏
结果，可以了解该地区致病菌的耐药现状，为 临床经验用药提供依据；
• 对新研发的抗菌药物进行药敏分析，评价其抗
菌药效；
• 分析医院感染流行株的药敏谱，为是否是单株
抗微生物药物和敏感性试验
第一节 临床常用抗菌药物
抗菌药物是指具有杀菌或抑菌活性 的抗生素和化学合成药物。
抗生素的分类
一 、青霉素类抗生素 天然青霉素 耐青霉素酶青霉素（甲氧西林、苯唑西林） 广谱青霉素（氨苄、阿莫，替卡、羧苄，派拉西 林）
二、头孢菌素类抗生素 1、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢唑啉 2、头孢呋辛、头孢克洛、头孢羟唑、头孢丙烯 3、头孢噻肟、头孢曲松、头孢唑肟、头孢他啶、 头孢哌酮 4、头孢比肟
抗菌药物敏感性试验的指征
2． 不需要进行药敏试验的情况 ⑴自标本中分离出多种细菌（呈混合生长）,不能区别和确
定致病菌，即分离菌可能系来自环境或人体正常菌群的污 染时，通常不必做药敏试验，以免试验结果误导临床治疗。 ⑵当某致病菌对某抗菌药物高度敏感而从未见有耐药情况报 告时，常规药敏试验可不进行。例如：迄今为止A群和B 群链球菌对所有β－内酰胺类抗生素均高度敏感，因此， 若分离出A群和B群链球菌，不需做青霉素或其他β－内酰 胺类药物的药敏试验，可直接用β－内酰胺类抗生素进行 治疗；如患者对β－内酰胺类过敏，则属例外，可选取大 环内酯（如红霉素）等进行药敏试验。 ⑶分离自正常寄生部位的条件致病菌和非致病菌，不需做药 敏试验。如粪便中分离出的非致病性大肠埃希菌，皮肤上 分离出的微球菌和阴道中分离出的丙酸杆菌。
药敏试验用药的选择和分组
⑵有些类别的药物，其抗菌谱并不密切相关，如氨基糖 苷类就是如此，故氨基糖苷类无代表药，须分别进行药 敏试验。 ⑶有些药物虽非同类药物但属相关药物群（related group of agents），具有极其相似的抗菌谱和相似的 体内过程，在进行药敏试验时，亦可相互代表，任选一 种即可。例如，头孢噻肟、头孢唑肟和头孢曲松在对肠 杆菌科细菌进行药敏试验时，可互相代替
代表药一般为该类药物中抗菌活性最小者。例如：头孢 噻吩是一代头孢的代表药，红霉素是大环内酯类的代表药， 四环素是四环素类的代表药,磺胺异噁唑是所有磺胺类的 代表。如果某菌对代表药敏感，则它对该类药物均敏感， 不会出现假敏感；如果某菌对代表药耐药，它可能对该类 药物中的其他药物敏感。因此，采用代表药以节省药敏试 验工作量的同时可能造成假耐药，故而在某菌对某类代表 药耐药，而临床又无其他类药物可选时，可用该类药物中 的其他药物进一步做药敏试验，例如四环素
2. 本地流行株的耐药谱和耐药趋势 根据本地致病菌的流行病学和耐药性调查结果， 分析哪些种属的细菌常引起感染以及它们的耐药 模式，选取对当地流行株敏感和高效的抗菌药物； 与此同时，还要考虑当地耐药菌的发展趋势以及 抗菌药物诱导耐药菌产生的能力，要尽可能地选 择低（或无）诱导能力的抗菌药，以减少耐药菌 的发生。
药敏试验用药的选择和分组
在设计药敏试验时，实验室的医技人员应和抗感染医师及 药师协作，通过分析研讨，来正确选择试验用抗菌药物。 1. 致病菌的固有耐药特点 固有耐药是指某一种属的细菌由于其结构和生理的特殊性 而对于某种抗菌药物生来就具有的耐药性。若某种属的细 菌对某抗菌药固有耐药，则这些菌的药敏试验就不可选用 该抗菌药物。例如：由于细胞壁的特殊性所有革兰阴性杆 菌对万古霉素均固有耐药，故革兰阴性杆菌的药敏试验不 能选用万古霉素；同样，革兰阳性球菌对氨曲南固有耐药， 故后者不用于革兰阳性菌的药敏试验。