PEI 转染法

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pei质粒转染的原理

pei质粒转染的原理pei质粒转染是一种常用的基因转染方法，用于将外源基因导入到目标细胞中。

本文将从pei质粒转染的原理、优势和应用等方面进行详细介绍。

一、pei质粒转染的原理pei质粒转染是通过聚乙烯亚胺（polyethylenimine，PEI）作为转染剂，将外源基因导入到目标细胞中的一种方法。

PEI是一种阳离子聚合物，具有良好的DNA结合能力和细胞膜穿透性，能够有效地介导基因转染。

pei质粒转染的原理主要可以分为以下几个步骤：1. 形成PEI-DNA复合物：将DNA质粒与PEI按照一定的比例混合，形成PEI-DNA复合物。

PEI能够与DNA形成稳定的复合物，使DNA得到保护并提高其稳定性。

2. 细胞摄取复合物：将PEI-DNA复合物添加到目标细胞培养基中，复合物通过电荷相互作用和细胞表面受体的介导，被目标细胞摄取。

3. 转染效率：PEI-DNA复合物进入细胞后，通过内吞作用进入细胞质，进而释放出DNA。

DNA在细胞质中能够被细胞核摄取，从而实现外源基因的导入。

4. 基因表达：外源基因在细胞核中被转录和翻译，从而使目标细胞表达外源蛋白。

二、pei质粒转染的优势pei质粒转染具有以下几个优势：1. 高效性：pei质粒转染能够实现较高的转染效率，使外源基因能够快速稳定地导入目标细胞。

2. 适用性广：pei质粒转染适用于多种细胞类型，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞等，具有较强的通用性。

3. 无毒性：PEI是一种天然聚合物，相比其他转染剂如病毒载体和化学试剂，具有较低的毒性和免疫原性，对细胞生存和功能影响较小。

4. 稳定性好：PEI-DNA复合物能够保护DNA不受酶降解和环境因素的影响，提高外源基因的稳定性。

三、pei质粒转染的应用pei质粒转染在生物学研究和基因治疗等领域具有广泛的应用。

1. 功能基因研究：pei质粒转染可以用于外源基因的过表达、沉默或敲除等功能研究，帮助研究人员揭示基因在细胞生理和病理过程中的作用机制。

PEI转染技术

PEI法瞬时转染HEK-293F悬浮培养物细胞于37℃，150rpm下，CO2恒温箱中的振荡器平台上悬浮生长。

在进行转染之前，请保持5-7代的培养物，以确保稳定的生长模式。

HEK293悬浮细胞（Freestyle™293-F细胞，Life Technologies，目录号R790-07）于Freestyle™293表达培养基（Life Technologies，货号12338026）中培养。

细胞量应维持在4 x 105和3 x 106细胞/ml之间，体积不超过培养瓶总体积的20％。

最佳旋转速率由每种培养瓶类型和培养量确定。

Life Technologies的Freestyle™293-F细胞在更高的密度和体积下容易结块。

聚乙烯亚胺（PEI）（25 kDa线性PEI，Polysciences，Inc.，目录号23966）在含有25mM HEPES和150mM NaCl（pH 7.5）的缓冲液中以1 mg/ml的浓度制备成母液。

PEI添加到缓冲液，并涡旋振荡，直至完全溶解（这可能需要花费数分钟的涡旋时间）。

一旦完全溶解的PEI可以使用0.22 µM注射器过滤器进行无菌过滤，分装后在-20℃冷冻直至需要。

为了获得最佳的转染效率，细胞在转染时应具有> 95％的活力。

转染前24小时，使细胞分裂增殖至约1 x 106细胞/ml的密度，并在37°C CO2培养箱中振荡过夜。

转染时细胞密度应为约2 x 106细胞/ml。

转染应以2.5 x 106至3.0 x 106细胞/ml的细胞密度进行。

使用血球计数器对细胞计数，并调低足够的体积，以2.5 x 106细胞/ml的密度将细胞重悬在新鲜的293F Freestyle Media中，并以所需的体积进行转染。

转染前将细胞重悬于新鲜培养基至关重要。

条件培养基含有抑制转染的代谢产物。

细胞应在室温下以1200 rpm旋转10分钟。

转染24小时后，将转染产物以1：1稀释，即转染的初始体积是所需最终体积的一半。

pei质粒转染的原理

pei质粒转染的原理
PEI（聚乙烯亚胺）质粒转染的原理主要包括以下几个步骤：
1. PEI与质粒DNA的结合：PEI是一种阳离子聚合物，通过
静电相互作用，可以与质粒DNA形成PEI/DNA复合物。

PEI
的阳离子部分与DNA的阴离子部分结合，形成稳定的复合物。

2. 复合物与细胞的结合：PEI/DNA复合物通过静电相互作用
与细胞表面的负电荷结合。

复合物的阳离子部分与细胞表面的阴离子部分相互吸引，从而使质粒DNA能够与细胞紧密结合。

3. 质粒DNA进入细胞：由于PEI/DNA复合物与细胞膜结合，并且细胞膜是由磷脂双层组成，磷脂双层中的磷脂分子有一部分是带负电荷的。

PEI/DNA复合物与细胞膜结合后，可以引
发细胞膜的变性和破裂，从而使质粒DNA能够进入细胞质。

4. 质粒DNA的释放：一旦质粒DNA进入细胞质，PEI的作用就会逐渐减弱，质粒DNA会被释放出来。

质粒DNA可以进
入细胞核，与细胞的核酸进行相互作用，从而实现外源基因的表达和功能。

需要注意的是，PEI质粒转染虽然简单易行，但由于PEI会引
发细胞毒性反应，因此在实验过程中需要控制PEI的浓度和转染时间，以最小化对细胞的伤害。

此外，PEI转染的转染效率
一般较低，因此在许多情况下，需要通过如改变PEI与DNA
的比例、优化细胞培养条件等方法来提高转染效率。

转染实际PEI(Polyethylenimine)的配置

配制1mg/ml的PEI储液
1.PEI(Polyethylenimine)来自于Polyscience.
2.用水溶解粉末，用氢氧化钠NaOH调节pH至7.0（待溶液变澄清后才能进行调节，最后
10ul的加，由于PEI缓冲能力比较弱，此步需要特别谨慎，切不可调过）。

溶解可能需要用几小时（实际却是很容易溶解），建议每次配100ml，这样可能比较好溶解。

3.定容，使的终浓度为1mg/ml。

4.0.22um滤膜过滤。

必不可少：除菌，除去不溶解的PEI
5.分装成0.2-1ml，储存于-80℃，一旦溶解，工作液存放在4℃，可以保存数月，两个月
之后，需要密切注意转染效率，如果转染效率下降，弃去并拿一管新的。

6.为进一步优化PEI的转染效率，可以初期经行探索，建议DNA/PEI（1:1,1:2,1:3），选择最
佳比例进行后期实验。

线性 PEI MAX 40K 转染说明书

线性PEI MAX40K转染说明书化学名：线性聚乙烯亚胺，线性PEI，聚乙烯亚胺，线性，MW40000，转染级订货号＃：49553-93-7规格：1g品牌：BIOHUB CAS＃：49553-93-7分子量：40,000（~22,000自由基）溶于：水不溶于：常用有机溶剂（乙醇，丙酮，四氢呋喃）外观：白色至灰白色自由流动的固体处理：手套和通风橱储存：在室温下避光干燥储存PEI MAX40K（在游离碱中也称为PEI22K）是一种功能强大，值得信赖且经济实惠的瞬时转染试剂。

在HEK293和CHO大多数表达系统中，PEI MAX都能提供稳定的高表达（96孔板至100L生物反应器）。

现在每年有更多的研究人员和公司来使用PEI MAX进行细胞转染，因为相对于大多数转染试剂而言PEI MAX既能等到稳定的高表达又能使转染成本降低最少40%。

PEI MAX比更PEI25K易于使用，并且比PEI25K有更高的转染效率，通常PEI25K转染过程通常需要几个小时才能完成准备，而PEI MAX40K可在两小时内完成整个转染过程。

另外，PEI25K含有4-11％的残留丙酰基，这可能阻碍聚合物主链与DNA的有效结合，而PEI MAX40K的丙酰基完全脱落，意味着PEI MAX每批产品的性能更加稳定。

PEI25K（KE1075）和PEI MAX40K（KE1098）的比较配置：1：称取100mg PEI MAX，加新鲜的细胞级别的水90ml，搅拌溶解。

2：调整pH值至7.0，定容至100ml，用0.22um的滤器过滤，分装后储存于4℃，保质期可以达到12个月。

转染操作流程：◆瞬时转染方法1.接种细胞：转染前一天，用胶原酶（WORTHINGTONG公司LS004196)消化细胞并计数（不建议用胰酶）。

调整细胞浓度，将细胞铺入细胞培养的器皿，每个孔置入的细胞量应能使转染时细胞汇合度达到70~80%。

2.准备DNA-PEI复合物：DNA、PEI试剂和稀释剂在进行以下步骤前需先使其升至室温。

PEI细胞转染液使用方法(标准版)

PEI细胞转染液是一种广泛应用于实验室的转染试剂，用于将外源DNA或RNA 转染到细胞中。

以下为PEI细胞转染液的标准使用方法：一、准备工作1. 细胞：选择合适的细胞类型，如HEK293、CHO等。

确保细胞状态良好，密度适中。

2. 转染试剂：PEI细胞转染液。

3. 外源DNA或RNA：需转染的基因或表达载体。

4. 实验器材：离心机、显微镜、培养皿、移液器等。

二、操作步骤1. 细胞培养：将细胞接种于适当的培养皿中，用含适当抗生素的培养基培养细胞。

将培养皿放入37℃、5% CO₂的培养箱中，进行细胞培养。

2. 转染液制备：根据实验要求，将PEI细胞转染液按照一定比例稀释。

一般情况下，可以使用10倍稀释的PEI细胞转染液。

3. 转染操作：（1）将稀释后的PEI细胞转染液与外源DNA或RNA混合均匀。

（2）用移液器将混合液滴加到细胞培养皿中，注意不要直接将液体倒在细胞上，以免破坏细胞。

（3）将培养皿轻轻摇晃，使转染液与细胞充分接触。

然后将培养皿放入培养箱中，继续培养。

4. 转染后处理：转染后的细胞需要继续培养，观察转染效果。

根据实验要求，可使用荧光显微镜、实时定量PCR等方法检测转染效果。

三、注意事项1. 操作过程中，应确保实验器材干净无菌，避免污染。

2. 转染过程中，应控制转染液的浓度和滴加速度，避免对细胞造成过度刺激。

3. 转染后，注意观察细胞状态，如出现异常情况，应立即处理。

4. 实验过程中，应遵循实验室安全规定，确保人身安全。

以上为PEI细胞转染液的标准使用方法。

实际操作过程中，可能因实验条件、细胞类型等因素而有所调整。

在实际应用中，请根据具体情况进行操作。

聚乙烯亚胺转染剂的制备

聚乙烯亚胺转染剂的制备一、前言聚乙烯亚胺（PEI）是一种常用的转染剂，被广泛应用于基因转染、蛋白质转染等领域。

其优点包括高效、可逆性强、不毒性等。

本文将详细介绍聚乙烯亚胺转染剂的制备方法。

二、材料与设备1. 聚乙烯亚胺（PEI）2. 无水乙醇3. 磷酸盐缓冲液（PBS）4. 甲酸5. N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS）6. 1-乙氧羰基-3-(3-二甲氨基丙基)卡巴泊烷（EDC）7. 离心管8. 磁力搅拌器9. 紫外可见分光光度计三、制备方法1. PEI的溶解将PEI加入无水乙醇中，使用磁力搅拌器在室温下搅拌至完全溶解。

此时可以根据需要调整浓度。

2. 活化NHS与EDC将NHS和EDC加入PBS中，使用磁力搅拌器在室温下搅拌至完全溶解。

此时可以根据需要调整浓度。

3. 聚合反应将活化的NHS和EDC缓慢加入PEI溶液中，使用磁力搅拌器在室温下搅拌反应2小时。

反应结束后，离心沉淀，用PBS洗涤去除未反应的NHS和EDC。

4. 甲酸处理将沉淀物加入甲酸中，使用磁力搅拌器在室温下搅拌30分钟。

此步骤可以去除PEI中的杂质。

5. 洗涤与干燥将沉淀物用PBS洗涤3次，离心干燥即可得到PEI转染剂。

四、注意事项1. PEI转染剂制备过程中要注意无菌操作。

2. 制备过程中要避免暴露于光线下，以免影响反应结果。

3. 制备过程中要注意安全，避免接触到有毒或刺激性物质。

4. 制备完成后要储存在冰箱内保存。

五、结论本文详细介绍了聚乙烯亚胺转染剂的制备方法。

通过以上步骤，可以得到高纯度、高效的PEI转染剂，为基因转染、蛋白质转染等领域的研究提供了重要的支持。

PEI纳米颗粒基因转染技术方法

PEI纳米颗粒基因转染技术方法首先是PEI纳米颗粒的制备。

PEI是一种有机阳离子聚合物，在水中具有较高的阳电荷密度。

PEI纳米颗粒的制备可以通过简单的混合PEI和DNA溶液的方法进行。

其中，PEI溶液需要调节pH值和浓度以实现最佳的转染效率。

制备好的PEI纳米颗粒通常具有较小的粒径和正电荷表面。

接下来是DNA载体的包裹。

将需要转染的基因载体DNA与PEI纳米颗粒进行混合，使DNA能够被PEI包裹。

这样可以保护DNA不被降解，同时也可以提高基因的转染效率。

包裹过程主要是通过静电相互作用和疏水相互作用完成。

较小的PEI纳米颗粒和较长的PEI链段在包裹DNA过程中起到了减缓荷电面间排斥和增加静电相互作用的作用，提高了包裹效率。

然后是转染细胞。

将包裹好的DNA-PEI纳米颗粒复合物加入到目标细胞中，使得基因能够进入目标细胞内。

PEI纳米颗粒具有阳离子表面电荷，可以与细胞膜上的阴离子磷酸基团结合。

这种吸附作用使得DNA-PEI纳米颗粒能够与细胞膜紧密结合，并进入细胞内。

最后是基因转染效率的评价。

基因转染效率的评价可以通过检测转染细胞中的报告基因表达水平来进行。

常用的方法包括荧光显微镜观察、流式细胞术和蛋白质检测。

通过定量分析报告基因的表达水平，可以评估PEI纳米颗粒基因转染技术的转染效果。

PEI纳米颗粒基因转染技术的原理主要是通过PEI纳米颗粒与DNA的静电相互作用和疏水相互作用来包裹DNA，并利用PEI纳米颗粒的阳电荷与细胞膜的阴电荷结合，使得DNA能够进入细胞内。

PEI纳米颗粒具有较小的粒径、高正电荷密度、良好的生物相容性和易于制备的优点，被广泛应用于基因转染研究和生物医学领域。

综上所述，PEI纳米颗粒基因转染技术是一种重要的基因传递方法，具有较高的转染效率和良好的生物相容性，可应用于基因治疗和基因功能研究等领域。

PEI转染细胞方法的标准操作规程

PEI转染细胞方法的标准操作规程（编号：031）1、目的及适用范围该SOP用来规范利用PEI为转染试剂进行转染的操作。

2、主要仪器细胞培养箱、细胞培养皿、微量移液器3、试剂及配制方法3.1 PEI (2μg/μL)：采用生理盐水配成2μg/μL，60℃烘箱助溶，完全溶解并冷却后，调pH至7.0（不可回调），0.22μm微孔滤器过滤，分装于1.5mL离心管，储存与4℃备用。

3.2生理盐水：0.9g NaCl溶于100mL纯水中，灭菌后微孔滤器过滤分装于1.5mL离心管，储存于4℃备用。

4、操作步骤4.1 细胞铺于细胞培养皿中，培养过夜；4.2 在转染前1-2h，将细胞培养皿中换成预热的培养基；4.3 将要转染的质粒和转染试剂PEI分别用生理盐水稀释，室温处理5min。

质粒和转染试剂的质量比为1:6；一般质粒和PEI稀释后的每管体积为50μL，如转染的质粒量多，则可对应适当增加生理盐水的量；4.4 将处理好的两者混匀，室温放置15-30 min；4.5 将处理好的样品轻轻且均匀滴加到细胞中；4.6 转染后6-8 h换液；4.7 根据实验需要，在转染后的特定时间收集样品，进行分析。

5、注意事项5.1 细胞如何健康而茁壮成长转染前细胞最好经过1～2次传代，以保证细胞生长旺盛，容易转染。

注意，贴壁细胞生长到几乎汇片时就要赶快进行下一次传代，千万不要使细胞保持融合超过24h，一旦长满了，转染效率便会降低。

大多数已建立的细胞系都是非整倍体，细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化，这会导致和转染相关的细胞行为的变化。

如果随时间发生61。

pei转染原理

pei转染原理转染原理是指在实验室中将外源DNA或RNA转移到细胞内的过程，是基因工程和分子生物学研究中非常重要的步骤。

在转染过程中，外源基因可以被稳定地整合到宿主细胞的基因组中，从而实现对基因表达的调控和研究。

本文将介绍转染原理的基本概念、常用的转染方法以及转染的影响因素。

首先，转染原理的基本概念是指将外源核酸（DNA或RNA）引入目标细胞内，并使其稳定地表达。

转染可以通过多种方式实现，包括化学法、生物法和物理法。

化学法主要是利用化学试剂（如离子聚合物、脂质体等）将外源核酸转移到细胞内；生物法则是利用病毒等生物体外源基因载体将外源基因转移到细胞内；物理法则是利用物理手段（如电穿孔、基因枪等）将外源基因引入细胞内。

这些方法各有特点，可以根据实验需要选择合适的转染方法。

其次，常用的转染方法包括石墨烯转染、脂质体转染、电穿孔转染等。

石墨烯转染是指利用石墨烯纳米片作为载体，通过静电作用将外源基因转移到细胞内。

石墨烯具有良好的生物相容性和高载荷能力，能够有效地将外源基因引入细胞内。

脂质体转染则是利用脂质体作为转染载体，通过与细胞膜融合将外源基因引入细胞内。

电穿孔转染则是利用电脉冲将外源基因引入细胞内，通过瞬时破坏细胞膜的完整性，使外源基因进入细胞内。

另外，影响转染效率的因素有很多，包括细胞状态、转染载体的选择、转染条件等。

细胞状态是指细胞的生长状态和分化程度，细胞状态良好时转染效率会更高。

转染载体的选择也非常重要，不同的载体对不同类型的细胞有不同的转染效果。

此外，转染条件如转染时间、转染温度、转染浓度等也会影响转染效率，需要根据实验需求进行合理的调整。

总之，转染原理是基因工程和分子生物学研究中非常重要的步骤，通过转染可以实现对基因的调控和研究。

在实验中选择合适的转染方法和条件，可以提高转染效率，从而更好地实现实验目的。

希望本文对转染原理有所帮助，谢谢阅读！。

pei转染原理

pei转染原理
pei转染原理的核心是靠聚乙烯亚胺（PEI）这种阳离子聚合物来实现的。

PEI
是一种常用的转染试剂，它具有良好的转染效率和较低的细胞毒性，因此在PCR
技术中得到了广泛的应用。

PEI转染的原理主要包括以下几个步骤，首先，PEI与DNA片段形成复合物；
其次，复合物与细胞膜发生相互作用；最后，复合物进入细胞内并释放DNA片段。

这一过程主要依赖于PEI的阳离子性质和细胞膜的负电荷特性。

PEI的阳离子能够
与DNA的磷酸根结合形成复合物，从而保护DNA片段不被降解。

同时，细胞膜
的负电荷能够与PEI的阳离子形成静电作用，促使复合物与细胞膜结合并进入细胞内。

最后，由于细胞内环境的pH值较低，PEI与DNA的结合会发生解离，释放出DNA片段。

PEI转染原理的关键在于PEI与DNA的复合物能够有效地进入细胞内，从而
实现DNA片段的表达或复制。

PEI转染的优点是转染效率高，适用于多种类型的
细胞，而且操作简单，无需特殊的设备和技术。

因此，PEI转染在PCR技术中得
到了广泛的应用，并在基因治疗、基因敲除等领域也有着重要的意义。

总之，PEI转染原理是PCR技术成功的关键之一，它通过PEI与DNA的复合
物进入细胞内，实现了DNA片段的表达或复制。

PEI转染具有转染效率高、操作
简单等优点，因此在PCR技术以及其他领域得到了广泛的应用。

希望通过本文的
介绍，能够更加深入地了解PEI转染原理，为相关研究和实践提供帮助。

pei质粒转染的原理

pei质粒转染的原理pei质粒转染是一种常用的分子生物学技术，用于将外源DNA导入到目标细胞中。

本文将介绍pei质粒转染的原理及相关应用。

pei质粒转染是一种非病毒介导的转染方法，其中pei是一种阳离子聚合物。

pei质粒转染的原理基于pei与DNA的相互作用，通过形成复合物将DNA导入到细胞内。

pei与DNA以正电荷静电相互作用，形成质粒复合物。

pei的阳离子部分与DNA的磷酸根部分结合，形成稳定的复合物。

这种相互作用主要是靠静电吸引力和氢键相互作用来维持的。

pei质粒复合物与细胞膜相互作用。

pei的阳离子部分可以与细胞膜上的负电荷相互作用，使复合物与细胞膜结合。

这种结合可以通过电荷相互作用、氢键和疏水作用来实现。

pei质粒复合物进入细胞内部。

复合物与细胞膜发生相互作用后，可以通过胞吞作用或融合作用将复合物转运到细胞质中。

在细胞质中，复合物被释放并进入细胞核。

pei质粒转染具有许多优点。

首先，pei是一种天然的阳离子聚合物，对细胞和DNA具有较低的毒性。

其次，pei质粒转染方法简单易行，不需要复杂的设备和操作。

第三，pei质粒转染适用于多种细胞类型，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞和细菌等。

pei质粒转染在生物医学研究中有广泛的应用。

首先，pei质粒转染可用于基因转染和表达。

研究人员可以将感兴趣的基因克隆到质粒中，然后通过pei质粒转染将其导入到细胞中，使目标基因在细胞中表达。

这种方法可以用于基因功能研究、基因治疗和药物筛选等领域。

pei质粒转染还可以用于靶向基因编辑。

通过将CRISPR-Cas9系统相关基因导入到细胞中，可以实现对细胞基因组的特定编辑。

这种方法在基因组编辑、疾病模型构建和基因治疗等领域具有重要应用价值。

pei质粒转染还可以用于RNA干扰（RNAi）研究。

研究人员可以将siRNA或shRNA导入到细胞中，通过靶向特定基因的mRNA 来实现基因沉默。

这种方法可以用于研究基因功能、筛选靶向基因的药物和调控基因表达等。

PEI瞬时转染方法

5．PBS 配制方法
800ml 蒸馏水中溶解 8g NaCl, 0.2g KCl, 3.63g Na2HPO4. 12H2O(或 1.44g Na2HPO4) 和 0.24g KH2PO4, 用 HCl 调节溶液 pH 至 7.4 加水定容至 1L，高压灭菌 20 分钟，保存于室温。（见“分子克隆实验指南” 第二版 P927）
悬浮细胞转染
为了提高转染效率可以首先使用低细胞培养液总体积（见表 1 细胞培养液总体积的下限或更低一些），转染 2-3 h 小时后补加一倍的含血清细胞培液。以 24 孔板转染为例，具体为以细胞培养液总体积的下限（500μl ）接种细胞 2 小时后，加入同样方法制备的 100 μl GenEscortTMⅠ /DNA 复合物，轻轻摇动使均匀混合，转染 2 h 小时后补加含血清细胞培液至总体积 1 ml，继续培养至 24-48 小时后，分析报告基因转染效率。
4．GenEscortTMⅠ 的用量
在体外细胞转染试验中，对于接种细胞密度在 60%-90% 之间的实验样本，可通过预试验在 GenEscortTMⅠ（μl）∶DNA（μg）= 2∶1 － 6∶1 之间选择最佳的比例。对大多数细胞 GenEscortTMⅠ（μl）∶DNA（μg）的推荐比例为 2∶1。
和 siRNA 运送。也能用于体内的动物实验。
GenEscortTMI 与传统的脂质体相比无论在转染效果和实验操作上都有明显的优势，主要
表现为：
z
经济实惠，适用于大多数常用的贴壁细胞系。
z
转染效率高，细胞毒性低。
z
使用较少的 DNA 量即可获得高的转染效率。
z
培养基可含或不含血清，可以用 PBS 或不含血清的培养基稀释 DNA 进行转染，转

PEI纳米颗粒基因转染技术方法.

PEI纳米颗粒基因转染技术方法发布日期:2008-1-8 热门指数:2417ABSTRACTThis protocol describes the preparation of polyethylenimine (PEI)/DNA nanoparticles for targeted gene delivery. This delivery strategy improves the efficiency of gene transfer by enhancing the entry of gene vectors into the desired cells and reducing uptake by nontarget cells. We describe here methods for the conjugation of targeting peptides to PEIs, formation of DNA complexes using the conjugated PEIs or nonconjugated PEIs together with targeting peptides, and cell transfection using these complexes. The conjugation step involves the use of the succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), a heterobifunctional cross-linker, to form a stable bond between PEI and peptides containingthiol groups.MATERIALSReagents∙∙oo o o o ∙Dc protein assay kitDMEM cell culture medium with 10% fetal bovine serum (FBS)DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)100 units/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin2 mM glutamine10% fetal bovine serum (FBS)Exponentially growing mammalian cells∙∙∙∙∙Lithium chlorideLuciferase assay reagentsDimethylsulfoxide (DMSO)OptiMEM serum-free cell culture mediumPEI polymers (MW 600-1000 kDa, Fluka; MW 750 kDa, 25 kDa, 2 kDa, and 800 Da, Sigma-Aldrich; MW 1.2, 10, or 70 kDa, Polysciences)∙ Peptides, prepared using conventional solid-phase, chemical synthesis method∙oPhosphate buffered saline (PBS)137 mM NaClo o o2.7 mM KCl 10 mM Na2HPO4 2 mM KH2PO4To prepare 1 liter of PBS(Phosphate-buffered Saline), dissolve 8 g of NaCl, 0.2 g of KCl, 1.44 g of Na2HPO4, and 0.24 g of KH2PO4 in 800 ml of distilled H2O. Adjust the pH to 7.4 (or 7.2 if required) with HCl. Add H2O to 1 liter. Dispense the solution into aliquots and sterilize them by autoclaving for 20 minutes at 15 psi (1.05 kg/cm) on liquid cycle or by filter sterilization. Store the buffer at room temperature. If necessary, PBS may be supplemented with 1 mM CaCl2 and 0.5 mM MgCl2. Can bemade as a 10x stock.∙∙∙Plasmid DNA encoding the luciferase reporter geneReporter Lysis Buffer, 5X (Promega), dilute to 1X in PBSSuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC)∙ Water, ultrapure sterilized Equipment∙ Dialysis membranes (molecular weight size exclusion specification for purification of sidereaction and excess products)∙∙∙∙∙Freeze dryerLuminometerMagnetic stirrer and magnetic rodReaction vesselTissue culture vesselsMETHODActivation of PEI with a cross-linker1.Prepare a SMCC stock solution of 50 mM in DMSO. SMCC is moisture sensitive. The stocksolution should be prepared using high-quality anhydrous DMSO in a dry nitrogen atmosphere. When stored at 4°C, the SMCC solution remains stable for ~3 months. Steps 1-10 should be performed in achemical fume hood following chemical safe handling procedures.2.Prepare a 10 mg/ml stock solution of PEI in DMSO. Add 2-5 mg of lithium chloride to increasethe solubility of PEI.3. Using a syringe, slowly add the SMCC solution into the PEI solution. Incubate the reaction for2 hours at room temperature. The amount of SMCC solution added should be based on the desiredmolar ratio between SMCC to PEI.4. Purify the modified PEI by dialysis against ultrapure water for 2 days, changing the water atleast five times a day.5. Collect the solution in a dialysis tube and freeze dry the sample.Conjugation of peptide to activated PEI6.7.8. Prepare a peptide stock solution of 20-50 mM in PBS. Prepare a 10 mg/ml stock solution of the activated PEI (Step 5) in PBS. Slowly add the peptide solution to the activated PEI solution. Incubate the conjugationreaction for 24 hours at room temperature.The amount of the peptide added to the reaction should be based on the desired molar ratio in the finalconjugate.9. Purify the peptide-conjugated PEI by dialysis against ultrapure water for 2 days, changing thewater at least five times a day.10. Collect the solution into a dialysis tube and freeze dry the sample.Preparation of PEI/DNA complexes11.i.ii.iii. Prepare the stock solutions. Prepare a 1 mg/ml plasmid DNA stock solution in ultrapure water. Prepare a stock solution of PEI (Step 5) or peptide-conjugated PEI (Step 10) to contain 10 nmol amino nitrogen per microliter in ultrapure water (pH 7.2). For ternary complexes, prepare a 5-mg/ml stock solution of a targeting peptidelinked with a DNA-binding sequence in ultrapure water.Steps 11-22 should be performed under aseptic conditions using sterile reagents. Manipulation of thecomplexes should be performed at room temperature in a horizontal flow hood.12.i.. Prepare the working solutions. Dilute 1 µg of plasmid DNA (for transfection of cells seeded in a well of a 24-well plate) in 50 µl of OptiMEM serum-free cell culture medium. Dilute the appropriate quantity of PEI or peptide-conjugated PEI in 50 µl of OptiMEMserum-free cell culture medium.ii. For ternary complexes, dilute the appropriate quantity of the targeting peptide in 50 µl of OptiMEM serum-free cell culture medium.13. Add the peptide-conjugated PEI solution dropwise into the DNA solution while vortexing. Or,for ternary complexes, add the targeting peptide dropwise into the DNA solution while vortexing.14. Incubate the mixture for 30 minutes at room temperature. The peptide-conjugated PEI/DNAcomplexes may now be used directly for transfection (Step 16)15. To form ternary complexes, add the PEI solution dropwise into the targeting peptide/DNAcomplexes while vortexing. Incubate the ternary complexes for 30 minutes at room temperature.The ternary complexes may now be used directly for transfection (Step 16) Transfection assay16. One day before transfection, harvest mammalian cells, grown in DMEM complete cell culturemedium with 10% FBS by trypsinization, and replate them into 24-well plates at a density of 50,000cells/well. Incubate the cultures for 24 hours at 37°C in a humidified incubator with 5% CO2.17.18. Remove the medium from the wells and wash the cells twice with PBS (prewarmed to 37°C). Add the following to the cells, and incubate them for 4 hours at 37°C in a humidified incubatorwith 5% CO2. 100-150 µl/well of OptiMEM serum-free cell culture medium 100-150 µl/well of the genetransfection complex containing 1 µg of plasmid DNA (Step 14 or Step 15)19. Remove the transfection solution, wash the cells twice with PBS (prewarmed to 37°C) andadd 1 ml/well of DMEM complete cell culture medium with 10% FBS. Incubate the cells for 24-48hours.20. To assay for luciferase expression, lyse the cells by adding 100 µl/well of 1X Reporter LysisBuffer (dilute 5X stock solution with PBS).21. To detect luciferase activity, add 20 µl of cell lysate to 100 µl of luciferase assay reagent.Measure luciferase activity with a luminometer.22. To normalize the luciferase activity, determine the protein concentrations of the cell lysatesusing the Dc protein assay kit.ACKNOWLEDGMENTSThe work was funded by the Institute of Bioengineering and Nanotechnology, the Agency for Science,Technology and Research (A* STAR) in Singapore.Anyone using the procedures in this protocol does so at their own risk. Cold Spring Harbor Laboratory makes norepresentations or warranties with respect to the material set forth in this protocol and has no liability in connection with the use of these materials. Materials used in this protocol may be considered hazardous and should be used with caution. For a full listing of cautions regarding these material, please consult:Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA, A Laboratory Manual, edited by Theodore Friedmann and JohnRossi, © 2007 by Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, p. 473-478。

阳离子聚合物pei转染原理

阳离子聚合物pei转染原理
阳离子聚合物PEI转染是一种常用的基因转染技术，在基因治疗、细胞分子生物学研究等领域广泛应用。

其转染原理是利用阳离子聚合物PEI的阳离子性质与DNA的阴离子性质形成复合物，从而实现DNA 的有效转染进入细胞内。

PEI分子的氮原子上带正电荷，可以与DNA分子上的磷酸根结合形成强烈的electrostatic interactions（静电作用力）。

同时，PEI 分子的大分子量和高度分支状结构，使其可以与DNA分子形成稳定的复合物，从而保护DNA分子免受核酸酶的降解。

PEI/DNA复合物内部具有高度阳离子性，可以与细胞膜上的负电荷形成吸附作用，促进复合物的粘附和进入细胞。

此外，PEI分子还具有膜破坏性，能够破坏细胞膜结构，从而增加复合物进入细胞的效率。

总之，阳离子聚合物PEI转染通过形成稳定的复合物，利用其阳离子性质与DNA的阴离子性质相互吸引，实现DNA的高效转染进入细胞内，从而实现基因治疗和细胞分子生物学研究等领域的研究目的。

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PEI瞬时转染方法

匀后，再加入 20µl GenEscortTMⅠ 混匀，室温放置 10-15 min，获得 50 µl 转染复合物。
（3）瘤体局部消毒后，将前述的 50µl 转染复合物直接注射到小鼠肿瘤内。
（4）动物继续饲养，如需要多次给药，则转染方法按 (2), (3) 进行。定期用游标卡尺测量
移植瘤直径，计算肿瘤体积。
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高通量系统实验步骤 (在 96-孔板上的转染)：
转染复合物的制备
• 对每孔, 在 EP 管中将 200 ng DNA 稀释于 15 µl PBS 中, 轻轻混匀。 • 对每孔, 在 EP 管中将 0.4 µl 的 GenEscortTMⅠ 溶液稀释于 15 µl PBS 中, 轻轻混匀。 • 将 15 µl GenEscortTMⅠ 稀释液加到 15 µl DNA 稀释液中，轻轻混匀。注意: 两种溶液的混合顺序对转染结果非常重要，切勿颠倒滴加顺序。 • 轻轻振荡混匀后，室温下静止 10-15 分钟后，立刻加入到每孔中。
每孔转染复合物溶液的用量
(µl) 30 50 100 100
200
200
500 1000 2000
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pei转染原理

pei转染原理首先，我们来了解一下pei是什么。

PEI是聚乙烯亚胺（polyethylenimine）的缩写，是一种阳离子聚合物，具有良好的DNA或RNA结合能力和细胞内转染效率。

pei转染原理主要是通过pei与DNA或RNA形成复合物，然后与细胞膜结合，最终将DNA或RNA导入细胞内。

pei转染原理的关键步骤包括复合物形成、细胞内摄入和释放。

首先，pei与DNA或RNA形成复合物，这一过程主要是通过静电作用和氢键相互作用来实现的。

复合物形成后，pei能够与细胞膜结合，并被细胞摄入。

在细胞内，复合物会通过一系列的内吞作用进入细胞质，然后释放出DNA或RNA分子。

这些外源分子在细胞内会参与到基因表达、蛋白质合成等生物学过程中。

pei转染原理的优点之一是其高效性。

相比于其他转染试剂，pei具有较高的转染效率，能够有效地将DNA或RNA导入细胞内。

此外，pei转染还具有较低的细胞毒性，对细胞的影响相对较小，有利于细胞的存活和稳定转染。

除此之外，pei转染原理还具有较好的适用性。

不同类型的细胞对pei转染都具有较好的响应，因此在不同的细胞系中都能够实现高效的转染效果。

这为研究人员在细胞水平上开展基因功能研究、蛋白质表达调控等方面的工作提供了有力支持。

需要注意的是，在进行pei转染实验时，研究人员需要根据具体的实验目的和细胞类型选择合适的pei/DNA或RNA比例、转染时间和条件等参数，以确保转染效果的最大化。

总的来说，pei转染原理是一种简单、高效、适用性广泛的转染技术，为基因工程、细胞治疗等领域的研究提供了重要的工具和支持。

通过深入了解pei转染原理，研究人员可以更好地利用这一技术手段开展相关领域的研究工作，推动科学技术的发展和应用。

PEI转染法

PEI转染法PEI 转染法材料：质粒DNA指数生长的真核细胞PEI （聚乙烯亚胺）1×HBS （pH7.4）配方：PEI 储存液（100 μM）：称取125 mg PEI 粉末溶解于50 ml 1×HBS （pH7.4）中，0.2 μm 滤膜过滤，储存于4℃备用。

1×HBS （pH7.4）：将8.76 g NaCl 溶解于900 ml 超纯水，加入20 ml 1 M 的HEPES，调pH 值到7.4，定容至1 L，过滤（0.2 μm 滤膜）后储存于4℃备用。

方法：1．细胞分盘：通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以4×105 至8×105细胞/cm2 的密度平铺细胞于60 mm 组织培养皿上（根据实验需要选择培养皿，使细胞贴壁后所占总面积达到培养皿面积的70-90％）。

根据细胞贴壁情况于含5％ CO2 的37℃温箱中孵育8-24 h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。

转染前换入2 mL 预热的无血清培养基。

2. 制备PEI-DNA 混合物：以60 mm 组织培养皿用420 μL 反应总体积为例。

准备两支1.5 mL 离心管，一管将质粒DNA（总量2-8 μg 为佳）加入240 μL HBS 中，混匀。

另一管中则用HBS 将100 μM 的PEI 储存液稀释成10 μM，充分混合。

然后取180 μL 10 μM PEI 溶液加入含有DNA 的HBS 中，充分混匀后室温静置20-30 min。

最后将这420 μL 的PEI-DNA 混合液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀，置于含5％～7％ CO2的37℃温箱孵育。

注：每次用100 μM 的PEI 储存液前都需要先将其充分混匀，保证所取的浓度一致。

3. 培养6-10 h 后更换为37℃预热的含有血清的培养基，继续培养，16 h 左右可以观测到报告基因的表达。