核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶活性的测定

核酮糖－1，5－二磷酸羧化酶（ribulose－1，5－bisphosphatecarboxylase，RuBPCase）是光合作用碳代谢中的重要的调节酶，是植物中最丰富的蛋白质，主要存在于叶绿体的可溶部分，总量约占叶绿体可溶蛋白50％～60％。本实验用分光光度法测定酶的羧化能力。

一、原理：在RuBPCase的催化下，1分子的核酮糖－1，5－二磷酸（RuBP）与1分子的CO2结合，产生2分子的3－磷酸甘油酸（PGA），PGA可通过外加的3－磷酸甘油酸激酶和甘油醛－3－磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛－3－磷酸，并使还原型辅酶I（NADH）氧化.因此，由辅酶I氧化的量就可计算RuBPCase的活性，由340nm吸光度的变化可计算还原型辅酶I氧化的量。为了使NADH的氧化与CO2的固定同步，从而需要加入磷酸肌酸（Cr～P）和磷酸肌酸激酶的ATP再生系统。ADP＋Cr～P磷酸肌酸激酶ATP＋Cr

二、材料、仪器设备

（一）材料：菠菜叶片、小麦及水稻叶片。

（二）仪器设备：1. 紫外分光光度计；2. 冷冻离心机，3. 匀浆器；4. 移液管；5. 秒表。（三）试剂：1. 5mmol／LNADH；2. 25mmol/L RuBP；3. 0.2mol/L NaHCO3；4. RuBPCase提取介质：40mmol/L（pH7.6）Tris－HCl缓冲溶液，内含10mmol/L MgCl2、0.25mmol/L EDTA、5mmol/L 谷胱甘肽；5. 反应介质：100mmol/L Tris－HCl缓冲液，内含12mmol/L MgCl2和0.4mmol/L EDTA-Na2，pH7.8；6. 160u/ml 磷酸肌酸激酶溶液；7. 160u/ml 甘油醛－3－磷酸脱氢酶溶液；8. 50mmol/L ATP；9. 50mmol/L 磷酸肌酸；10. 160u/ml 磷酸甘油酸激酶溶液；11. 菠菜的RuBPCase提取液。

三、实验步骤

1. 酶粗提液的制备取新鲜菠菜叶片10g，洗净擦干，放匀浆器中，加入10ml预冷的提取介质，高速匀浆30S，停30S，交替进行3次；匀浆经4层纱布过滤，滤液于20000×g 4℃下离心15min，弃沉淀；上清液即酶粗提液，置0℃保存备用。

2. RuBPCase活力测定按下表配制酶反应体系

3. 反应介质

4. 将配制好的反应体系摇匀，倒入比色杯内，以蒸馏水为空白，在紫外分光光度计上340nm 处反应体系的吸光度作为零点值。将0.1mlRuBP加于比色杯内，并马上计时，每隔30S测一次吸光度，共测3min。以零点到第1min内吸光度下降的绝对值计算酶活力。由于酶提取液中可能存在PGA，会使酶活力测定产生误差，因此除上述测定外还需做一个不加RuBP的对照。对照的反应体系与上述酶反应体系完全相同，不同之处只是把酶提取液放在最后加，加后马上测定此反应体系在340nm处的吸光度，并记录前1min内吸光度的变化量，计算酶活力时应减去这一变化量。

四、结果计算

RuBPCase的酶活力（μmol/ml酶液/min）＝ΔA×N×10/(6.22×2dΔt)式中：ΔA－反应最初1min 内340nm处吸光度变化的绝对值（减去对照液最初1min的变化量）；酶活力为每min每ml酶液固定CO2μmol数；N－稀释倍数 6.22－每μmolNADH在340nm处的吸光系数；2－表示每固定1molCO2有2molNADH被氧化；Δt－测定时间为1min d－比色光程（cm）。