基因打靶与RNA干扰技术在丝状真菌基因功能组学研究中的应用
RNA干扰技术在生物学研究中的应用研究进展
RNA干扰技术在生物学研究中的应用研究进展RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术是目前分子生物学领域中最具有影响力的生物技术之一，它充分利用了RNA分子的本身的功能和特性，实现了基因沉默和特定蛋白表达的调节。
RNAi技术一方面广泛应用于疾病治疗、基因功能解析，另一方面也广泛应用于农业科学、动物繁殖等领域。
本文将探讨RNA干扰技术在生物学研究中的应用及其研究现状。
一、RNAi技术的原理及优势RNA干扰技术是一种利用小分子RNA分子介导的特异性基因沉默机制，通过导入人工的小干扰RNA或者小干扰RNA相关的载体来抑制特定的基因表达。
RNA干扰技术在生物学研究中，主要有以下优越性：1. 特异性强：RNAi技术针对的是靶基因的序列区域，能够准确特异抑制目标基因，最大程度避免了对其他基因的影响；2. 操作简单：RNAi技术不需要进行DNA突变、克隆、体外重组等复杂操作，基本上只需在体外导入siRNA快速获得RNAi效应，比较适用于高通量筛选试验；3. 应用广泛：RNAi技术可以应用于多种生物体系，包括哺乳动物、植物、昆虫、线虫等，可以实现基因功能筛选、药物靶点筛选、基因治疗、转基因等一系列应用。
二、RNAi技术在生物学研究中的应用1. 基因功能研究RNAi技术广泛应用于基因功能研究。
在人类基因组研究中，RNAi技术被广泛应用于基因功能解析、基因验证、药物靶点筛选等方面。
RNAi技术可以使细胞内特定基因的mRNA水平下降，进一步研究这些基因在细胞生物学、分子遗传学、生理学甚至疾病发生机制中的作用。
2. 肿瘤疾病治疗在肿瘤疾病治疗方面，RNAi技术也被广泛应用。
RNAi技术可以抑制肿瘤生成、扩散及各个阶段的控制，因此它已成为肿瘤治疗和预防的主要手段之一。
RNAi技术可以抑制特定的肿瘤细胞中的抗凋亡基因的表达，使得肿瘤细胞失去增殖和分化能力，达到治疗效果。
3. 转基因技术研究RNAi技术在转基因技术研究中也有较大的应用，不仅可以实现优良基因的精准插入，还可以实现对转基因生物的一系列控制。
RNA干扰技术及其在寄生虫研究中的应用
RNA干扰技术及其在寄生虫研究中的应用
RNA干扰技术及其在寄生虫研究中的应用
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是双链RNA(dsR-NA)介导的序列特异靶基因转录后基因沉默的过程.RNAi天然存在于各种生物体中,如果蝇、线虫、原生动物、脊椎动物、高等植物等,在保持基因组的纯洁、抵抗病毒的入侵、控制生物发育、染色体的异染色质化等方面都具有非常重要的作用.自1998年Fire等[1]首次将RNAi现象定义为转录后基因沉默(PTGS)后,应用RNAi技术进行基因功能的研究迅速在各种生物中开展起来.本文就RNAi技术及其在寄生虫领域中的研究结果作一综述.
作者：姚利晓林矫矫蔡幼民作者单位：姚利晓(中国农科院上海家畜寄生虫病研究所农业部动物寄生虫学重点实验室,上海,200232;中国农业科学院研究生院,北京,100081)
林矫矫,蔡幼民(中国农科院上海家畜寄生虫病研究所农业部动物寄生虫学重点实验室,上海,200232)
刊名：中国人兽共患病学报ISTIC PKU 英文刊名：CHINESE JOURNAL OF ZOONOSES 年，卷(期)：2006 22(3) 分类号：Q852.7 关键词：。
RNA干扰技术在基因研究中的应用及发展
RNA干扰技术在基因研究中的应用及发展过程RNA干扰技术在基因研究中的应用及发展过程随着科学技术的不断进步和发展，现代生物学研究范式已然转变为分子生物学研究，而基因敲除实验一直是分子生物学研究中最常见的实验之一。
然而，长期以来，基因敲除实验一直存在着一些问题，如因难以精确控制目标基因敲除后的表型，从而影响分子机理的投入有效性。
现在，随着RNA干扰技术的引入，研究人员们终于可以完成另一种基因敲除的方式，确保更加精确的控制，从而推动了分子生物学研究的新发展和新进展。
RNA干扰技术是指由一类小RNA分子引导下的细胞基因剪接、调控和抑制等一系列机制，从而实现基因敲除的目的。
这一技术的原理很简单：RNA干扰技术通过小RNA分子与注定目标RNA分子结合，破坏RNA分子上的碱基序列从而摧毁目标基因的蛋白质合成机制，并把目标RNA分子剪切为较小的短片段。
RNA干扰技术的优点在于，这种技术的敲除效率非常高，精度也非常高，同时其简易操作的特性更赢得了该技术的应用前景。
在此基础上，人们之前采用基因敲除技术进行分子生物学研究的问题已经被很好地解决了。
研究人员们可以通过RNA干扰技术来敲除任何基因，以评估其可能的生物学功能，并探究此基因在正常的生理和病理情况下对细胞行为的影响，从而改进相关临床诊断和治疗方案，推动分子生物学产业不断发展的步伐。
RNA干扰技术应用于基因敲除领域后，其应用在科技领域也再一次得到了提升。
科学家们探索着将RNA干扰技术应用于其他领域，从而展现了RNA干扰技术未来的应用前景。
接下来，我们将讨论RNA干扰技术在分子诊断领域中的应用。
基因敲除技术主要用于推进分子诊断，对于评估细胞和基因变异的影响也起到了重要作用。
然而，目前标准评估方法需要大量的试验时间，往往准确性不高。
如果利用RNA干扰技术敲除一类特定的基因，便可以更快地准确评估细胞或组织对特定基因的敏感性，从而提高了诊断准确性和速度。
此外，RNA干扰技术在精准医疗领域也应用广泛。
RNA干扰技术在基因功能研究中的应用进展
RNA干扰技术在基因功能研究中的应用进展细胞内的基因表达是由基因组中的DNA转录成RNA，再由RNA翻译成蛋白质。
而RNA干扰技术（RNA interference，简称RNAi）则是一种通过降低或抑制特定基因的表达水平来研究基因功能的方法。
近年来，随着RNAi技术的不断发展，它在基因功能研究中扮演着极为关键的角色，并取得了许多重要的进展。
RNA干扰技术的基本原理是利用RNAi途径中的小干扰RNA（small interfering RNA，简称siRNA）或反义RNA（antisense RNA）与目标基因的mRNA结合，导致mRNA降解或抑制其翻译过程。
RNAi技术最早由安德鲁·赛兹纳等人于1998年首次发现并报道，随后这一发现获得了2006年诺贝尔生理学或医学奖。
RNA干扰技术在基因功能研究中的应用主要有以下几个方面的进展：首先，RNA干扰技术被广泛应用于基因沉默。
通过向细胞内引入siRNA分子，RNAi技术能够有效地抑制特定基因的表达。
这种特异性的基因沉默使得研究人员能够针对特定基因进行功能研究。
比如，利用RNAi技术可以研究基因在发育过程中的作用、疾病的发生机制以及癌症的生成等。
尤其是针对一些难以通过传统遗传学方法进行研究的基因，RNAi技术为其功能研究提供了有力的工具。
其次，RNA干扰技术在基因药物研发领域也取得了长足的进展。
许多疾病的发生与异常基因表达有关，RNAi技术提供了一种有针对性的治疗方法。
例如，通过向患者体内输送能够引发RNAi反应的siRNA分子，可以选择性地靶向沉默病因基因，从而达到治疗的目的。
近年来，一些基于RNA干扰技术的基因药物进入了临床试验阶段，为疾病的治疗带来了新的希望。
此外，RNA干扰技术在农业领域也得到了广泛应用。
通过利用RNAi技术，研究人员可以选择性地靶向沉默某些农作物中的有害基因，从而提高农作物的抗病能力、耐盐能力、抗逆性等。
RNAi技术可以被用来开发更为环境友好的农药，降低农药的使用量，减少对环境和人类的损害。
RNA干扰技术及其在基因功能研究中的应用
RNA干扰技术及其在基因功能研究中的应用近年来，随着生物学研究的不断深入，RNA干扰技术作为一种重要的基因功能研究工具，受到了广泛的关注和应用。
本文将介绍RNA干扰技术的原理和应用，并探讨其在基因功能研究中的潜力。
RNA干扰技术是一种通过特异性降解或抑制靶向RNA的方法，从而实现对基因表达的干扰。
其原理主要基于双链RNA（dsRNA）的介导，通过靶向特定的mRNA序列，诱导RNA降解或抑制翻译，从而达到对基因功能的调控。
RNA干扰技术主要包括两种形式：siRNA（小干扰RNA）和shRNA（短发夹RNA）。
siRNA是由21-23个核苷酸组成的双链RNA分子，通过与RISC（RNA诱导的沉默复合物）结合，导致靶向mRNA的降解。
siRNA能够高效地抑制目标基因的表达，因此在基因功能研究中得到了广泛应用。
通过设计合适的siRNA序列，可以实现对特定基因的靶向干扰，从而研究其功能和调控机制。
与siRNA相比，shRNA是一种通过转录表达的方式产生的RNA干扰分子。
shRNA通过转染到细胞中后，会被细胞内的RNA聚合酶II识别和转录，形成具有双链结构的RNA分子。
这些shRNA分子会被Dicer酶切割成siRNA，然后结合到RISC复合物，引发目标mRNA的降解。
shRNA技术可以通过转染或基因转导等方式引入细胞中，从而实现对特定基因的干扰。
RNA干扰技术在基因功能研究中的应用广泛而深入。
首先，RNA干扰技术可以用于筛选和鉴定基因功能。
通过设计和合成一系列的siRNA或shRNA，可以对特定基因进行靶向干扰，观察其对细胞功能和表型的影响。
这种方法被广泛应用于基因敲除、基因沉默和基因表达调控等研究领域。
其次，RNA干扰技术还可以用于研究基因调控网络和信号通路。
通过对多个关键基因进行干扰，可以揭示基因之间的相互作用和调控机制。
这种方法可以帮助我们理解细胞的功能模块和信号传导路径，从而揭示疾病的发生机制和治疗靶点。
RNA干扰技术在生物科学研究中的发展与应用
RNA干扰技术在生物科学研究中的发展与应用随着科技的不断进步，生物科学研究领域也在得到前所未有的发展。
RNA干扰技术作为一个新兴的技术手段，已经在生物学的研究中得到了广泛的应用。
本文将探讨RNA干扰技术的各个方面，包括其原理、应用范围以及未来的发展方向。
一、RNA干扰技术原理RNA干扰技术是指利用合成的RNA分子对特定基因的mRNA分子进行选择性降解或抑制的技术。
这项技术的原理源于RNA介导的基因沉默现象。
RNA干扰技术的主要作用机制是利用RNA分子与目标mRNA分子相互结合，形成RNA-RNA 复合物，通过蛋白酶的作用使目标mRNA分子降解或者抑制翻译。
二、RNA干扰技术的应用范围RNA干扰技术在生物学研究中应用非常广泛，主要用于基因表达的调节、基因功能的探究、生命过程的研究以及疾病的治疗等方面。
在基因表达调节方面，RNA干扰技术能够通过对目标基因的沉默或抑制，实现基因的表达调节，从而探究基因调控网络的机制。
在基因功能探究方面，RNA干扰技术能够帮助科学家们理解了一些奥秘，如细胞周期、分化、凋亡等生物过程以及一个分子或细胞间相互作用的机制。
在治疗疾病方面，RNA干扰技术为治疗基因性疾病提供了新的选择方案。
三、RNA干扰技术的未来发展虽然RNA干扰技术已经在许多领域得到广泛的应用，然而其技术还处于不断的探究与改进中，未来的发展方向还有很多。
其中，研究人员希望提高RNA分子的稳定性，加强其在体内的功能表现，同时也希望开发更加简单易操作的RNA干扰技术。
此外，研究人员也在尝试着将RNA干扰技术应用于更复杂的生态系统研究中，如不同物种间的相互作用，以及不同环境条件对生态系统的影响等。
综上所述，RNA干扰技术作为一项比较新兴的生物技术，已经在生物学研究中得到了广泛的应用，同时其未来的发展也充满了无限的可能性。
可以预见的是，随着技术的不断完善和发展，RNA干扰技术一定会在生物学研究中扮演更加重要的角色，为科学家们提供更精确、更有效、更便捷的研究工具。
RNA干扰技术在基因研究中的应用
RNA干扰技术在基因研究中的应用随着科技的不断发展，基因研究逐渐成为了生物学领域的热点话题。
基因调控是维持正常生命活动的重要基础，RNA干扰技术作为一种新兴的基因调控手段，其应用越来越广泛。
在本文中，将从以下几个方面对RNA干扰技术在基因研究中的应用进行阐述。
一、RNA干扰技术是什么?RNA干扰技术是指通过人工合成的双链RNA分子，介导靶向RNA的降解或抑制该RNA的翻译过程，从而实现基因的沉默或抑制。
RNA干扰技术可以通过两种方式实现，一种是siRNA，即小干扰RNA，它们是20~25个核苷酸的双链RNA，可特异性地结合靶标RNA、诱导RNA降解；另一种是miRNA，即微小RNA，它们双链RNA分子长度近似，但来源不同，miRNA是内源性产生，可介导靶向RNA抑制，降低其翻译效率。
二、RNA干扰技术在基因沉默中的应用RNA干扰技术在基因沉默和抑制方面有着广泛的应用，尤其在基因功能分析中发挥着重要的作用。
在简单生物中，如拟南芥、线虫和果蝇，RNA干扰基因沉默会在所有细胞中诱导目标基因的沉默，从而产生全表型损失。
而在高等生物中，RNA干扰技术可以部分靶向沉默基因，为研究特定功能模块提供手段；或者采用全基因组筛选或大规模重筛作为科学研究中有效方法。
例如，科学家可以通过RNA干扰技术来探究各种基因对生命活动的影响，从而揭示基因在生命活动中所扮演的角色，并为相关疾病的治疗和预防提供依据。
RNA干扰技术还可以用于研究基因调控和信号转导通路，加深对细胞生命活动的认识。
三、RNA干扰技术在基因治疗中的应用RNA干扰技术在基因治疗领域也有极大的应用潜力。
例如，RNA干扰技术可作为治疗HIV感染的一种新手段。
科学家通过将siRNA导入细胞内，靶向HIV病毒的RNA进行干扰，从而抑制病毒繁殖，最终减轻患者的症状、改善预后。
除了HIV感染，RNA干扰技术还可以应用于其他重大疾病中，如心脏病、糖尿病、癌症等。
许多研究表明，针对特定癌症标志基因靶向抑制，可以抑制癌细胞的繁殖，并且RNA干扰技术可以被用于治疗癌症的个性化药物的制备。
RNA干扰技术在基因功能研究中的应用
RNA干扰技术在基因功能研究中的应用随着人类对基因的认识不断深入，探索和理解基因功能的重要性日益凸显。
在基因功能研究中，RNA干扰技术作为一种强大的工具被广泛应用。
本文将从原理、应用实例和前景展望三个方面来介绍RNA干扰技术在基因功能研究中的应用。
一、原理RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是在细胞中通过特定的RNA分子介导，通过退化已经存在的mRNA分子或抑制其翻译而靶向调节和控制基因表达的过程。
RNA干扰技术主要包括两个步骤：siRNA的合成和siRNA与靶标mRNA结合并降解。
二、应用实例1. 基因沉默RNA干扰技术常用于研究特定基因的功能。
通过合成特定的siRNA，可将其引入细胞，使其与目标mRNA片段特异性结合并导致mRNA的降解。
这使得研究人员可以研究该基因的沉默对细胞功能的影响。
2. 基因敲除RNA干扰技术还可以用于基因敲除，即通过沉默或降解基因的mRNA来完全阻断目标基因的表达。
通过此方法，研究人员可以模拟基因突变体或病理条件，深入研究具体基因在细胞生物学中的重要性。
3. 基因诱导表达除了靶向降解基因表达外，RNA干扰技术也可以通过合成合适的siRNA，来增加特定基因的表达。
这可以用于研究某些基因或蛋白质的功能，特别是对于那些难以通过已有的方法进行研究的基因或蛋白质。
4. 功能基因组学RNA干扰技术在功能基因组学中发挥着重要作用。
由于目前我们对人类基因组中许多基因的功能知之甚少，利用RNA干扰技术可以对大规模基因进行高通量筛选，以便识别和发现新的功能基因。
三、前景展望随着RNA干扰技术的不断发展和改进，它在基因功能研究中的应用前景广阔。
一方面，RNA干扰技术可以帮助我们更好地理解基因和基因功能的复杂网络；另一方面，它也为治疗基因相关疾病和研发新的药物提供了新的途径。
总结RNA干扰技术作为一种功能强大的工具，广泛应用于基因功能研究中。
通过RNA干扰技术，我们可以实现基因沉默、基因敲除、基因诱导表达等。
RNA干扰技术在基因组研究中的应用
RNA干扰技术在基因组研究中的应用DNA是生命体内不可或缺的分子，它们储存了所有细胞的遗传信息。
由于DNA编码蛋白质，因此许多科学家研究了基因的结构和功能，以便更好地理解这些过程。
然而，我们需要了解的不仅仅是DNA的功能，还有它如何通过RNA翻译成蛋白质。
因此，科学家们探索了RNA干扰技术的可能性。
本文将介绍RNA 干扰技术及其在基因组研究中的应用。
RNA干扰技术是什么？RNA干扰（RNAi）是一种先进的基因靶向技术，可用于研究基因调控和表观遗传学。
功能通过控制RNA 的表达来靶向沉默或抑制基因转录和翻译。
该技术利用特定的双链RNA（siRNA和miRNA）序列来诱导靶基因沉默。
这些RNA序列与靶基因的互补区域相结合，从而共价结合并引导RNA酶切割该靶基因的mRNA 分子。
这种RNA干扰过程可阻止mRNA转录成蛋白质。
RNAi过程的价值在于其精确和特异性。
当siRNA序列适当制作，并且正确地执行RNA干扰过程时，该技术可轻松地用于目标控制，同时仅在特定局部区域产生副作用。
miRNA是RNAi的另一种形式，它们是由内源性非编码RNA合成的一类短链RNA。
miRNA调节基因表达并在应激反应中发挥重要作用。
当它们与靶标基因的3'-非翻译区域或编码序列相互配对时，miRNA也可以诱导RNAi。
miRNA是RNA 干扰的重要部分，同时也是开发siRNA的重要基础。
RNA干扰技术在基因组研究中的应用？RNA干扰技术在基因组学的很多方面都有很大的应用空间。
通过控制靶化RNA表达，RNAi可以使细胞不表达或过度表达特定的基因。
以下是RNA干扰技术在基因组研究中的应用：1. 基因沉默可通过RNA干扰技术推断出基因的作用。
通过这种方法，可以破坏特定的基因表达，从而研究该基因在细胞和个体中的重要性。
这将有助于我们理解该基因在生长、细胞分裂、肿瘤形成和其他调控过程中的功能和过程。
2. 可变外显子RNA干扰技术可以使研究人员系统地地破坏基因的可变外显子，以确定其对编码蛋白质的影响。
RNA干扰技术在基因功能验证中的应用
RNA干扰技术在基因功能验证中的应用引言基因是生物体内遗传信息的基本单位，通过指导蛋白质的合成来执行生物体的各种功能。
为了深入了解基因的功能和作用，科学家们发展出了各种基因功能验证技术。
其中，RNA干扰技术是一种常用且可靠的方法，通过抑制目标基因的表达，帮助研究人员揭示出基因的功能和作用机制。
本文将重点介绍RNA干扰技术在基因功能验证中的应用。
1. RNA干扰技术的原理和分类RNA干扰技术，即RNA interference，是一种通过RNA分子介导的基因沉默方法。
它利用小干扰RNA（siRNA）或者shRNA（小发夹RNA）与目标基因的mRNA序列互补配对，导致mRNA降解或者抑制其翻译，从而抑制目标基因的表达。
RNA干扰技术可以分为两类：siRNA和shRNA。
siRNA是一种由21到23个核苷酸组成的双链RNA分子，通常通过合成的方式引入细胞内，与目标基因的mRNA序列发生互补配对，引导RNA干扰复合物（RISC）结合并降解目标mRNA。
shRNA是一种由植物病毒通量转录的RNA分子，具有结构与siRNA相似，但长度通常较长。
shRNA通过载体导入细胞内，转录出shRNA，再通过核酸聚合酶Ⅲ将其修饰为siRNA，在细胞内引起目标基因的干扰效应。
2. RNA干扰技术在基因沉默中的应用RNA干扰技术作为一种强大的基因沉默工具，已经广泛应用于基因功能验证中。
以下是RNA干扰技术在基因沉默中的几个常见应用。
（1）基因敲除RNA干扰技术可以通过靶向mRNA分解的方式，直接降低目标基因的表达水平。
对于不易实施敲除实验的基因，如有毒或重要的基因，RNA干扰技术提供了一种可行的替代方法。
研究人员设计合适的siRNA或shRNA，靶向基因的特定区域，从而抑制或消除目标基因的功能，进而研究基因的作用和影响。
（2）表观遗传调控研究除了抑制目标基因的表达，RNA干扰技术还可以用于研究基因的表观遗传调控机制。
通过设计siRNA或shRNA针对DNA甲基化酶或修饰酶等基因，可以调查这些酶对基因的表达和染色质结构的影响，从而深入了解基因的表观遗传调控模式。
RNA干扰技术在基因研究中的应用
RNA干扰技术在基因研究中的应用在基因研究领域中，RNA干扰技术被广泛应用于基因沉默、功能分析和基因治疗等方面。
该技术通过寄生物RNA干扰的效应，能够抑制或沉默特定基因的表达，从而揭示基因的功能以及影响基因表达的调控机制。
本文将重点介绍RNA干扰技术在基因研究中的应用，并探讨其在疾病治疗中的潜在价值。
一、RNA干扰技术的原理RNA干扰技术是一种通过转染外源性双链RNA（dsRNA）或siRNA（small interfering RNA）引发细胞内RNA干扰反应的方法。
该技术通过特异性地降低目标基因的mRNA水平，从而实现对基因表达的沉默。
RNA干扰技术主要分为两种类型：siRNA介导的RNA干扰和miRNA介导的RNA干扰。
siRNA介导的RNA干扰是通过转染合成的具有特定序列的短双链RNA(siRNA)到特定的细胞或组织中，siRNA会与细胞内的RNA识别复合物（RISC）结合，并使RISC中的Argonaute蛋白切割mRNA靶标。
这种切割作用导致基因mRNA降解，从而实现对基因表达的抑制。
miRNA介导的RNA干扰是通过转录和加工生成的miRNA分子与mRNA进行互作。
miRNA与mRNA的互作导致mRNA的降解或抑制其翻译成蛋白质，从而调控基因表达。
miRNA不仅参与基因沉默的调节，还在胚胎发育、细胞增殖和分化中发挥重要作用。
二、1. 基因功能研究RNA干扰技术为基因功能研究提供了一种高效、特异性的方法。
通过沉默特定基因的表达，研究人员可以揭示基因在细胞生物学过程中的功能和作用机制。
相比传统的基因敲除技术，RNA干扰技术更具优势，因为它不会完全破坏基因的表达，而是通过降低目标基因的表达水平来研究其功能。
2. 基因调控机制研究RNA干扰技术不仅可以用于研究特定基因的功能，还可以帮助科学家揭示基因调控网络的复杂性。
通过沉默特定的转录因子或调控基因，可以研究其对其他基因的调控作用，以及整个调控网络中的相互关系。
RNA干扰技术及其在研究中的应用
RNA干扰技术及其在研究中的应用RNA干扰技术是基因沉默的一种重要方法，它通过介导RNA的降解或阻止RNA的翻译来影响基因表达，从而控制生物体内基因功能。
RNA干扰技术的发现不仅揭示了基因转录和翻译的调控机制，而且在疾病治疗和基因工程等方面广泛应用，成为现代分子生物学中不可或缺的一环。
本文将重点介绍RNA干扰技术及其在研究中的应用。
一、RNA干扰技术的基本原理RNA干扰技术是基于RNA干扰的生物学基础而建立的。
RNA干扰是在细胞内通过一种特定的机制来抑制某些基因表达的过程。
这种机制是由具有同源的小分子RNA分子介导的。
在哺乳动物细胞中，小分子RNA通常包括两种类型：小干扰RNA（siRNA）和microRNA（miRNA）。
这两种RNA分子具有相互重叠和互补的序列，它们都可以通过与靶RNA特定区域上相互补合来介导RNA降解或阻断RNA的翻译。
在RNA干扰技术中，用合成的siRNA或miRNA序列替代自然产生的小分子RNA，从而实现对特定基因的沉默。
siRNA和miRNA的区别在于它们具有不同的起源和处理方式，siRNA由dsRNA特异性裂解产生，而miRNA则来自于内源性前体miRNA的多步加工。
在RNA干扰技术中，siRNA通常是由两个21-23个核苷酸链组成，可以在细胞内引起剪接酶介导的靶RNA特定区域上裂解作用。
与siRNA不同，miRNA则较短，长度约为22个核苷酸。
它们最初是通过胚胎干细胞过程中的肺炎链球菌产生，并在细胞质中先由Drosha酶切割，再由Dicer酶切割成22个核苷酸的片段。
然后，这些miRNA片段结合到RISC复合物中，靶向小分子RNAs绑定到mRNA上，导致RNA降解或是翻译被阻止。
二、RNA干扰技术在研究中的应用1.基因功能分析RNA干扰技术用于基因功能分析是其最重要、最广泛的应用之一。
通过轮替入siRNA或miRNA来抑制基因表达，可以深入研究生命体系内各种不同生物学过程的分子机制。
RNA干扰技术及其在基因研究中的应用
RNA干扰技术及其在基因研究中的应用随着科学技术的不断进步，人类对基因和遗传学研究的关注越来越高涨。
基因研究在很多领域都有重要的应用价值，其中RNA干扰技术尤为重要。
RNA干扰技术是指利用RNA分子的专一互补配对来沉默一定的基因表达。
本文将详细介绍RNA干扰技术的基本原理及其在基因研究中的应用。
一、RNA干扰技术的基本原理RNA干扰技术最早是发现于植物，随后才被发现在动物细胞中也具有同样的作用机制。
作为一种先进的生物技术，RNA干扰技术的原理可以分为两个步骤：siRNA合成及siRNA从RNAi RISC（RNA诱导沉默复合物）介导的mRNA降解。
1. siRNA合成siRNA是由外源或内源限制酶（Dicer）水解的具有21-23个核苷酸的双链RNA分子。
siRNA的启动分子往往为dsRNA或微RNA（miRNA）前体。
笼统的说，miRNA与dsRNA是同类型但不完全相同，它们在产生过程中都需要dicer这个酶的功效作为固有单元。
Dicer通过将dsRNA水解成带有5‘磷酸的siRNA，siRNA再与RNAi RISC复合体结合，siRNA会被裂解成单链，在与靶标上（如mRNA）一段互补的区域配对，促使mRNA被降解，从而达到沉默的目的。
2. siRNA从RNAi RISC介导的mRNA降解siRNA将mRNA分子降解的过程是在RNAi RISC中实现的。
RNAi RISC是由小RNAs和RNA诱导的弯曲复合物（RISC）组成。
小RNAs的选择和RISC蛋白的招募唯一，起到识别和靶定作用，通过依赖是RNA的物理化学特性如序列比对和互补，最终将mRNA分子切割，使其被降解，从而起到干扰mRNA同源基因的表达的作用。
二、RNA干扰技术在基因研究中的应用RNA干扰技术在基因研究领域中大有用武之地。
其中，常见的应用包括：1. 基因沉默通过合成siRNA，科研人员可以对特定区域的基因进行选择性的沉默，从而研究该基因在细胞或生物体中的生理、生化作用及相互关系。
RNA干扰技术在基因研究和转基因技术中的应用研究
RNA干扰技术在基因研究和转基因技术中的应用研究RNA干扰技术是一种目前在基因研究和转基因技术领域广泛应用的重要技术。
这种技术通过特定的机制，可以靶向性地降低目标基因的表达水平，从而揭示基因功能和生物过程，进而实现对目标基因的精准修改和调控。
在本文中，我们将从三个方面探讨RNA干扰技术在基因研究和转基因技术中的应用研究。
一、RNA干扰技术在基因研究中的应用研究RNA干扰技术可用于靶向选择性对RNA进行降解，由此可以使靶基因的表达水平下降或者失活。
这种技术不依赖表达该基因的蛋白质，只通过RNA的拼接发挥作用。
因此，RNA干扰技术是研究基因功能和生物过程的重要手段之一。
在基因研究中，RNA干扰技术的应用研究包括了如下三个方面：1.基因失活研究RNA干扰技术可通过针对靶基因mRNA的特定酶切和RNA降解，实现在细胞水平的基因失活研究。
治疗证明，RNA干扰技术在基因敲除实验中效率较高，且在哺乳动物系统中也具有剂量依赖性和特异性。
通过这种方法，研究人员可以发现基因与疾病之间的关联或基因之间的功能互补性，也可探索基因对发育、代谢和恶性转化等生物学过程的贡献。
2.基因功能研究RNA干扰技术也可用于研究基因功能的调控机制。
研究人员通过对某一基因进行外源RNA干扰，观察其对细胞运作所造成的影响。
例如，控制不同数量RNA 大小的RNA干扰可用于研究基因的剪接机制，或者对miRNA的功能进行研究。
3.新基因发掘和评估除此之外，RNA干扰技术亦可用于研究新发现的基因。
通过RNA干扰技术的方法，在重新分配合适的生物条件后，一个未知的基因，其功能得以被彻底地深入研究和评估。
同时，RNA干扰技术还可用于新基因的发现，提高基因识别效率，确保结论的可靠性。
二、RNA干扰技术在转基因技术中的应用研究目前，转基因技术已成为基因工程领域中的关键技术之一。
RNA干扰技术的出现和广泛应用，更是为转基因技术的发展提供了新的机遇和挑战。
RNA干扰技术可以在感兴趣的生物体系内被快速转化，从而实现对此类生物体系的基因编辑和基因调控。
RNA干扰技术在基因功能研究和治疗上应用
RNA干扰技术在基因功能研究和治疗上应用随着生物医学研究的不断深入，人们对于基因功能的了解也越来越深入。
基因是生物体内的遗传信息携带者，因此了解基因功能对于治疗疾病和改善生命质量至关重要。
RNA干扰技术作为一种具有广泛应用前景的基因表达调节方法，成为了基因功能研究和治疗领域的热点之一。
本文将从RNA干扰技术的原理、应用于基因功能研究的主要方法和在基因治疗上的应用三个方面进行介绍和分析。
RNA干扰技术是通过介导小干扰RNA(siRNA)或shRNA诱导靶基因特异性沉默，从而调节基因表达和调查基因功能的技术。
其原理基于RNA干扰途径存在于真核生物中的自然防御机制。
在RNA干扰途径中，双链RNA（dsRNA）被切割成短的siRNA或shRNA，其中一个链被载入RNA诱导靶基因沉默复合物（RISC），然后与靶基因的mRNA互补配对，并导致mRNA降解或抑制转录过程。
通过这种方式，RNA干扰技术能够高效地抑制特定基因的表达。
在基因功能研究方面，RNA干扰技术提供了一种快速、高效的方法来探究基因的生物学功能。
研究人员可以合成特定靶基因的siRNA，并将其导入细胞内。
一旦siRNA进入细胞内，它会与靶基因mRNA相结合，引导其降解或抑制转录，从而实现目标基因的沉默。
通过观察沉默后的细胞或生物体，研究人员可以了解目标基因在生物体中的具体功能以及其对于特定生理和病理过程的影响。
此外，由于RNA干扰技术具有高效、特异性和可靶向的特点，它为基因功能研究提供了一种灵活且可重复的工具。
除了基因功能研究，RNA干扰技术在基因治疗中也有广泛的应用。
通过结合不同的递送系统，siRNA或shRNA可以有效地被运送到特定细胞或组织中，进而实现治疗目标。
在癌症治疗方面，RNA干扰技术被应用于靶向癌症相关基因的沉默，从而抑制肿瘤生长和扩散。
例如，通过抑制促进肿瘤血管生成的VEGF基因，可以有效地遏制肿瘤的血液供应，从而阻断其生长和转移。
RNA干扰技术在生物研究中的应用
RNA干扰技术在生物研究中的应用RNA干扰技术是一种能够沉默基因表达的方法，它通过利用小分子RNA特异性识别靶基因，并将其降解或抑制其翻译来实现这一功能。
这种技术已经广泛应用于生物学研究中，包括研究基因功能、探索新靶标、分析基因网络、筛选药物等。
下面将详细介绍RNA干扰技术在生物研究中的应用。
RNA干扰技术在基因沉默中的应用RNA干扰技术可以通过引入小分子RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）来特异性抑制靶基因的表达。
这种技术可以用于分析基因功能，并研究各种生物过程中的基因调控。
以研究肺癌为例，研究人员可以先筛选出与肺癌相关的基因，然后设计siRNA或shRNA来靶向这些基因，通过沉默这些基因，分析它们在肺癌中的功能及其作用机制。
RNA干扰技术在探索新靶标中的应用RNA干扰技术可以通过筛选siRNA或shRNA来探索潜在的靶基因。
这种技术可以用于发现各种生物过程中的新的基因或预测治疗疾病的新靶点。
例如，研究人员可以用RNA干扰技术来验证某些基因是否有潜在的药物靶标作用，这样可以减少药物研发过程中的不必要的浪费和风险。
RNA干扰技术在分析基因网络中的应用RNA干扰技术可以用来研究基因网络中的相互作用。
通过注射siRNA或shRNA进入特定细胞，可以沉默靶基因并观察其对其他基因的影响。
这种技术可以用于研究基因调控网络、发现新的信号通路和探索新的生物学机制。
例如，研究人员可以用RNA干扰技术来研究癌细胞中哪些信号通路对其生长和分裂起着关键作用，以发现新的抗癌药物。
RNA干扰技术在筛选药物中的应用RNA干扰技术可以用于药物筛选。
研究人员可以利用RNA干扰技术来验证一些靶基因的作用，然后筛选药物并测试其是否能够影响这些基因。
这种技术可以用于发现新的化合物、评估其效果以及分析其作用机制。
例如，研究人员可以用RNA干扰技术研究某些基因是否对肿瘤细胞的增殖有重要作用，并筛选出具有靶向这些基因能力的化合物来作为新的抗癌药物。
RNA干扰技术在研究和治疗中的应用
RNA干扰技术在研究和治疗中的应用随着生物学研究的深入，越来越多的技术被应用于研究和治疗领域。
其中，RNA干扰技术是一种具有广泛应用前景的技术。
RNA干扰技术是根据人类细胞内的一种自身防御机制而来的。
在这种机制中，特定的RNA分子被用来识别并分解与其匹配的mRNA分子，从而抑制特定基因的表达。
目前，RNA干扰技术已成为研究和治疗领域中的重要工具之一。
一、RNA干扰技术在基础研究中的应用1、基因功能研究RNA干扰技术可通过抑制基因表达来研究基因功能。
通过处理细胞系或动物模型，在不影响人体或动物健康的前提下，研究某个基因与某个生理过程之间的关系。
例如，利用RNA干扰技术探究白血病相关基因Bcl-2在细胞凋亡过程中起到的作用。
2、病因研究在许多疾病中，基因异常是一种重要的病因。
RNA干扰技术可以通过针对特定基因的干扰来探究其与疾病的关系。
例如，在乳腺癌研究中，研究人员利用RNA干扰技术针对HER2基因进行干扰，从而深入了解HER2基因与乳腺癌之间的相互作用。
二、RNA干扰技术在临床治疗中的应用1、基因治疗RNA干扰技术可以用于基因治疗，即通过RNA靶向治疗来恢复病人正常的基因表达水平。
例如，在肝癌治疗中，利用RNA干扰技术针对癌细胞的基因进行干扰从而抑制癌细胞增殖，促进治疗效果。
2、药物靶向治疗RNA干扰技术还可以应用于药物靶向治疗。
利用RNA干扰技术可以设计出靶向特定基因的小分子RNA，它具有非常高的特异性，并且不会影响正常基因的表达，从而实现被认为难以达到的药物靶向治疗。
例如，RNA干扰治疗已开始被用于肝病和癌症患者的临床治疗。
三、RNA干扰技术的挑战虽然RNA干扰技术在研究和治疗领域具有重大意义，但仍然存在一些挑战。
其中一些问题包括：1、功能靶向性：RNA干扰技术的靶向性很高，但可以对多个基因进行干扰，这意味着它们可以干扰其他相关或无关的基因，可能导致治疗不良事件。
2、生物不稳定性：RNA分子在体内的寿命非常短，这会使RNA干扰技术的应用受到限制。
RNA干扰技术在真菌基因功能研究中的应用
On the Role of RNA Interference in Gene Function
of Fungi
作者： 赵伟[1] 黄杰[2] 汪涛[1] 戚仁德[1]
作者机构： 安徽农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所,安徽合肥,230031[1] 安徽农业大学植保学院,安徽合肥,230036[2]
出版物刊名： 合肥师范学院学报
年卷期： 2012年 第6期
主题词： RNA干扰 丝状真菌 基因功能
摘要：RNA干扰是在真核生物中普遍存在的一种保守的基因沉默机制,该机制的发现是过去20年对科学研究领域作出最为重大的贡献之一.RNA干扰在仅仅被发现几年后,便成为反向遗传学研究领域的重要工具,尤其在基因敲除耗时长且效率低的物种中使用更为普遍.在丝状真菌基因功能研究领域,RNA干扰所具有的特点,使其逐步成为一种新颖的、高效的研究技术.本文主要阐述了RNA干扰在真菌研究领域的作用机理,并讨论了RNA干扰相关技术在丝状真菌基因功能研究方面的应用.。
RNA干扰的机制及其在基因功能研究中的应用
RNA干扰的机制及其在基因功能研究中的应用RNA干扰（RNA interference，简称RNAi）是一种基因调控方式，是通过特定RNA序列的小分子介导的基因沉默。
RNAi技术的应用领域广泛，包括基因功能研究、药物发现和治疗等。
其中，RNAi技术在基因功能研究中的应用尤为重要。
本文将就RNA干扰的机制以及其在基因功能研究中的应用进行探讨。
一、RNA干扰的机制RNA干扰的机制主要包括两种，一种是siRNA介导的RNA干扰机制，另一种是miRNA介导的RNA干扰机制。
1. siRNA介导的RNA干扰机制siRNA是一种非编码的小分子RNA，由21-23个核苷酸组成。
siRNA通常由双链RNA分子通过RNaseⅢ酶切割形成，在细胞内介导 mRNA的降解。
siRNA结合核心酶复合物RNAinduced silencing complex（RISC）后，在 siRNA单链末端形成一个5'磷酸和一个3'羟基的端，形成稍稍不对称的"烟蒂"结构，从而增强RISC的稳定性。
然后，siRNA单链部分与mRNA的互补序列配对，导致mRNA的降解，从而抑制基因表达。
2. miRNA介导的RNA干扰机制miRNA也是由一段21-23个核苷酸的非编码RNA组成，类似于siRNA。
miRNA成熟后形成一个双链RNA分子，在小核苷酸元件上与RISC结合，RISC 通过识别miRNA单链分子上3'端的非完全互补序列，将其测量为25~30个核苷酸长度的单链RNA（miRNA）介导的RNA干扰机制。
最终，这种干扰形式也是通过让mRNA报废实现的。
二、RNA干扰在基因功能研究中的应用RNA干扰技术的应用可以使人们快速研究基因产物的生物功能和生理作用，得到关于基因调控的更加深入的认识。
RNA干扰应用于基因功能研究主要有以下几个方面。
1.原位杂交原位杂交是检测RNA表达与定位方式，探究mRNA的空间分布和细胞级别的表达模式。
RNA干扰技术及其在基因研究中应用
RNA干扰技术及其在基因研究中应用RNA干扰技术是一种通过介导目标mRNA降解或抑制其翻译来靶向调控基因表达的技术。
该技术利用小分子RNA，即小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）或小发夹RNA（short hairpin RNA, shRNA），与目标mRNA特异性结合并通过RNA酶的活性引发有选择性的切割、降解或抑制其翻译，从而达到抑制目标基因表达的目的。
自从RNA干扰技术的发现和发展以来，它已成为一种广泛应用于分子生物学和基因研究领域的重要工具。
RNA干扰的机制主要包括两种方式：siRNA和shRNA。
siRNA是20-30个碱基长的双链RNA分子，是RNA干扰的关键介导因子。
通过转染到细胞中，siRNA将与相同序列的mRNA结合形成双链RNA复合物，然后被核酸酶样酶（Dicer）切割为20-25个碱基的短片段，最终与RNA诱导沉默复合物（RISC）结合，导致目标mRNA的降解。
shRNA则是通过基因组整合表达，构建了含有siRNA的转录单元，即非编码RNA（non-coding RNA）。
shRNA在细胞中可以稳定存在，并通过内源RNA酶酶解生成活性的siRNA。
RNA干扰技术在基因研究中有着广泛的应用。
首先，RNA干扰技术可以用于靶向特定基因的表达抑制，进而研究该基因对生物体发育和功能的作用。
通过设计和合成与目标基因互补的siRNA或shRNA序列，可以选择性地靶向特定的基因，在细胞或动物模型中观察其表达抑制的效果，从而研究该基因的功能。
这种方法不仅可以用于研究生长发育过程中的基因调控网络，还可以解析疾病发生发展中的关键基因。
其次，RNA干扰技术可用于筛选和鉴定基因功能。
通过高通量筛选技术，可以设计并合成大规模的siRNA或shRNA文库，并将其转染到感兴趣的细胞系中，快速而有效地评估每个对应的基因的功能。
这种筛选方法被广泛应用于发现和验证新的药物靶点，探索生物过程中的新基因和新信号通路。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Ａｂｓｔ隐ｃｔ： ｗｈｉｃｈ ｉｎｉｔｉａｔｅｓ
Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ
ａ
ｇｅｎｏｍｅ
８ｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ，ｉｔ ｐｒｏｖｉｄｅｓ １０ｔｓ ｏｆ ｕｎｋｎｏｗｎ
ｇｅｎｏｍｉｃｓ
ｇｅｎｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ａ
ｎｅｗ
ａｒｅａ
０００
０００
ｎｇ），进行ＰｃＲ获得３个片段融合的片段（图
２）；第三轮ＰｃＲ：以３’一ｎｅｓｔ；５’－ｎｅｓｔ为引物（图１）进 行ＰＣＲ富集３段基因融合的终产物（图２）。终产 物可以直接用于连接等后续操作，无需进行纯化。
＋５ＬＦ∞…６二Ｒｅｖ＋ｍａｒｋ一诅ｉｌ…．ｍａｒｋ—ｔａｉｌ＋３：Ｆｏｒ…．３ＬＲｅｖ＋
１．３
３实验室在敲除构巢曲霉功能基因时曾设计两
对引物进行扩增，发现巢式引物几乎可以１００％获 得目的产物。此外，退火温度的选择，延伸时间的设 定等也是重要的影响因素。 迄今为止，应用此种方法，已经成功地敲除了３ 类丝状真菌中的３１个基因。如２００４年，Ｙｕ等”１分 别以ａｒｇＢ、ｐｙｒＧ为选择性标记与构巢曲霉、烟曲霉 和禾谷镰刀菌中的目标基因的上下游序列相连，成 功构建了７个突变体；２００７年，李敏等＂１利用此项 技术成功将哈茨木霉中Ｂ一微管蛋白基冈的上下游 序列与苯并咪唑抗性基因，潮霉素抗性基因融合在 一起，成功地构建了敲除微管蛋白的打靶载体。 另一种基于ＰＣＲ技术的高效地构建打靶载体 的方法是引入酶切位点，这种方法被称为连接介导 ＰＣＲ。６１。这一方法主要是通过带有特定酶切位点的 引物扩增靶基因的两侧序列，将产物回收后，用相同 的限制性内切酶酶切，然后在连接酶的作用下将３ 条片段连接起来，最后用巢式引物扩增整个片段，从 而进行后续操作。这样就减少了一次ＰｃＲ反应，但 增加了一步酶切一连接反应。这种做法的优点在于 减少了反复扩增中产生突变的可能，但是由于酶切 一连接的过程中，酶切的效率是一个不确定因素，因 此这两种方法各有利弊，在具体试验中可以采用不 同的策略，以提高打靶载体构建的成功率。
ｃｎ
万方数据
２０１１年第５期
冀颖等：基因打靶与ＲＮＡ干扰技术在丝状真菌基因功能组学研究中的应用
６５
化揭示目标基因的功能。 １．２基因打靶技术的技术路线 １９８５年，首次证实在哺乳动物细胞中存在基因 同源重组，为基因敲除技术的创立奠定了理论基础。 １９８７年，Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ等…成功地构建了动物一小鼠 敲除模型，为基因敲除技术的应用奠定了实践基础。 近２０年来，此项技术已经由在酵母和哺乳动物中的 应用，拓展到了植物、真菌基因功能的研究中。其大 致要包括构建载体、真菌转化、筛选突变体和分析表 型等步骤。
ＡＦ破～Ｋ＆５娑噬竺’逻竺ｓ
■■■■■■＿【—＝—，●■■■■■＿ ．口２ Ｂ Ｓｅｃｏｎｄ Ｒｏｕｎｄ ＰＣＲ：
１ 争６ ・４
ｒｅａｃｔｊｏｎ
２一斗ｆｅａｃ６∞
ＣＴ＿ｌｌｉｒｄＲｏｕｎｄＰＣＲ：
７
ｊｋ。。。。。：：：：，。。一 ——“２１—＇８
图２基因替换盒的构建过程
融合ＰＣＲ法构建打靶载体具有操作简单等优 点，但也存在以下几个问题：（１）３个特异性片段 （用高保真的死ｇ ＤＮＡ聚合酶扩增），能否成功地融 合关键在于互补序列的长度，一般来讲，互补序列越
ｏｎ
ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ＲＮＡｉ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｗｈｉｃｈ ｉｓ
ｒｅ８ｅａｒｃｈ
ｇｅｎｅ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｗａｓ ｒｅＶｉｅｗｅｄ． Ｃｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＲＮＡｉ Ｆｕｓｉｏｎ ＰＣＲ ＡＴＭＴ
Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ
随着大量丝状真菌基因序列信息的测定，以基 因功能鉴定为目标的功能基因组学已经成为目前生 命科学领域研究的热点。转基因、基因打靶和ＲＮＡ 干扰等反向遗传学技术是系统地分析基因的功能、 基因间的相互作用、基因组的时空表达以及发现和 寻找新的功能基因的有效方法。其中基因打靶、 ＲＮＡ干扰技术能够有效和特异性地抑制目标基因 的表达，操作简单易行，故在基因功能研究中应用十 分广泛。
生物技术通报
・技术与方法・
ＢＩｏＴＥｃＨＮｏＬｏＧＹ ＢＵＬＬＥＴｌＮ
２０１１年第５期
基因打靶与ＲＮＡ干扰技术在丝状真菌 基因功能组学研究中的应用
冀颖
李梅
蒋细良
（中国农业科学院植物保护研究所农业部生物防治重点开放实验室，北京ｌＯ００８１）
摘要：
随着丝状真茵模式生物基因组测序工作的进行，其提供的大量未知功能的基因序列，为研究丝状真菌的基因
等量加入即可。（３）在第三轮ＰｃＲ反应中采用巢式 引物扩增双接头产物，可以提高试验的成功率。
ＹｕＨ
括里氏木霉ｎｉｃ＾ｏｄｅｍⅡＭｅｓ西等）进行转化，发现其
转化效率是ＰＥＧ／ｃａｃｌ：介导的原生质体转化法的 ６００倍。２００８年，乔建军等¨叫利用ＡＴＭＴ法成功地 构建了烟曲霉的尿嘧啶缺陷突变体；龙朝钦等…１成 功地构建了烟曲霉几丁质合成酶ｃｈｓＣ基因缺失突 变体；马彦等¨２１构建了烟曲霉ｐｂｓ２基因的缺失突 变体。虽然ＡＴＭＴ法成功地介导了多种真菌的转 化，但是，影响根癌农杆菌介导真菌转化的效率的因 素较多，不同根癌农杆菌菌株及不同的双元载体都 直接影响着转化的成败。 １．２．３转化子的筛选根据选择性标记，通常是抗 生素标记，如潮霉素、新霉素或腐草霉素等，或者营 养缺陷型标记，如精氨酸等，对转化子进行筛选，找 到假定转化子，然后采用ｓｏｕｔｈｅｍ杂交技术或者 ＰｃＲ扩增选择性标记基因的方法进行验证。 １．２．４转化子的表型分析通常采用转化子与野 生型对照的方式，观察表型差异，或者检测某些成分 的含量变化，最终验证此基因的功能。
１基因打靶技术
基因打靶技术是２０世纪８０年代末发展起来的 一种新型的研究基因功能的技术。它是指对一个结
收稿日期：２０１０．Ｉｌ—１８
基金项目：国家自然科学基金项目（３０６７１４００），国家支撑项目（２００６ＡＤ０８Ａ０２），国家高技术研究发展计划（２００６ＡＡｌ０Ａ２１１），中国农业科学院 植物保护研究所基本科研业务费专项（２０ｌＯ－１５），植物病害生物学国家重点实验室开放基金（ＳＫＬ２０１００Ｐ１７） 作者简介：冀颖，女，硕士研究生，研究方向：微生物学；Ｅ—ｍａｉｌ：ｊｉｎｇｌ９８６０３１９＠１２６．ｃｏｍ 通讯作者：蒋细良，男，研究员。Ｅ—ｍａｉｌ：ｘＵｉａｎｇ＠ｃＭ８．ｎｅＬ
一一一一一～ｆ．《ｒＧ——・Ｔ姆ａＧ朋ｅｏＲＦ卜一一一一一一
＋５，ｍａｒｋ…ｎ－・３，ｍ矾【＋
＋５，－ｎｅ讣一一一…………ｍ…¨－一………・３，－ｎｅｓｔ＋
图１特异性引物的设计
ｂｐＨｌ。这就要求将同
源臂序列与抗性基因序列融合的过程中，根据所需 要的靶序列的长度，采用适宜的方法，以提高融合的 效率。 早期，人们通常采用多次克隆，纯化等步骤构建 基因替换盒。对于背景简单的靶基因而言，这种方 法比较实用。但对于丝状真菌而言，要求扩增较长 的同源序列，就需要多次克隆步骤，增加了序列扩增 中碱基突变的可能性，导致克隆效率降低，因此需要
Ｊｉ Ｙｉｎｇ
Ｌｉ Ｍｅｉ
Ｊｉａｎｇ Ｘｉｌｉａｎｇ
（Ｊ何￡以６０ｒｄ细可加ｒ
Ｂ如如ｇ如口Ｚ
ｃＤｎｆｒｏｚ矿肘ｉ厅厶１７），矿Ａｇｒ记Ⅱｚ‘ｕ形，，瑚‘ｉｌｕｌｅ ｏ，Ｐｚ口眦ＪＰｒｏｆｅｃ￡ｆｏｎ， Ｄ，ＡＪｇｒ如Ⅱ如Ⅱｍｆ Ｓｃ诂，ｌｃｅ，曰ｅ彬ｎｇ ｌ０００８ １）
ｃ矗ｉ，ｌｅ５ｅ＾ｃ口ｄｋ，７ｖ
ｍａｒｋ－ｔａｉｌ，３’－Ｒｅｖ；５
７．ｍａｋｅｒ，３’．ｍａｋｅｒ（图１）为引物进
构建打靶载体打靶载体由３部分组成，包
行扩增得到的ＰＣＲ产物分别为５ ７．侧翼序列（带有 与选择性标记基因序列互补的“尾巴”），３’．侧翼序 列（带有与选择性标记基因序列互补的“尾巴”），以 及选择性标记基因（图２）。经电泳检测后，直接进 行第二轮ＰｃＲ：不加任何引物，将５’．侧翼序列，３’． 侧翼序列和选择性标记基因以等摩尔数依次加入反 应体系中（要求３个片段的ＤＮＡ含量在１００一
１
括两端与靶基因两侧同源的同源臂序列以及中间的 选择性标记序列。 真菌中打靶载体的选择标记，通常采用营养选 择性标记基因如ｐｙｒ４、ａｒｇＢ、ｔｒｐｃ和ａｍｄｓ等，以形成 互补受体菌的营养缺陷型。由于工业丝状真菌中相 应营养缺陷型作宿主很难获得，因此后来又开发出 显性选择标记，主要是抗生素标记基因，典型的如潮 霉素、新霉素或腐草霉素和氨基糖苷类抗生素Ｇ４１８ 等旧。，携带此类抗性基因的质粒均可转化到真菌 中，并表现出选择性抗性。此外，对化合物苯菌灵显 示抗性的一些Ｂ．微管蛋白突变基因，绿色荧光蛋白 （ＧＦＰ）近年来也被作为报告基因在丝状真菌基因工 程中得以应用旧－。 通过基因重组进行基因敲除要求已知靶基因两 侧的侧翼序列，但不同生物中所要求的侧翼序列长 度不同。在酵母菌中，仅需要５０ ｂｐ的同源臂序列， 就可以完成与目标基因的融合；但对丝状真菌而言， 则通常需要至少５００一１
０００ ｎｇ，
பைடு நூலகம்
ＢＨ胁疗ｎ
２０１１年第５期
广泛。与其他转化方法相比，ＡＴＭＴ法最大的特点 在于真菌受体的选择比较灵活，可以是原生质体、菌 丝、孢子或者菌体组织。这样就减少了制备原生质 体等复杂的步骤，并且转化效率高，转化子遗传稳定 性好，这就为其广泛应用带来了优势。自１９９５年， Ｂｕｎｄｏｃｋ等…首次成功将这一技术应用到酿酒酵母 菌的遗传转化以来，到目前为止，已有２０多个种的 真菌利用该方法成功地实现了遗传转化¨ｏ。１９９８ 年，ｄｅ Ｇｒｏｏｔ等。９１首次利用ＡＴＭＴ法对丝状真菌（包
ｏｆ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ８ ｏｆ ｔｈｅ８ｅ ｇｅｎｅｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ
ｇｅｎｅ
ｈａｓ ｂｅｃｏｍｅ
ｈｏｔ
ｔｏｐｉｃ ｏｆ ｌｉｆ音ｓｃｉｅｎｃｅ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ，ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ＩＤｕｔｅ，ｆ色ａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｔｅｓｔ ｍｅｔｈｏｄ８ Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：