乳腺癌相关微小RNA的研究进展

乳腺癌相关微小RNA 的研究进展张旖旎　王　爽　丁彦青　(南方医科大学,广东　广州　510515) 〔关键词〕　微小RNA (m icr oRNA,m i RNA );乳腺癌;肿瘤〔中图分类号〕　R74719 〔文献标识码〕　A 〔文章编号〕　100529202(2009)2222972205通讯作者:丁彦青(19502),男,教授,博士生导师,主要从事肿瘤病理学研究。

第一作者:张旖旎(19862),女,八年制在读,主要从事肿瘤病理学研究。

乳腺癌发生机制和癌细胞耐药机制至今仍尚未完全阐明;近年来科研工作者对乳腺癌相关组织或细胞中微小RNA (m i 2cr o RNA,m i RNA )进行了研究,为阐明乳腺癌的发生、发展机制,并对其治疗提供了崭新的思路。

1　m i RNA 简介 m i RNA 是一类长度约为18～25个核苷酸(nucleotide,nt )(平均22nt )的非编码小RNA 分子,通过与mRNA 的3端非翻译区(3′untranslated regi on,3′UTR )结合而介导翻译水平的调控。

m i RNA 基因在RNA 聚合酶Ⅱ的指导下,转录成命名为p ri 2m i RNA 的初级转录物。

然后p ri 2m i RNA 进入由D r osha 酶和辅助因子DGCR8(D isgorge syndr ome critical regi on gene 8)/Pasha 所构成的复合体中,在细胞核中被剪切成长约60～70nt )、具有发夹结构的m i RNA 前体(p recurs or m icr oRNA,p re 2m i RNA )。

在核膜转运蛋白(exportin )25(Exp5)的协助下,p re 2m icr oRNA 从核内被转运到胞质中,经D icer 酶的作用被进一步剪切成21～25nt 的成熟m i RNA 。

成熟的m i O RNA 整合入基因沉默复合体(RNA 2induced silencingcomp lex,R lsc )形成m i R I SC 复合物,通过直接剪切靶mRNA 或者与靶mRNA 的非翻译区互补结合,抑制靶mRNA 的翻译、影响蛋向质的合成,从而来调控多种生物学行为。

m i RNA 涉及的主要生物学领域有:干细胞的分化〔1〕,细胞的凋亡〔2〕,出生缺陷〔3〕以及肿瘤的发生〔4〕。

2　m i RNA 的研究方法 mRNA 的研究方法主要包括两大类,即生物信息学分析和生物学实验方法。

在m i RNA 研究的初期,生物信息学方法发挥了非常重要的作用,可为m i RNA 研究提供有益的线索,指导实验的进行。

而生物学实验则能提供直接而有力的证据,对预测结果加以确认。

二者各有优势,互为补充,有机地将m i RNA 的生物信息学分析方法和生物学实验方法相结合,是m i RNA 研究的合理选择。

211　生物信息学分析方法21111　m i RNA 基因预测　m i RNA 克隆是发现m i RNA 基因的主要方法,但该方法存在许多缺陷,比如由于受所选取的组织样品量的限制,一些低表达量的m i RNA 可能会被遗漏,出现假阴性的结果。

随着人们对m i RNA 结构特点及保守性的逐渐了解,依据m i RNA 在进化过程中的保守性及其茎环结构的前体结构特点编写计算机程序,对m i RNA 进行预测正成为寻找新m i RNA 基因的主要方法。

L i m 等使用M jrScan 软件,分别在线虫和人中鉴定了30个和38个新的m i RNA 基因〔5〕。

M irScan 采用了一种独特的算法,即首先通过RNA fold 软件寻找保守的并且可以形成茎环结构的序列作为候选m i RNA 前体,然后再与已知m i RNA 进行相似性比较,对候选前体评分,得分超过某一设定域值者作为候选的m i RNA 基因〔6〕。

但只有少数候选m i R 2NA 基因已被实验确证:还有些候选基因的表达模式尚未知晓,未检测出其表达,因而出现假阳性结果〔7〕。

21112　m i RNA 靶基因预测　成熟的m i RNA 通过其序列5′端的2～8个碱基(seed 区)与mRNA 上的相应靶点结合,发挥其抑制翻译和诱导mRNA 降解的功能〔8〕。

人们只有先对m i RNA 靶基因进行预测,才能对m i RNA 靶基因开展鉴定和功能研究等后续工作。

从已知的m i RNA 与靶基因的相互作用中,人们发现m i RNA 5′端的seed 区可以与靶mRNA 3′端UTR 区或者CDS 区结合。

因此,这一特点被各种靶基因预测方法广泛采用。

同时结合m i RNA 与靶基因形成二聚体的热力学稳定性和二级结构分析软件,如M Fold 、RNAFold 和RNAhybrid 等,以及将m i RNA 的57端与靶基因的互补情况等作为其他限制条件来进行m i RNA 靶基因预测。

目前,不同研究小组已开发出多个m i RNA 靶基因预测软件,如TargetScan 、m i R 。

anda 、Pictar 、D I A NA 2M icr 。

oT 和m i RBase Targets 等。

不同的预测方法,其程序算法不尽相同,结果很可能有较大偏筹;为减小不同方法带来的偏差,在实际应用中,需要多种算法联合分析。

例如〔9〕:当分析m i RNA 在人血管紧张素I 型受体(h AT1R )基因上的靶位时,m i Randa 软件预测出27个结合位点,TargetScan 预测结果超过37个结合位点,其中有8个位点与m i Randa 结果重复:而应用PicTar 算法,却未找到结合位点。

也有观点表明:至少应由上述两种算法预测出的m i RNA 的结合位点,才对后续的m i RNA 靶位的证明实验有较大意义〔10〕。

212　m i RNA 靶标基因的体外验证　在生物信息学软件预测之后,为了排除预测的无功能位点和进一步对m i RNA 进行功能研究,还需进行m i RNA 靶标基因的确认和鉴定。

该实验过程需先将靶mRNA 完整的3′UTR 序列克隆至S V40启动子驱动的报告基因(通常为萤火虫荧光素酶)的下游,如果一个特定m i RNA 可以与这个靶mRNA3′UTR 相结合,就会抑制报告蛋白的生成,因此可通过检测被抑制的报告蛋白的活性(或表达程度),来判断m i RNA/mRNA之间的交互作用〔10〕。

该方法简单易行,但其只是一种体外验证方法,不能完全模拟体内真实的调控环境。

因此,当探讨特意m i RNA在某一生理或病理过程中的功能、宣召其靶基因时,应选择合适的细胞膜性或其他有效的实验工具。

213　m i RNA与mRNA的共表达及m i RNA对靶蛋白的作用　一种m i RNA只有与其靶基因mRNA在生物体内共表达(co2ex2p ressi on),才能发挥其抑制靶基因表达的功能。

m i RNA与其靶基因是否共表达,可以简单地通过northern bl ot或者荧光定量PCR(qPCR)来证实。

由于Taq M an定量PCR方法操作简便,可重复性强,被推荐为分析特定m i RNA与靶mRNA的常用方法。

例如,生物信息学预测h ATl R基因的3′UT R区存在m i R2155的结合位点,研究者提取了血管平滑肌细胞(VS MCs)的总RNA,并以此为模板进行qPCR检测,分析h ATl R和m i R1155二者是否在特定细胞中存在共表达的现象。

研究结果表明h ATl R和m i R2155均在VS MCs细胞中有表达,并且h ATI R的表达水平受m i R2155的抑制〔11〕。

此外,研究者还可以利用m i RNA对靶蛋白的调控,来证实m i RNA对靶点的作用。

通常是先将存在m i RNA/mRNA共表达的细胞暂时过度的表达所要研究的m i RNA,利用W estern印迹方法分析靶基因所编码蛋白的表达变化,从而进一步验证m i R2 NA对靶蛋白的作用。

除W estern bl ot以外,E L I S A或者免疫化学荧光试验方法也可以用来对蛋白质的表达进行定量的研究。

214　m i RNA生物学功能的研究　如果通过实验能够证实某个m i RNA可以对其靶基因进行相应的调控,则需进一步研究m i RNA的生物学功能。

主要包括细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞迁移等常规生物学方法,还可以通过检测细胞表型改变等间接方法研究m i RNA对蛋白质的影响〔12〕。

3　乳腺癌细胞中m i RNA的相关特征 研究者以乳腺癌细胞系、正常乳腺组织和乳腺癌组织作为研究对象,利用不同方法检测出众多与乳腺癌相关的m i RNA,然后利用某些分子生物学标记和细胞代谢活动的相关数据,推测这些m i RNA的功能。

在乳腺癌中各种m i RNA s的功能不尽相同,对于其功能的分类也会因需要而有所差异;这里我们把乳腺癌相关m i RNA分为癌基因m i RNA和抑癌基因m i RNA两类:当某些m i RNA的表达在肿瘤中升高时,就被看做是癌基因;反之,则为抑癌基因〔14〕。

311　抑癌基因m i RNA31111　m i R2206　m i R2206是I ori o等比较正常乳腺组织与癌组织中m i RNA表达差异时,最早发现的与乳腺癌发生相关m i RNA〔14〕。

m i R2206在乳腺癌中的表达水平和ER的表达成负相关,机制比较复杂,包括蛋白质的磷酸化、乙酰化、S UMO化修饰、多泛素化修饰等。

在ER2α阴性乳腺癌细胞中,其表达量有所上升,提示m i R2206的功能可能与下调ER2α基因的表达有关。

Ada m s等发现:m i R2206可以与ER2α受体mRNA的3′UT R端两个特异序列结合,下调ER2Q的翻译,而不会影响ER2 13基因的表达;同时发现雌二醇(E2)或特异性ER2α激动剂PPT也能明显下调m i R2206的水平。

值得注意的是,ER2α激活剂可以抑制m i R2206的表达,ER2β激活剂或者黄体激素却没有抑制作用,这说明m i R2206对ER2α基因表达的调控网络中存在反馈调节。

此外他们还发现m ir21、let27d也能调控ER2αmRNA的表达水平,提示不同的m i RNA可以调控同一个靶基因〔15〕。

在ER2α阳性乳腺癌细胞中,m i R2206的表达量则明显下降,若再将m i R2206转入雌激素依赖的MCF27乳腺癌细胞中,癌细胞的增殖受到抑制,这同样说明m i R2206对乳腺癌细胞中ER2α的表达的负调控作用〔16〕。

m i R2206可能在乳腺癌恶性转化及其转化过程中ER受体表达缺失导致非雌激素依赖性生长中起调控作用,但具体功能仍有待于进一步研究〔17〕。