组织与细胞化学

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生物显微技术 第三章 细胞化学和组织化学

生物显微技术  第三章  细胞化学和组织化学
❖ 显示脂类的基本原理 :用易溶于脂类的染料, 使之溶于所检的脂质(如脂滴)中,使组织内的 脂类着色.
❖ 常用方法: 苏丹黑B法、油红O法、硫酸尼 罗蓝法 、苏丹Ⅲ染色法等
❖ 基本要求 ⑴ 不用石蜡切片. ⑵ 固定剂一般用Formalin保存磷脂较好. ⑶ 方法: ① 物理法:脂溶性染料,不溶于水,属 偶 氮染料.常用苏丹Ⅲ,Ⅳ,苏 丹黑 ,油红O等. ② 化学方法:硫酸尼罗蓝显示脂肪酸. ③ 选择 性提取法(对照)
❖ 差不多与此同时(1900-1935年),发现疾病组织中出 现的物质变化,更促进了化学技术在病理学染色方法 中的应用,也丰富了在显微镜下显示无机物、色素、 脂类、糖类、蛋白质、核酸等物质的组织化学内容, 此后又出现了酶的组织化学等。由此可见,“组织化 学”一词的含意是随时代而变化的,由定位趋向于与 定量相结合的研究。
❖ 3、灌注固定法:从心血管途径将固定剂灌注到全 身或某一个器官,使细胞保持生活时的状态而不发 生移位,固定后再迅速取材。
三、制 片
❖ 涂片法、石蜡切片法、冰冻切片法 ❖ 最常使用的为恒冷箱冰冻切片法。
四、注意事项
❖ 1、实验所用的器械、器皿都必须清洁无污染。 ❖ 2、配制试剂时应使用双蒸馏水。 ❖ 3、固定、取材都应在冷的环境下进行。 ❖ 4、各种试剂的pH值都要调准,否则影响反应结果。 ❖ 5、所用试剂要纯,都必须达到分析纯(A·R级)。 ❖ 6、同时、同条件情况下做阴性和阳性对照。 ❖ 7、了解和掌握被检组织中所要测定的化学物质或
❖ 以下介绍McGee-Ruseell核固红法。 ❖ 1、操作步骤 ❖ (1) 石蜡切片常规脱蜡至水。 ❖ (2)核固红染液染色2一10分钟。 ❖ 核固红染液的配制:核固红2g,蒸馏水100ml洗涤2次,剩

植物细胞和组织

植物细胞和组织

第一章植物细胞和组织第一节植物细胞一、概述1.概念世界上的植物种类繁多,千差万别,但就其结构来说,所有的植物体都是由细胞构成的。

细胞不仅是植物结构单位,也是功能单位。

细胞并不是生命有机体〔包括植物〕唯一的结构单位,如病毒。

2.发现一般细胞都很小,要用显微镜才能看到。

1665年,英国人Hooke用他改良的显微镜观察软木的结构,发现并命名了细胞。

二、原生质的化学组成构成细胞的生活物质为原生质,它是细胞活动的物质基础。

原生质有着相似的基本成分。

1.水和无机物原生质含有大量的水,一般占全重的60-90%。

幼嫩植株含水60-90%。

种子〔成熟的〕含水10-14%。

水的作用:游离水作为溶剂而参加代谢过程;作为原生质结构的一部分;影响代谢活动;调节原生质温度变化,维持原生质正常的生命活动。

除水之外,原生质中还含有无机盐及许多呈离子状态的元素,如铁、锌、锰、镁、钾、钠、氯等。

2.有机化合物组成原生质的物质有:蛋白质核酸脂类糖类①蛋白质蛋白质分子由20多种氨基酸组成。

由于氨基酸的数量、种类、排列顺序不同,形成各种蛋白质。

蛋白质可以作为原生质的结构蛋白,而且还以酶的形式起重要作用。

例如,使物质分解的淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等。

②核酸生活的原生质都含有核酸,核酸都和蛋白质结合形成核蛋白。

核酸由核苷酸构成。

单个的核苷酸由一个含氮碱基、一个五碳糖和一个磷酸分子组成。

核酸根据含糖不同,可分为含有核糖的核糖核酸〔RNA〕和含有脱氧核糖的脱氧核糖核酸〔DNA〕。

DNA的双螺旋结构。

③脂类但凡经水解后产生脂肪酸的物质属于脂类。

在植物体内,有的作为结构物质,例如磷脂和蛋白质结合,构成细胞的各种膜。

有些脂类形成角质,木栓质和蜡,参与细胞构成。

细胞外表的蜡、木栓层。

④糖类糖类是光合作用的同化产物,参与构成原生质和细胞壁。

细胞中最重要的糖可分为。

单糖:例如:葡萄糖、核糖双糖:例如:蔗糖、麦芽糖多糖:例如:纤维素、淀粉原生质中除上述四大类物质以外,还含有极微量的,但生理作用很大的有机物,称为:生理活跃物质,如:酶、维生素、激素、抗菌素。

组织化学及免疫组织化学.(DOC)

组织化学及免疫组织化学.(DOC)

临床病理学特殊技术第1节组织与细胞化学(histochemistry and cytochemistry)【概念】运用物理和化学的技术方法显示组织细胞结构中的各种化学成分,并对这些化学物质进行定性、定位、定量,从而分析研究生物在生理或病理状态下细胞组织的代谢、机能及形态变化规律。

细胞化学是研究细胞的化学成分及其在细胞活动中的变化和定位的学科。

对细胞中的不同组分进行区别着色是细胞化学中最基础的工作。

组织化学是指利用细胞或组织中的某些化学成分生成有色沉淀物,对细胞组织中的这些化学成分进行定性、定位和定量分析的特殊技术方法。

细胞化学和组织化学的发展是分不开的,都是建立在细胞学、组织学以及生物化学的基础上。

【基本原理】用于组织与细胞化学研究的染料可以是碱性的也可以是酸性的。

酸性染料的生色基团是硝基和醌基;碱性染料的生色基团,包括着偶氮基吲胺基。

染色的原理是基于在酸性染料中具有染色作用的阴离子和细胞内的碱性物质相结合,而碱性染料中的阳离子和细胞内的酸性物质相结合,所以酸性的细胞成分被碱性染料所染色,而碱性的细胞组分则被酸性染料染色。

组织与细胞中的化学成分和其相应的底物呈一系列的化学反应,形成于显微镜下可见到的反应产物呈色。

常见的细胞化学物质成分染色方法见表2-1,组织化学物质成分染色方法见表2-2。

表2-1 细胞化学物质成分的鉴定* 黏多糖类是蛋白多糖分子中的糖链部分,是黏液(人体的粘膜上皮分泌出来的湿滑液体)的主要化学成分。

由于含酸基的不同,而又分为中性黏多糖(中性黏液)、酸性黏多糖(酸性黏液)和混合性黏多糖(混合性黏液)。

多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成,是一类分子机构复杂且庞大的糖类物质。

表2-2 组织化学物质成分的鉴定色素分为人为色素和自生性色素。

人为色素是由于固定剂与组织中某些成分相作用而产生,例如福尔马林色素等。

在某些病理情况下,细胞代谢所产生的沉着的色素,如脂褐素、黑色素、含铁血黄素、嗜银颗粒及组织内的微量金属离子等,需要一些特殊染色加以证明(表2-3)。

生理学 第2章 细胞和基本组织

生理学 第2章 细胞和基本组织
1、有髓神经纤维
2、无髓神经纤维 周围:较细的轴突+施万细胞组成 中枢:无任何鞘膜。
有髓神经纤维
质 2、核仁:通常见于间期,为蛋白质和RNA。 3、染色质:DNA和组蛋白组成(核小体),见于间期
染色体:有丝分裂中期 常染色质功能活跃,异染色质则不活跃。
DNA的功能:①储藏、复制和传递信息。 ②控制细胞内蛋白质的合成。
二、细 胞 的 增 殖
细胞周期:一次分裂结束到下次分裂结束的过程
(一)间期
阴道等器官,具耐摩擦和防异物入侵 作用,修复能力很强。
2、腺上皮: 专门行使分泌功能的上皮。 外分泌腺、 内分泌腺
单层扁平上皮
单层扁平上皮
血管腔面的单层扁平上皮
单层立方上皮
肾脏内肾小管的单层立方上皮
假复层纤毛柱状上皮
复层扁平上皮
复层扁平上皮
(三)细胞间连接
1、紧密连接:防止物质扩散 2、中间连接和桥粒:致密物质和丝状物连接 3、缝隙连接:由6个蛋白质亚单位组成的颗粒
肌原纤维:一条中有上千条肌原纤维。粗、细肌丝组成。 明带(I 带):Z线 暗带(A带):H带中色深的中线为M线。 肌小节:相临Z线的肌原纤维=1/2I+A+1/2I,1.5~3.5(2.0~2.2) M线对粗肌丝固定,Z线对细肌丝固定。
ห้องสมุดไป่ตู้
骨骼肌结构示意图
肌管系统
横管(T管) 肌膜(肌细胞膜)内凹
形成;也参与溶酶体的形成。
5、线粒体:进行细胞的氧化,提供95 的能量。
6、溶酶体:含约50种水解酶,在酸性条件下,对蛋 白质、肽、糖、中性脂质、糖脂、糖蛋白、核酸 等进行水解。
尚有微管、微丝、中心粒等细胞器。与其他细胞器 的位移、分泌颗粒的运动、微绒毛的收缩及细胞的 运动有关。

细胞化学染色

细胞化学染色

细胞化学染色细胞化学染色2011年03月02日老三届极品居认真做事,低调做人。

记住该记住的,忘记该忘记的,改变能改变的,接受不能改变的。

一、概述细胞化学是组织学的一个分支,是在细胞形态学的基础上研究细胞的生物化学成分,及其定位、定量及代谢功能状态的学科。

在细胞形态学的基础上,运用化学反应的原理对血细胞内的各种生化组成及其代谢产物(酶类、脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等)作定性、定位、半定量分析的方法。

细胞化学染色临床上主要用于:①辅助判断白血病的细胞类型。

白血病的诊断以形态学为基础,但有时仅采用瑞式染色是难以判断白血病细胞的类型的。

不同的细胞系列,其所含的化学物质成分、含量及分布各不相同,随着细胞的分化阶段及病理生理状态变化,这些物质的含量也会发生相应改变。

因此根据细胞化学染色结果的不同,可推断细胞的所属系列。

因此临床上细胞化学染色成为辅助诊断白血病必要的、有力的手段。

②其他血液系统疾病的诊断和鉴别诊断。

在病理情况下,血细胞的化学物质的成分及含量会发生改变,据此可以辅助疾病的鉴别诊断。

如中性粒细胞碱性磷酸酶染色、铁染色等。

③观察疾病的疗效和预后。

当病理状况纠正后,血细胞的化学物质的成分及含量会发生改变。

④发病机制的研究。

细胞化学染色的基本步骤为固定、显示及复染。

1、固定为了保持细胞结构及化学成分的不变,需要对细胞进行固定。

根据染色的成分不同,选择合适的固定液,使细胞内的蛋白质、酶类、糖等变成不溶性物质。

固定的方法有物理法和化学法,临床常用化学法固定。

物理法包括干燥和火焰固定,化学法包括甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等固定。

采用蒸气或液体固定。

(1)蒸气固定:甲醛是常用的固定剂,极易挥发、氧化,常用40%甲醛蒸气固定。

方法为在封闭的玻璃器皿中加入40%甲醛,将涂片血膜朝下,固定5~10分钟。

(2)液体固定:将涂片浸在甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等固定液中,也可将两种或两种以上固定液混合,如10%甲醛甲醇液,甲醛丙酮液等。

现代组织化学组织化学

现代组织化学组织化学
5. 酶类:
通过显示酶的活性来检测酶的存在。
常用光镜酶组织化学 显示法反应原理
酶组织化学基本反应原理
酶特异性底物 + 相关捕获剂
(孵育液内)

(组织细胞内)
反应产物沉淀(有色)
镜下观察
反应产物沉淀(无色)+置换剂 有色沉淀
1、金属-金属盐显示法
方法Ⅰ:钙-钴法
R-PO4Na2 +
H2O
CaCl2 酶作用
R-OH + CaHPO4
(无色沉淀)
CaHPO4 Co(NO3)2 Co3(PO4) 2
Co3(PO4) 2 (NH4)2S CoS ↓(显色)
1、金属-金属盐显示法
方法Ⅱ:铅法
Pb2+
R-PO4Na2 + H2O 酶作用 R-OH + PbHPO4
PbHPO4 (NH4)2S PbS ↓(显色)
2%CaCl2 5%MgSO4 双蒸水
10 ml 10 ml 20 ml 1 ml 5 ml
酸性磷酸酶(ACP)
1、反应原理(铅法):
R-O-PO3Na2 (β-甘油磷酸钠)
ACP pH 5.0
R-OH + H3PO4
H3PO4 + Pb2+ Pb3(PO4)2 + (NH4)2S
Pb3(PO4)2 PbS↓(棕黑色)
N—N—C6H5 酶作用 N=N—C6H5 +2H C6H5—C
N—NH—C6H5 + HCl
N=N—C6H5
四唑盐(无色)
甲月朁 (红色)
3、色素形成法
II、靛酚蓝法:
H3C CH3 N
+

细胞(组织)化学和免疫化学染色技术

细胞(组织)化学和免疫化学染色技术

细胞(组织)化学和免疫化学染色技术细胞化学(cytochemistry)或组织化学(histochemistry),是细胞学(cytology)或组织学与生物化学(biochemistry)相结合的一门科学。

细胞化学染色(cytochemical staining)是在血细胞的原位上研究其化学成分的性质,包括蛋白、脂类、糖类、无机盐和酶等,在保持细胞形态的基础上进行化学的定位、定性及半定量的观察,是血液病形态学诊断中的一个重要手段。

细胞免疫化学(immunocytochemistry)又称免疫细胞化学或免疫组织化学(immunohistochemistry)染色,是鉴定某些细胞或组织的病态细胞(如微小巨核细胞)和白血病的重要的辅助性检验技术。

一、涂片细胞化学和免疫化学染色技术(一)细胞化学染色1.铁染色正常骨髓中存在一定量的贮存铁,以含铁血黄素的形式贮存,多分布在巨噬细胞内,称为贮存铁。

骨髓中幼红和晚幼红细胞含有铁颗粒,为细胞内铁,含内铁的细胞称为“铁粒幼细胞”,少数成熟红细胞也含有小的铁颗粒,称为“铁粒红细胞”。

以上铁质均可用普鲁士蓝反应加以显示。

(1)原理:骨髓内含铁血黄素的铁离子和幼红细胞内的铁颗粒,在盐酸环境下与亚铁氰化钾作用,生成蓝色的亚铁氰化铁沉淀(普鲁士蓝反应),定位于含铁粒的部位。

(2)试剂:铁染色液(临用时配制):200g/L亚铁氰化钾溶液5份加浓盐酸1份混合;复染液:1g/L沙黄溶液。

(3)操作:取新鲜含骨髓小粒的骨髓涂片,于铁染色架上,滴满铁染色液;室温下染色30分钟,流水冲洗,复染液复染30秒;流水冲洗,晾干后镜检。

(4)结果判定1)细胞外铁:细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小珠状或团块状,细胞外铁主要存在巨噬细胞胞质内,有时也见于巨噬细胞外。

“-”为涂片骨髓小粒全无蓝色反应;“+”为骨髓小粒呈浅蓝色反应或偶见少许蓝染的铁小珠;“++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的片状或弥散性阳性物;“+++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的密集小块或成片状;“++++”为骨髓小粒铁粒极多,密集成片。

植物细胞和组织_植物学

植物细胞和组织_植物学
植物细胞和组织
第一节 植物细胞
细胞的概念 细胞(Cell): 是生物体形态 结构和生命活动的基本单位。
图解:植物细胞的超微结构
一、细胞的发现及细胞学说
1.1665年,英国人虎克观察软木切片,
发现并命名了细胞,实际上他看到的只是 植物细胞的细胞壁。
(右图为英国光学仪器修理师虎克用自制显微镜观察到的 “细胞”,其实为植物的细胞壁和空腔.)
图解:叶绿体结构
结构:双层膜
主要功能是:光合作用的场所 光合作用方程:
光合 6nCO2+6nH2O →→ 作用
nC6H12O6 + 6nO2↑
2)有色体(杂色体)
色素:主要含类胡萝卜素。
结构:双层膜
功能:有利于传粉,积累脂类和淀粉。 存在位置:主要存在于花瓣、果实中 叶片中含量较少
3)白色体
白色体是不含可见色素的无色的
近透明、均匀一致的胶体状态。
细胞器悬浮在胞基质中,为胞基质提 供支持骨架。胞基质为维持细胞器实体
的完整性提供必要的离子环境,为细胞
器施行功能提供必要的物质。
胞基质
胞质运动:生活细胞的胞基质,在细 胞内经常流动称为胞质运动。
包括循环运动和旋转运动两种方式。
细胞器
1.质体
质体是与碳水化合有关的细胞器,是绿色植
细胞学说的主要内容:
1)植物和动物的组织都是有细胞组成的。
2)所有的细胞是由细胞分裂或融合而来。
3)卵和精子都是细胞。 4)一个细胞可以分裂而形成组织。 意义:十九世纪自然科学的三大发现之一, 是一切生物的基础。
光学显微镜的分辨率:0.2um,放大倍数为1200倍电镜:
1A,放大倍数为100万倍
3)次生壁

细胞化学与组织化实验一~实验四

细胞化学与组织化实验一~实验四

一 、实验目的
掌握细胞内碱性蛋白的鉴别方法并了解碱性 蛋白在细胞内的分布。
学会制作血涂片并掌握制作技巧。
细胞化学与组织化实验一~实验四
二、实验原理
由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目 不同,在pH值不同的溶液中,蛋白质分子所带的净电 荷多少不同。如在生理条件下,整个蛋白质所带负电 荷多,则为酸性蛋白质;带正电荷多,则为碱性蛋白 质。据此,可将标本经三氯醋酸处理提出核酸后用不 同pH值的固绿染液分别染色,细胞内的酸性蛋白和碱 性蛋白质显示出来。
细胞化学与组织化实验一~实验四
A液(0.2mol/L乙酸液):冰醋酸1.2ml加蒸馏水100ml 。 B液(0.2mol/L乙酸钠液):NaAc.3H2O 2.72g加蒸馏 水至100毫升。 取A液30毫升+B液70毫升+蒸馏水300毫升。 6)6%淀粉肉汤:牛肉膏0.3g ,蛋白胨1.0g,NaCl 0.5g,可溶性 淀粉6.0g,蒸馏水100ml,煮沸灭菌,4℃保存,使 用时热水浴融化。
4.使用药品、试剂和各种药品注意节约,爱护器 材。洗涤和使用仪器时应仔细,防止损坏仪器。 严格遵守 仪操作规程,在未知正确操作程序时, 不要独自使用,须在老师的指导下进行。
细胞化学与组织化实验一~实验四
5.实验废弃物、毒害性实验材料应倾倒在指定地 点,统一处置。 6.实验时一律穿工作服,不允许穿拖鞋进实验室, 以免溅落的腐蚀性药品或掉下的玻璃器皿伤 及裸露的皮肤。 7.节约水、电、气,燃气灯应随用随关。最后离 开实验室时,要将室内检查一遍,关好水、电、 气,锁好门窗。 8.实验室内一切物品,未经本室负责教师批准, 严禁携出室外。借物必须办登记手续。 9.实验结束,将实验记录交指导教师审阅并做好 室内清洁工作。
细胞化学与组织化实验一~实验四

组织与细胞化学技术-2

组织与细胞化学技术-2
生物素等
试剂方面:因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯或标记过量等
消除方法
A. 加 1抗前加正常血清10~30分,以封闭组织中带电荷的基因,避免与1抗的非 特异性结合。
B . 减少非特异性染色: a.免疫酶组化染色时,加1抗前,用0.3%的H2O2甲醇溶液将组织切片处理30分 (3%H2O2甲醇溶液,5~10分) b.免疫荧光染色时,用0.01~0.05%伊文思蓝稀释荧光抗体
2. 根据标记物是否与特异性第一抗体结合分类
(1)直接法 (2)间接法,灵敏度高于直接法。
附:免疫组织化学标本制备过程及要求 1. 取材
实验动物:麻醉 (处死〕,锋利刀片切成大小适中,厚度3mm- 4mm; 小型实验动物:灌注(流)固定(生理盐水和4%多聚甲醛) 取材
人体材料:活检组织、手术标本、细胞和组织
特性 组成 特异性 亲和力 交叉反应
单克隆抗体与多克隆抗体特性比较
多克隆
单克隆
多种类抗体的混合物
单一种类的抗体
低针对多个抗原决定族 高针对单一的抗原决定族
平均亲和力较高
不定,较低


五、抗原与抗体特异性结合特点
抗原与抗体的结合具有高度的特异性。在抗体的轻链和重链的可 变区中有3个特殊的易变部位,即在第30位、50-60位和第100位氨基酸 残基附近,这些部位称为超变区。超变区直接参与抗原接合部位的组 成,形成的接合部位是一个浅平穴槽,槽大小约I.5nm×0.6nm×0.6nm 抗原决定族在空间呈互补性地嵌入槽内,借分子间的范德华力、疏水 作用静电引力以及氢键而相互结合。
组织化学技术分类及基本要求
分类
1. 化学方法:在组织切片上生成沉淀以表示定性定位的存在 2. 类化学方法:用特异性染色显示,如胭脂红显示糖原 3. 物理学方法:用荧光分析、组织吸收光谱等研究组织细胞内的化 学成分 4. 显微烧灰方法:对组织中无机物质和微量元素进行测定 5. 免疫学方法:用免疫学原理 6. 分子生物学方法:如原位杂交组织化学技术

细胞与组织

细胞与组织
2. M1受体拮抗药:哌仑西平 3. 胃泌素受体拮抗药:丙谷胺
4. 质子泵抑制剂(PPI):(常用)
奥美拉唑,商品名洛赛克(Losec) 雷贝拉唑,商品名波利特 兰索拉唑、泮托拉唑、埃索美拉唑
膜糖类
形式有糖蛋白或糖脂,具有免疫标志、 传递信息等功能。
糖链存在特异性:AB、包埋在其中的细胞器
主要的细胞器:
内质网 核蛋白体/核糖体 线粒体 高尔基(复合)体 溶酶体 中心粒
内质网、核蛋白体/核糖体
内质网:分布在细胞质中的膜性管道系统。
核蛋白体:rRNA和蛋白质构成的椭圆形小体,
是细胞内蛋白质合成的主要构造。
核蛋白体举例 人体解剖生理学与药理学的关系举例
(注意:不要混淆“载体”与“受体”)
(3)酶:体内生化反应都需酶的催化。 (4)与免疫有关。
膜蛋白质 作为通道
膜蛋白质作为受体
举例膜蛋白质作为受体、酶、离子泵
胃腔
胃壁细胞 H2受体 M1受体
胃酸分泌的机制:
胃壁细胞(又称盐酸细胞) 上有3种与胃酸分泌有关的
受体:H2、M1、胃泌素 受体。
当这些受体激动时,产生 一系列生化过程,最终激
钠-钾依赖式 ATP酶
[Na+]i↑或[K+]o↑时,激活钠泵
入胞和出胞
大分子或物质团块进、出细胞的形式
入胞:又称内吞
进入物质是固体,称吞噬 进入物质是液体,称吞饮
出胞:又称胞吐
入胞过程
受体对物质的“辨认” 受体底物特异性结合=复合物
复合物向细胞膜移动 细胞膜处的膜凹陷
凹陷膜与细胞膜断离=吞食泡 吞食泡与胞体内的 膜性结构相融合
核膜:
上有核孔,核孔是核与细胞质进行物质交换的孔道。 核内形成的RNA可以经核孔进入细胞质。

组织化学与细胞化学技术

组织化学与细胞化学技术

(一)直接法
是以荧光标记抗体直接与被检标本内的抗原反应。 依据荧光出现的位置及强弱对被检细胞做出判别。该法的 优点为简单特异。但其缺点也很明显即敏感性较低另需制 备大量特异性的荧光抗体。
(二)间接法
间接法采用抗球蛋白试验原理,先制成荧光素标记抗抗 体。检测中先将特异性抗体与被检标本作用一定的时间 后,充分洗去未结合的游离特异性抗体,然后添加荧光素 标记抗抗体使之形成被检抗原-抗体-荧光素标记抗抗体 复合物,由此显示特异荧光并因复合物上带有较多荧光 标志物,所以其敏感性比直接法要高。
neutrophil alkaline phosphatase ,(NAP)
1.原理
细胞内碱性磷酸酶在碱性环境下水解磷酸萘酚,使 之释放出萘酚,后者与重氮盐偶联形成有色沉淀物。 定位于酶活性所在处。
2.参考范围 :
中性粒细胞碱性磷酸酶活力正常范围2%~56%, 积分 4~80 分 /100个中性粒细胞
组织化学技术: 应用化学、物理、生物化学、免疫学或分子生物
学的原理和技术与组织学相结合而产生的技术,能在 组织切片定性、定位地显示某种物质的存在与否以及 分布状态。还可进一步用显微分光光度计或图象分析 仪测定光镜切片中该物质反应的强度,获得定量的信 息。
细胞化学技术: 应用组织化学技术于游离细胞的样品(如细胞涂 片),则称细胞化学技术。
一 组织细胞化学染色
组织细胞化学染色是将形态和功能相结合的细胞科 学。它是在保持完整的细胞形态和细胞结构的前提下, 运用化学反应将被检细胞内的各类化学成分和细胞结构 及生理活性物质原位地显示。因而对于探索化学成分、 生理功能、新陈代谢及细胞生理和病理改变有着重要的 意义。
组织细胞染色的范围一般可分为:蛋白质类(氨基 酸)、核酸类、多糖类、脂类、盐类或金属类,采用的 方法通常为化学结合物理溶解显示及酶-底物反应。

组织学与胚胎学的研究方法

组织学与胚胎学的研究方法

组织学与胚胎学的研究方法组织学与胚胎学的研究离不开显微镜,由于光学显微镜的改进和电子显微镜的广泛应用以及新研究方法的不断出现,近年来发展十分迅速,现仅就几种主要研究方法,简单介绍如下:1.固体组织的研究方法:应用一般光学显微镜,观察组织切片是组织学研究的最基本方法。

取动物新鲜组织块,用固体液浸泡(常用固体液:酒精、甲醛、苦味酸等),使组织中的蛋白质迅速凝固,以保持生活状态下的结构。

固定好的组织再经脱水、透明等步骤后包埋于石蜡中,包埋好的组织块用切片机切成5-7um厚的薄片。

贴于载玻片上,然后脱蜡、染色。

为了显示不同结构可采用不同的染色方法。

常用的为苏木精(hematoxylin)伊红(eosin)法,简称H·E染色或普通染色。

经染色的标本最后用树胶加盖玻片封固,制成永久标本。

在教学中我们观察的切片大部分用这种方法制成。

有些液态组织如血液可用涂片方法制备标本。

有些组织本身很薄(如腹膜、疏松结缔组织),可制成薄层张片标本。

涂片和张片也要经过固定、染色等步骤。

2.活细胞的研究方法:观察生活状态的细胞常用组织培养(tissue culture)方法。

组织培养也称体外实验,在无菌条件下,把活细胞或活组织放在体外适宜的环境中培养成活,对培养的细胞可附加各种条件(如温度、激素、药物等)对细胞直接影响,观察细胞运动、吞噬、分化、繁殖等的变化。

组织培养是研究活细胞的最好方法。

在培养皿内分离出单个细胞,进行培养后可获得由单个细胞繁殖的纯细胞株,成为克隆(clone),克隆技术广泛应用用于生物学、医学、胚胎学各个领域,成为研究遗传学、细胞免疫、病毒、肿瘤防治等重要手段。

细胞融合(cell fusion)是用人工方法将两个或两人以上的细胞合并成一个新细胞的技术。

有的新细胞具有很强的生命力,可培育出新的动物杂交品质,其应用前景非常广阔。

3.组织化学和细胞化学方法:组织化学和细胞化学方法,是通过化学或物理反应形成有色沉淀来显示组织细胞内的化学成分。

中国组织化学与细胞化学

中国组织化学与细胞化学

中国组织化学与细胞化学
组织化学和细胞化学是几乎所有生物科学研究的基础。

它使人们更好地理解营养、新陈代谢、免疫、再生、发育和调节其他生物过程等。

中国组织化学和细胞化学的研究发展史也是极其丰富多彩的。

早在20世纪初,勤苦勤勉的中国科学家们就把中国组织化学和细胞化学研究发展推上了有史以来蓬勃兴起的新高潮,而他们的研究努力也为中国的组织化学和细胞化学的学术发展开辟了广阔的必争之路。

比如,早在1920年,中国人古德门士先生对中国人古长空蛋白进行了首次诊断测定,他的成果令世界震惊,也奠定了中国组织化学的研究基础。

此外,中国学者们还在组织化学和细胞化学的研究领域中取得了突出的成就。

比如,中国科学家以诱人的研究方法探索了噬菌体生物特性、多糖结构及其功能等复杂问题,也被国际学术界广泛认可。

同时,中国在细胞分化及保护调节机制、基因修饰、细胞分子及疾病治疗领域也做出了突出贡献,开展了新事业。

在最近几十年,中国投入了大量资源和技术力量,关注组织化学和细胞化学的研究开发。

许多备受赞誉的研究成果都是中国科学家们努力力作的结果,如如基因突变、细胞信号转导机制和细胞凋亡等基本研究;而且,中国科学家们还积极参与发育植物、动物及微生物的组织化学和细胞化学研究,取得了显著的成就。

未来,中国将继续坚持走科学、可持续发展之路,将继续将技术力量投入到组织化学和细胞化学的研发领域中,将全力以赴,努力促进国家的儿童发展,为全球社会及生态家园做出贡献。

总之,在过去的数十年里,中国科研人员在组织化学和细胞化学研究领域取得了显著成就,而且未来也将积极参与组织化学和细胞化学的研究和应用,从而不断推进组织化学和细胞化。

组织学的主要研究方法有哪些

组织学的主要研究方法有哪些

一、组织学的主要研究方法有哪些?答题要点:1.常用光镜标本制备技术切片标本的制备。

这是最常用的方法。

应用光学显微镜观察机体各部的微细结构时,首先应把所有要观察的材料制成薄片,最基本的就是切片方法,其中石蜡切片更为常用。

其制备程序大致如下:(1)取材与固定。

将所要观察的人体或动物的新鲜材料切成适当的小块,立即浸入固定液(如甲醛溶液等)中进行固定,防止离体后结构发生变化,使其尽可能保持活体时的结构状态。

(2)脱水与包埋。

为了使石蜡能浸入组织内,把固定好的材料用乙醇等脱水,经二甲苯透明后,再浸入加温溶化的石蜡中浸透包埋使组织块变硬。

(3)切片与染色。

将包埋的组织蜡块,用切片机切成5-10μm左右的薄片,贴在载玻片上,脱蜡后进行染色。

最常用的染色法是苏木精和伊红染色,简称HE染色。

(4)封固。

在切片上滴加中性树胶,用盖玻片进行封固,保存备用。

在制作较硬组织(如骨组织等)或较大组织器官(如眼球)等切片,可用火棉胶代替石蜡进行浸透包埋,再进行染色。

为了较好地保存细胞内酶的活性,可选用冰冻切片,将组织在低温条件下快速冻结,直接切片,进行染色。

2.涂片、铺片、磨片标本的制备血液等液体材料,可直接在玻片上涂片,干燥后再进行固定和染色。

疏松结缔组织和肠系膜等薄层组织,可在玻片撕开展平,制成铺片,待干燥后进行固定和染色。

骨和牙等坚硬组织除用酸(稀硝酸等)脱钙后再按常规制成切片外,还可直接研磨成薄的磨片进行染色观察。

3.组织化学和免疫组织化学方法组织化学与细胞化学是应用物理、化学和免疫学方法,对组织、细胞内某些化学成分的定性、定位和定量进行研究,从而探讨与其相关的机能活动。

(1)组织化学。

其原理是在组织切片上或被取材料上,加某种试剂,使它与组织或细胞内某些物质起化学反应,形成最终反应产物。

光镜组织化学要求其最终产物是有色的沉着物;电镜细胞化学要求其最终产物是重金属沉着物。

观察其沉着物的颜色、深浅或电子密度,可对某种物质进行定性、定位和定量。

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(一) 设计
1、 确定特征物 即根据研究的目的确定研究指标,如器官、组织、细胞、结构等
2、 选择参数 参数的选择主要由研究目的决定。确定研究的目的,即建立要检测的假设,希望得到什么样的结果,将要说明什么问题等。
常用参数:绝对参数(体积、表面积、长度、数目)——与参照系大小无关的参数,有单位,更具说服力;相对参数(体积分数、表面积密度、长度密度、数密度)——与参照系大小无关的参数,指单位体积内的量占多少比例。
由于核酸探针的种类和标记物的不同,在具体应用的技术方法上也各有差异,但其基本方法和应用原则大致相同。大致可分为:
①杂交前准备,包括固定、取材、玻片和组织的处理,如何增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等;② 杂交;③ 杂交后处理;④ 显示(visualization):包括放射性自显影和非放射性标记的显色。
? Caspase特点:以酶原的形式存在、酶活性依赖于半胱氨酸残基的亲核性、水解天冬氨酸C端肽键。.Caspase可激活CAD (caspase-activated DNase)核酸酶,该酶在核小体的连接区将DNA切断,形成约200bp整倍数的核酸片段。
? 正常情况下, CAD与抑制物ICAD-DFF-45结合,存在于胞质中,无活性。Caspase活化后降解抑制物ICAD, CAD激活并入核降解DNA使其片段化。
细胞凋亡与坏死的最大区别为前者的细胞膜保持完整,而后者的细胞膜破碎。PI(碘化丙啶)作为一种可嵌入DNA双链的红色荧光物质,不能通过完整的细胞膜,因此对活细胞和早期凋亡的细胞不能染色,但可进入坏死细胞(包括晚期凋亡细胞),使其发出红色,因此通过荧光素标记的Annexin V和PI对细胞进行双染色,可将早期凋亡细胞,活细胞和坏死细胞区分开来。
(2)流式细胞计是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速存储、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量,并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群分选出来。
(3)图像分析技术包括自动图像分析仪和人工图像分析仪。
8、体式学技术的基本方法
体式学定量研究的基本步骤有三步:获取要测量的组织图像;在图像上叠加或叠映测格,然后进行点技术等测试;将测试结果代入相应公式,经简单的数学运算后得出估计结果。
(2)Caspase非依赖的细胞凋亡(Caspase-independent apoptosis)
? a凋亡诱导因子(AIF):
线粒体蛋白AIF释放到胞质内与抑制凋亡的因子结合,从而促发凋亡
? b钙超载:
胞浆(Ca2+)↑ →激活核转录因子,加速凋亡相关基因的转录 激活Ca2+/Mg2+依赖的核酸内切酶,降解DNA链 激活谷氨酰胺转移酶,使细胞骨架分解→凋亡小体 →细胞凋亡
(7) 注意选择适当的显微镜放大倍数。
(8) 做一试点研究或实际考察对于抽样设计是很有用的,尤其是对于一项新开始的研究。
3、线粒体膜势能的检测
线粒体荧光染料:Rhodamine 123、DiOC6(3)、JC-1、TMRM等对线粒体膜电位非常敏感,其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。
4、DNA片段化分析
细胞凋亡时染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成180?200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。
凋亡的生理学意义:
1、胚胎发育期去除某些细胞
2、维持内环境稳定 增殖细胞群中细胞去除、去除潜在有害的自身反应性淋巴细胞
3、参与防御反应 细胞毒T细胞
细胞凋亡在疾病防治中的意义
㈠ 合理利用凋亡相关因素
1. 诱导靶细胞凋亡
放疗、化疗(抑制Bcl-2抗凋亡作用 促进促凋亡基因作用 增强P53促凋亡作用)
6、所有参加反应的试剂都不能与组织细胞内除了所检测的酶以外的任何成分自行吸附和结合
2、 凝集素ABC法能够特异显示组织标本中什么成分,原理是什么?
能与细胞膜的游离面和胞内膜嚢内表面上的特异性糖结合,同时又可与荧光素、HRP、铁蛋白、胶金体、铁蛋白、生物素结合,使膜上单糖可视化
3、 原位杂交组织化学基本技术和步骤。
(4) 抽取切片、视野等研究一定条件下的某种生物器官时,实际用于计算平均估计值、标准差等的样本是生物器官构成的样本,样本含量就是生物器官的数目。
(5) 阶段抽样的重点是较初级阶段的抽样。阶段抽样的原则是:宁多而粗,勿少而精。
(6) 样本含量是否足够的经验判断方法是:看最终计数的测点数是否接近于100~200个。若已达100~200个,则样本含量往往已足够。
(3)非特异性染色特征
组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称非特异性背景染色。
常出现在切片边缘、刀痕或皱褶区域,坏死或挤压的细胞区,表现为无一定的分布规律,常呈现某一部位成片的均匀着色。
(4)免疫组化染色结果的定量分析
6、细胞凋亡免疫学原理及其检测方法
凋亡机制:
(1)Caspase依赖的细胞凋亡
2、 抽样设计的注意事项
(1) 确定总体或参照空间,样本要取自整个参照空间。
(2) 样本含量不是由参照空间的大小确定的,而是由特征物在参照空间内的分布情况、抽样方法和拟获得的一定的准确性确定的。
(3) 研究样本并非为研究而研究,而是为了研究或推论其发源地——总体。因此,样本的抽取应该是随机的,应排除主观影响。
(二) 抽样
抽样的原则是随机原则或等同可能性原则。
抽样方法主要有单纯抽样、等距抽样、加权抽样、分层抽样、阶段抽样和各项同性抽样六种形式。常用的是单纯抽样和等距抽样。
抽样设计的考虑:
1、 理想的抽样 即抽样方法和样本含量理想的抽样。理想的抽样方法必须是随机的,不同情况下选择合适的抽样方法,而刚好能获得被认为是准确、可靠的估计的样本含量就是理想的样本含量。
蛋白酶K的消化作用在原位杂交中十分重要。蛋白酶K还具有消化包围靶DNA的蛋白质的作用,从而提高杂交信号。
(2)减低背景染色
a、酸酐和稀酸处理
稀酸处理能使碱性蛋白变性,如再结合蛋白酶消化,即可将碱性蛋白移除,这样不仅能增强靶核酸探针的可及性,也可避免碱性蛋白与核酸之间的非特异性结合,达到解降低背景的目的。
5、免疫组织化学的结果判定
免疫组化的呈色深浅可反映抗原存在的数量,可作为定性、定位和定量的依据。
(1)阳性反应的染色特征
阳性反应染色分布有四种类型:细胞间质、胞浆、细胞核、细胞膜表面。
阳性细胞分布呈灶性和弥漫性。由于细胞内含抗原量不同,所以染色强度不一。如果细胞之间染色强度相同,常提示其反应为非特异性。
光学显微镜和倒置显微镜
未染色细胞:凋亡细胞V变小、变形,细胞膜完整但出现发泡现象,晚期可见凋亡小体。
染色细胞:常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化,呈新月状附在核膜周围。
荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜:一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有:HO ,Hoechst 33342;HO, Hoechst 33258; DAPI。
(5)显示:放射性同位素标记探针的显示、非放射性标记探针的显示
4、原位杂交组织化学中杂交前准备如何操作?
杂交前处理主要包括增强组织的通透性、减低背景染色两个方面。
(1)增强组织的通透性和核酸探针的通透性
增强组织通透性常用去污剂或某些消化酶处理,通过这种处理,可广泛地去除蛋白质而增强组织的通透性和探针的穿透性。常用的去污剂是Triton-X100,一般都将切片浸入含0.2~0.5% Triton X-100的PBS内15min。
b、预杂交
以阻断标本中可能与探针产生非特异性结合的位点,达到减低背景染色的目的。
c、内源性生物素和酶的抑制
组织中内源性生物素、过氧化物酶或AKP则应事先阻断。标本可用不标记的卵白素-生物素孵育,以阻断内源性生物素。杂交前蛋白酶消化有利于消除内源性生物素的干扰。
用5%脱脂奶粉缓冲适宜的盐液来稀释标记的卵白素以及将标记标本浸于含2%牛血清白蛋白的缓冲液,均可防止或抑制标记的卵白素与组织标本之间的非特异性结合。
1、 酶显示过程当中注意事项。
1、对标本的处理或者制片不能影响酶的活性和分布
2、所选择底物和辅助物必须能迅速同步的渗透到组织和细胞中去
3、所选择的底物最好能只被一种酶催化分解
4、所选择辅助物不影响酶活性和其他反应剂穿透进入细胞
5、FRP必须能够迅速与辅助物进行反应且FRP物质为水不溶性有色而稳定的物质
电子显微镜观察
电镜观察:凋亡细胞体积变小,胞质浓缩。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕,出现许多空泡结构。IIa染色质高度凝集、边缘化。凋亡晚期,细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。
2、磷脂酰丝氨酸外翻分析(Annexin V法)
Phosphatidylserine(PS)
正常位于细胞膜的内侧,在凋亡早期从细胞膜的内侧翻转到膜表面
步骤:(1)原位杂交组织化学标本的制备:取材、固定、切片
(2)杂交前处理:包括增强组织的通透性和核酸探针的通透性和减低背景染色两个方面
(3)杂交反应:杂交液的成分与预杂交液基本相同,所不同的是加入了标记的核酸探针。
(4)杂交后处理:杂交后处理的目的是除去未参与杂交体形成的过剩探针,除去探针与组织标本之间的非特异性结合,包括与那些与靶核酸相似的序列与探针之间形成的含非互补碱基对的杂交体,从而减低背景。杂交后处理主要包括系列不同浓度、不同温度的盐溶液的漂洗。
Annexin-V:
Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素(FITC、R-PE)标记后作为探针,利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。
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