平末端DNA随机连接构建重组质粒

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ligation independent cloning-分子克隆技术

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TEV酶切位点：ENLYFQ^S
TGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCT CTCACCATCACCATCACCATGAAAACCTGTACTTCCAATCCAATATTGGAAGTGGATAACGGATCCGCGATCG
整理课件
Ligation-independent cloning
1
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经典的克隆方法
经典的克隆方法，主要分为以下两种：(1)粘性末端连接，即载体质粒和待插入的外源片段都通过合适的限制性内切酶切割，产生相互匹配的粘性末端，然后在连接酶作用下重新形成磷酸二酯键而得到环化的重组质粒；(2)平末端连接，平末端连接中，载体和片段均为平端，都没有粘性末端突出。
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LIC方法的特点
➢ LIC方法依赖于T4 DNA Polymerase的核酸外切酶活性，这样就要求被处理的线性载体和片段的末端仅含有3种碱基，这样才可以有效控制反应以产生特定大小的粘性末端。要求载体有较固定的粘性末端，且对于如何使载体线性化有特殊的要求。
➢ LIC方法的优势在于： (1)待克隆的PCR片段不需要限制性内切酶处理。这样就省去了在设计引物时考虑
特定的dNTP存在的缓冲液条件下反应，插入片
段能产生10~15个碱基的粘性末端(Aslanidis and
de Jong,1990)。载体和PCR片段依靠长的粘性末
端重组，此过程不需要连接酶。这种克隆方法不
需要考虑插入片段的序列，任何基因都能被克隆
到该载体中。而且，整个流程简单到不需要任何

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定

第二次分子生物学实验报告DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定一、实验目的1、学习和掌握限制性内切酶的分类、特性与作用原理，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作技术。

2、学习利用T4 DNA 连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA 片段连接起来，构建体外重组DNA 分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方法。

3、掌握利用CaCl2 制备感受态细胞的方法；学习和掌握热击法转化E. coli 的原理与方法。

4、学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。

5、学习和掌握使用试剂盒抽提质粒的方法；6、复习琼脂糖凝胶电泳的原理和方法；7、通过对重组子进行重组质粒DNA 的抽提与酶切鉴定，进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA 片段，并验证重组子是期望的重组子。

二、实验原理1、限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。

在限制性核酸内切限制酶的作用下，侵入细菌的“外源”DNA 分子便会被切割成不同大小的片段，而细菌自己固有的DNA 由于修饰酶(通常是一种甲基化酶)的保护作用，则可免受限制酶的降解。

目前已经鉴定出3 种不同类型的限制性核酸内切酶，即Ⅰ型酶、II 型酶和III 型酶。

Ⅰ型酶切割位点是随机的，至少距识别位点1000bp。

Ⅲ型限制酶的切割位点距识别序列3'端为24—26bp。

Ⅱ型限制酶的切割位点一般在识别序列上或与之靠近，而且具有序列特异性，故在基因克隆中有特别广泛的用途。

Ⅱ型核酸内切限制酶具有3个基本的特性：①在DNA 分子双链的特异性识别序列部位切割DNA 分子，产生链的断裂；②2个单链断裂部位在DNA 分子上的分布通常不是彼此直接相对的；③断裂结果形成的DNA 片段往往具有互补的单链延伸末端。

限制性核酸内切酶对DNA 底物的酶切作用是否完全，直接关系到连接反应、重组体分子的筛选和鉴定等实验结果。

DNA重组质粒的构建概述

DNA重组质粒的构建概述引言DNA重组质粒是现代生物学研究中常用的工具，它可以用来携带外源基因并在目标生物体中表达，从而实现对基因功能的研究和利用。

本文将概述DNA重组质粒的构建过程，包括选择质粒载体、外源基因的克隆插入以及构建质粒的鉴定等内容。

选择质粒载体质粒是细胞内独立存在的环状DNA分子，广泛存在于细菌和酵母等单细胞生物中。

在构建DNA重组质粒时，选择一个适合的质粒载体非常关键。

常用的质粒载体有pUC19、pET28a、pET-DEST42等，在选择时可以根据实验需求考虑载体大小、选择标记物和基因表达系统等因素。

外源基因的克隆插入1. DNA片段的获取首先，需要获取外源基因的DNA片段。

这可以通过PCR扩增、基因合成或其他方法来获得。

在PCR扩增时，需要设计一对引物，使其能够特异性地扩增目标基因。

合成基因片段时，可以利用现代合成生物学的技术，将目标基因序列按照设计的引物进行人工合成。

2. 酶切和连接接下来，使用限制酶将质粒载体和外源基因片段酶切开。

酶切的目的是产生互补的黏性末端，使得质粒载体和外源基因片段可以互相连接。

选择适当的限制酶在切割时产生互补的黏性末端，使得连接更加有效。

然后，将质粒载体和外源基因片段连接在一起。

这可以使用DNA连接酶和连接试剂，在适当的条件下进行连接。

连接后的质粒称为重组质粒。

3. 转化宿主细胞将构建好的重组质粒转化到适当的宿主细胞中，使其能够在细胞内进行复制和表达。

常用的宿主细胞有大肠杆菌和酵母等。

构建质粒的鉴定通过一系列实验，对构建好的质粒进行鉴定，以确保其正确性和完整性。

常用的鉴定方法有限制酶切鉴定、测序验证、PCR扩增鉴定等。

1. 限制酶切鉴定利用正确的限制酶将质粒进行切割，然后经过琼脂糖凝胶电泳进行分析。

根据不同的切割模式，可以判断质粒是否正确构建。

2. 测序验证通过测序技术对质粒进行测序分析，确保质粒中的外源基因片段的完整性和准确性。

3. PCR扩增鉴定使用特异性引物对质粒进行PCR扩增，在琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物的大小，判断质粒中的目标基因是否存在。

【课后集训】第3章基因工程第1节重组DNA技术的基本工具(含答案详解)

2019版生物选择性必修3 课后集训第3章基因工程第1节重组DNA技术的基本工具题组一基因工程的概念及诞生和发展1．下列叙述符合基因工程概念的是()A．在细胞内直接将目的基因与宿主细胞的遗传物质进行重组，赋予生物新的遗传特性B．将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的大肠杆菌菌株C．用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株D．自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上2．下列有关基因工程诞生的说法，不正确的是()A．基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的B．工具酶和载体的发现使基因工程的实施成为可能C．遗传密码的破译为基因的分离和合成提供了理论依据D．基因工程必须在同物种间进行题组二限制酶和DNA连接酶3．根据下图判断，下列有关工具酶功能的叙述，错误的是()A．限制酶可以切断a处B．DNA聚合酶可以连接a处C．解旋酶可以使b处解开D．DNA连接酶可以连接c处4．下列有关如图所示的黏性末端的说法，错误的是()A．甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的B．甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲、丙之间不能C．DNA连接酶的作用位点是b处D．切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段5．有关DNA重组技术的工具酶的叙述，正确的是()A．限制性内切核酸酶能切割烟草花叶病毒的核酸B ．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列C ．所有DNA 连接酶都能连接黏性末端和平末端D ．DNA 连接酶和DNA 聚合酶均可用来拼接DNA 片段6．下列有关限制性内切核酸酶的叙述，正确的是( )A ．用限制酶切割一个DNA 分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个B ．限制性内切核酸酶识别序列越短，则该序列在DNA 中出现的概率就越大C ．限制性内切核酸酶的活性不受温度、pH 等条件的影响D ．只有用相同的限制性内切核酸酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒题组三基因进入受体细胞的载体7．下列关于基因工程操作工具——载体的叙述中，错误的是( )A ．质粒作为常见的载体，不仅存在于细菌中，某些病毒也具有B ．作为基因工程的载体，标记基因不可或缺C ．目的基因插入载体时，有特定的插入位点D ．构建重组DNA 分子时需DNA 连接酶和限制性内切核酸酶等8．限制酶Mun Ⅰ和限制酶Eco R Ⅰ的识别序列及切割位点分别是－CA ↓ A TTG －和－GA ↓ATTC －。

重组质粒的构建

连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm） ≤15℃： 15℃/6h； 12℃/8h； 8℃/12h
连接酶催化DNA连接的最佳反应温度是37℃
▪ DNA重组技术中的核心是DNA片段之间的体外连接方案
DNA连接酶及连接机制
1 ） ATP 通过磷酸基团与 T4 DNA连接酶中的亮氨酸形成磷酸-氨基键，从而形成酶ATP复合物；
限制性内切酶
具备多个限制酶的识别位点（多克隆位点），以便外源DNA的插入与截取。
多种酶切口单一酶切口多克隆位点
或具备特异的重组位点
11
载体的选择与改造应具备的条件
3.具有合适的筛选标记
具有遗传表型或筛选标记，以区别阳性重组分子和阴性重组分子，主要有抗药性基因、酶基因、营养缺陷型及形成噬菌斑的能力等。
二、基础知识
2. 重组DNA技术的基本过程
（1）目的基因的获得（2）载体的选择与制备（3）目的基因与载体的结合（DNA分子的体外连接）（4）重组DNA导入受体（5）重组体筛选和鉴定（6）目的基因表达（7）基因产物的分离纯化
DNA重组操作过程
ab
剪切
载体
重组
B
引入宿主细胞
Ab
抗性筛选
T载体
▪ 一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，再在70℃或72℃下在只加入dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆效率，这样加T反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加T 反应。载体自连、PCR产物串连可以忽略。
▪ 如果使用ddTTP，效果会更好。
实验二重组质粒的构建
一、实验目的
▪通过本实验学会琼脂糖凝胶DNA回收和重组 DNA连接的方法。

平末端质粒重组连接时间

平末端质粒重组连接时间平末端质粒重组连接是基因工程领域中常用的一种技术手段，可以将DNA序列的特定片段插入到另一条DNA序列中的指定位置。

这项技术对于基因研究、基因治疗等领域都有广泛应用。

在实际应用中，平末端质粒重组连接的时间通常是一项关键指标，下面将从步骤、时间等方面详细介绍。

一、平末端质粒重组连接的步骤1.选取质粒和DNA片段，理论上，这两者的长度应该相等，且端部具有互补性;2.通过酶切将质粒和DNA片段末端线性化，制备末端均为平末端的DNA片段;3.使用足够的浓度的T4DNA聚合酶，将质粒DNA和DNA片段进行混合;4.加入链接试剂，如ATP、 T4DNA连接酶，通过一定的反应条件下，使得持有互补端结构的DNA聚合在一起;5.加入靶细胞，并在特定的温度和环境条件下，使连接后的质粒与靶细胞进行转染。

二、平末端质粒重组连接的时间平末端质粒重组连接的时间是由以上五个步骤中的后三个步骤决定，即加入链接试剂、反应条件和转染时间。

这些步骤都是非常关键的，它们直接关系着连接的效率和质量。

1.加入链接试剂的时间加入链接试剂是整个连接过程中的一步关键步骤，如果加入太早或太晚，都会影响连接效率和质量。

一般来说，加入链接试剂后需要反应至少30分钟，以保证反应的充分完成，从而达到最好的连接效果。

2.反应条件的时间反应条件的时间同样也非常关键，一般来说，反应时间应在30-60分钟之间才能确保连接效率和质量。

不过，这个时间也要视具体情况而定，如果有较多的噪声或其它因素干扰，就需要适当延长反应时间，以达到最佳的连接效果。

3.转染时间的时间转染时间的时间是连接效率和质量的最终决定因素。

一般来说，转染时间应在2-3天之间，以使转染的细胞能够充分的接受连接DNA，从而达到最佳的连接效果。

三、总结平末端质粒重组连接是基因工程领域中广泛使用的一项技术手段，它能够将不同的DNA片段通过连接技术相互拼接。

在连接过程中，加入链接试剂、反应时间和转染时间都是关键的因素，这些因素直接关系着连接效率和质量。

基因工程原理

基因工程原理内容提要1.基因工程又称基因操作、重组DNA技术, 是P. Berg等于1972年创建的。

基因工程技术涉及的基本过程包括“切、连、转、选”。

该技术有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。

2.基因工程中使用多种工具酶，包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合成与修饰的酶类。

3.限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶，属于水解酶类。

根据限制性内切核酸酶的作用特点，被分为三大类。

Ⅱ类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小，专一性强,切割的方式有平切和交错切, 作用时需要Mg++作辅助因子, 但不需要ATP和SAM。

第一个被分离的Ⅱ类酶是Hind Ⅱ。

4.连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶，有DNA连接酶和RNA连接酶之分。

基因工程中使用的连接酶来自于原核生物，有两种类型的DNA连接酶∶连接酶和T4-DNA连接酶。

基因工程中使用的主要是T4DNA 连接酶，它是从T4噬菌体感染的中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。

5.载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有三种主要类型∶质粒DNA、病毒DNA、科斯质粒，在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。

6.DNA重组连接的方法大致分为四种: 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法。

粘性末端连接法是最常用的DNA连接方法,是指具有相同粘性末端的两个双链DNA分子在DNA连接酶的作用下, 连接成为一个杂合双链DNA。

平末端连接是指在T4 DNA连接酶的作用下, 将两个具有平末端的双链DNA分子连接成杂种DNA分子。

同聚物加尾连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端, 外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸,如dA(dG)和dT(dC), 然后在DNA连接酶的作用下, 连接成为重组的DNA。

dna连接反应的影响因素提高平端连接效率的方法.docx

DNA连接反应的影响因素&提高平端连接效率的方法&外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应&平端ＤＮＡ连接接反应1、连接缓冲液的影响：大体上缓冲液含有以下组分：20-100mmol/L 的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，较多用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。

与限制酶缓冲液不同的是连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。

2、 pH的影响：一般将缓冲液的pH调节到7.4-7.8，较多用7.8。

有实验表明，若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%，那么体系偏碱（pH为8.3）时仅为全部活力的65%；当体系偏酸（PH为6.9）时仅为全部活力的40%。

3、 ATP浓度的影响：连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，较多用1mmol/L。

研究发现，ATP的最适浓度为0.5-1mmol /L，过浓会抑制反应。

例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10%被抑制；还有报道，当ATP的浓度为0.1mmol/L 时，去磷酸载体的自环比例最大。

由于ATP极易分解，所以当连接反应失败时，除了DNA与酶的问题外，还应考虑ATP的因素。

含有ATP的缓冲液应于 -20℃保存，溶化取用后立即放回。

连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解。

与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP母液。

4、连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37℃。

构建重组质粒基本方法

构建重组质粒基本方法重组质粒是一种重要的遗传工程工具，用于将外源基因导入到宿主细胞中，从而实现特定基因的表达与功能研究。

构建重组质粒的基本方法可以概括为：选择质粒骨架、引物设计与合成、PCR扩增外源基因片段、DNA连接与重组、质粒扩增与提取、质粒鉴定与筛选，以下分别进行详细介绍。

一、选择质粒骨架在构建重组质粒时，首先需要选择一个合适的质粒骨架。

质粒骨架是指一个可复制的质粒DNA分子，常见的质粒骨架有pUC、pBR322、pET等。

质粒骨架上通常包含有宿主细胞可以识别的起始子和起始子附近的终止子，用于启动和终止转录过程，同时还包含选择标记基因，如抗生素抗性基因，以及其他在分子克隆中常用的诸如多克隆位点、限制酶切位点等。

二、引物设计与合成在构建重组质粒时，需要利用引物来扩增并克隆外源基因片段。

引物一般是两条DNA可控引物，其中一条是正向引物，另一条是反向引物。

引物的设计需要注意以下几点：引物的长度通常为15-30个碱基对，引物应该具有合适的Tm值，并且在引物双链的末端至少有2个碱基对是纯G或纯C。

引物可以使用商业引物合成公司合成。

三、PCR扩增外源基因片段使用引物扩增外源基因片段是构建重组质粒的一个关键步骤。

PCR反应一般包括DNA模板、引物、dNTPs和DNA聚合酶。

根据需要，可以使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳检查PCR产物长度和纯度，并使用PCR产物进行下一步处理。

四、DNA连接与重组将PCR扩增得到的外源基因片段与质粒骨架进行连接和重组。

连接通常通过使用限制酶切和连接酶来实现。

限制酶切是利用限制酶切剪切DNA，生成具有互补粘性末端的DNA片段，然后将外源基因片段与质粒骨架进行连接。

连接酶可以使DNA片段之间的末端骨架参与phosphodiester结合反应，从而形成连体分子。

五、质粒扩增与提取将重组质粒转化到宿主细胞中，通过培养和培养基筛选来扩增质粒。

质粒扩增一般在含有抗生素的琼脂糖平板上进行，抗生素可以选择对宿主细胞有毒作用但不对重组质粒有毒的抗生素。

载体构建质粒构建步骤有哪些？

载体构建质粒构建步骤有哪些？载体构建过程：1、引物设计2、⽬的⽚段选取：RNA提取、RNA反转录、PCR扩增、PCR产物纯化3、双酶切4、连接:T4 DNA ligase连接或者同源重组连接（新贝⽣物：#B101、#B102）5、转化6、菌落PCR7、测序：1)摇菌；2)送样; 3)⽐对；8、菌种保存：菌种⽐对成功，则可保存菌种备⽤。

9、质粒提取：菌种⽐对成功，冻存菌种后，菌液⽤于提取质粒。

⼀、载体构建基本原理分、切、连、转、筛1、分：分离出要克隆的⽬的基因及载体。

2、切：⽤限制性内切酶切割⽬的基因和载体，使其产⽣便于连接的末端。

限制性内切酶：是⼀类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸⽔解酶。

限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三⼤类。

其中Ⅱ型酶能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内切割，产⽣特异性DNA⽚段，是DNA 重组技术中常⽤的酶。

Ⅰ型酶：具有修饰和切割功能，⽆固定切割位点Ⅲ型酶与Ⅰ型类似，能识别特异位点，但切割位点在识别位点以外Ⅱ型酶特点：①识别顺序⼀般为4－6个碱基对②识别顺序具有180度的旋转对称性，呈完全的回⽂结构③Ⅱ型酶对双链DNA两条链同时切割，可产⽣两种不同末端：平末端，粘末端平末端：在识别顺序的对称轴上，对DNA同时切割形成平末端，如：SmaI5’－CCC GGG－3’ 5’－CCC GGG－3’3’－GGG CCC－5’ 3’－GGG CCC－5’5′突出粘末端：在识别序列的两侧末端切割DNA双链，于对称轴的5 ′末端切割产⽣5 ′端突出的粘性末端，如：Hind Ⅲ5’―AAGCTT―3’ 5’― A 5’－AGCTT―3’3’―TTCGAA―5’ 3’― TTCGA－5’ A―5’3′突出粘末端:与5′突出粘末端作⽤相反，产⽣3 ′端突出粘末端，如：PstI5’―CTGCAG―3’ 5’―CTGCA－3’ G―3’3’―GACGTC―5’ 3’―G 3’－ACGTC―5’3、连：将切割后的⽬的基因和载体⽤T4 DNA连接酶连接或者同源重组⽅法连接。

构建质粒的步骤

构建质粒的步骤构建质粒是一种重要的实验技术，用于在细菌或其他生物体中携带和复制外源DNA。

下面将介绍构建质粒的步骤。

1. 选择质粒载体：首先需要选择适合的质粒载体。

质粒载体是一种环状DNA分子，可以自主复制并在宿主细胞中表达外源基因。

常用的质粒载体有pUC18、pBR322等。

选择适合的质粒载体需要考虑载体大小、复制起点、抗生素抗性基因等因素。

2. 获得外源DNA片段：外源DNA片段可以是来自其他生物体的DNA序列，也可以是人工合成的。

获得外源DNA片段的方法有PCR扩增、限制性内切酶切割等。

3. 切割质粒和外源DNA：使用限制性内切酶将质粒和外源DNA切割成互补的黏性末端。

确保切割后的DNA末端与质粒载体互补，以便进行连接。

4. 连接质粒和外源DNA：通过DNA连接酶将切割后的质粒和外源DNA连接起来，形成重组质粒。

连接时需要考虑连接缓冲液的条件和酶的适宜温度。

5. 转化宿主细胞：将重组质粒导入宿主细胞中，使其能够复制和表达外源基因。

常用的转化方法有热激转化、电击转化等。

转化后，需要在含有抗生素的培养基上筛选出含有质粒的转化子。

6. 确认质粒的构建：通过PCR扩增、限制性内切酶切割或测序等方法，确认质粒是否成功构建，并验证外源基因是否正确插入。

7. 大规模培养质粒：如果质粒构建成功，可以进行大规模培养，以获得足够的质粒量。

培养条件需要根据质粒载体的特性进行调整。

8. 提取质粒：使用质粒提取试剂盒等方法，从大规模培养的细菌中提取质粒。

提取的质粒可以用于进一步的实验研究或应用。

通过以上步骤，就可以成功构建质粒。

构建质粒是分子生物学研究中常用的技术手段，可以用于基因克隆、基因表达、基因敲除等研究中。

同时，构建质粒也是基因工程和生物工程的重要基础。

2022生物课时练39基因工程含解析

基因工程1.（2020山东临沂一中月考）金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白.某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR）扩增获得目的基因,构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。

PCR扩增过程示意图图像如下所示,请回答下列问题。

（1)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物（引物1和引物2）,为方便构建重组质粒,在引物中需要增加适当的限制性核酸内切酶位点。

设计引物时需要避免引物之间形成，造成引物自连。

（2）图中步骤1代表,步骤2代表退火,步骤3代表延伸,这三个步骤组成一轮循环。

（3）PCR扩增时,退火温度的设定是成败的关键。

退火温度过高会破坏的碱基配对。

退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但的引物需要设定更高的退火温度.(4)如果PCR反应得不到任何扩增产物,则可以采取的改进措施有(填序号)。

①升高退火温度②降低退火温度③重新设计引物2。

（2020山东青岛二模)质粒P含有氨苄青霉素抗性基因（Amp r）和四环素抗性基因(Tet r），外源DNA的插入会导致插入部位基因的失活.重组人干扰素a—1b是我国第一个国内批准生产的基因工程药物。

下图所示为利用质粒P和人干扰素基因构建基因表达载体P1的示意图。

回答下列问题。

识别序列及切割位点(1）据图分析,为便于过程①所获得的目的基因片段能够顺利与质粒P连接,需要在目的基因片段加上序列。

成功导入P1的受体菌落具有的抗药性特点为。

（2）过程③用到的酶为。

为了保证目的基因能够正常表达,在构建P1时需要将目的基因插入之间。

(3）科学家最早就是利用基因工程方法在大肠杆菌和酵母菌细胞内获得了干扰素，利用大肠杆菌作为受体菌的优点是。

（4)若要检测是否表达出干扰素，可用（物质）对工程菌中提取的蛋白质进行检测.3.识图作答。

（1)PCR技术的中文名称为，加热使DNA双链打开,这一步是打开氢键,在细胞中是在酶的作用下进行的。

（2）当温度降低时,引物与模板末端结合，在酶的作用下，引物沿模板延伸,最终合成2个DNA分子,此过程中的原料是,遵循的原则是.（3)PCR技术使DNA分子大量复制,若将一个用15N标记的DNA 分子放入试管中,以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制4次之后,则15N标记的DNA分子占全部DNA分子的比例为。

重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定解析

重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：1. 学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。

2. 学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。

3. 学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。

4. 掌握利用Cacl2感受态细胞的方法。

5. 学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。

6. 掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。

并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。

7. 学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。

实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。

重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。

将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。

1. 重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。

其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。

常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。

本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。

在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。

单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。

构建质粒原理

构建质粒原理
质粒原理是指质粒的特性和功能原理，质粒作为一种圆环状的DNA分子，常存在于细菌和其他一些生物体中。

质粒含有自
我复制的基因序列，通常可以独立于细菌染色体复制和遗传。

质粒的构建主要包括以下几个步骤：
1. DNA提取：从某个生物体中提取目标DNA序列，可以通过PCR扩增等方法得到所需基因片段。

2. 寻找适合的质粒：根据目标基因片段的大小、复制起始位点以及所需表达的细菌菌株等条件，选择合适的质粒。

3. 质粒预处理：将质粒以及目标DNA片段进行酶切，选择适
当的限制酶将目标DNA片段插入到质粒的多克隆位点上。

4. 连接：通过DNA连接酶将目标DNA插入到质粒上，得到
重组质粒。

5. 质粒转化：将重组质粒导入到一种适合的宿主细菌中，通过热激冷冻法、电穿孔法等方法使质粒在细菌中稳定复制。

6. 表达：通过适当的诱导剂或选择性培养基，促使质粒在细菌中大量复制和表达目标基因。

通过质粒构建，可以实现目标基因的研究和表达。

质粒原理的核心是质粒的自主复制和传递，通过构建重组质粒，可以将外源基因有效地导入到宿主细菌中，实现目标基因的放大和表达。

目的基因与载体的连接原理

目的基因与载体的连接原理
(1)黏性未端连接:将靶基因片段和载体DNA经相同的限制酶分别切割,使它们两端产生相同的黏性未端。

然后经黏性未端碱基配对,再经DNA连接酶作用,共价连接成新的重组DNA分子;(2)平头末端连接:将平末端的DNA分子在T4DNA连接酶催化下,使DNA 分子的3'OH和5"P进行共价结合;(3)人工接头法: 是指利用人工接头加在平端DNA片段的两端,然后用相应限制酶切割人工接头以产生黏性末端,再与带相同黏性未端的载体相连;(4)同源多聚尾连接法:在末端脱氧核苷酸转移酶催化下,在线型载体分子的两端加上单一核苷酸如dG组成的多聚尾;而在目的DNA分子的两端加上dC尾,两者混合退火,然后经DNA聚合酶I或Klenow填补裂口处缺失的核苷酸,再通过DNA连接酶修复成环状的双链DNA。

重组质粒的连接、转化及筛选

重组质粒的连接、转化及筛选概述质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。

如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。

在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。

但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。

通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。

外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。

也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。

2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。

由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。

所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。

还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。

带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。

基因工程名词解释 (1)

1.基因工程:是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序。

2.限制性内切核酸酶:是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。

3.粘性末端:指DNA分子在限制酶的作用下形成的含有几个核苷酸单链的末端，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来4.平末端:当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端5.酶的星号活性:极度非标准反应条件下,当条件改变时许多限制酶的识别位点会改变，导致与切割序列的非特异性，这种现象称为星号活性6.载体:将外源DNA或基因携带进入宿主细胞进行扩增或表达的工具7.质粒的不相容性:两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象8.PCR引物:在PCR反应中，与待扩增的DNA两侧碱基互补的寡核苷酸片段，其本质是单链DNA9.cDNA文库:指将某种生物体基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段,分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA 文库10.基因组文库:指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，在与合适的载体在体外重组，并转化相应的宿主细胞，获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物基因组文库11.DNA体外重组:将外源DNA用DNA连接酶在体外连接到合适的载体DNA上12.感受态细胞:经过适当处理后容易接受外源DNA进入的细胞13.受体细胞:从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞14.报告基因:一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说是一-个其表达产物非常容易被鉴定的基因。

把它的编码序列和基因表达调节顺序相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序.列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到7转化体15.简并序列:分子生物学中，同-种氨基酸具有两个或更多个密码子现象称为密码子的简并性，这样的序列就叫兼并序列16.目的基因:那些已被或者准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA 片段17.同尾酶:来源不同，识别靶序列不同,但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。