CaM突变体质粒的构建、表达纯化及活性鉴定
人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测
里！型！！塑型！！垫！婴！型塑坠！人脂联素基因的原核表达、纯化及活性检测。
刘德敏杨莉丽丁玉静孙颖于德民摘要目的：在大肠杆菌中表达具有活性的重组人脂联素蛋白。
方法：利用ＰＣＲ技术扩增人脂联素基因完全编码序列，选用Ｇａｔｅｗａｙ原核表达体系，经过ＢＰ反应、ＬＲ反应两步反应，将ＰＣＲ产物克隆人ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２质粒，构建融合表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２，ａｔｔＢ—ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，转化大肠杆菌Ｂ１２１（ＤＥ３），以异丙基硫代一Ｂ—Ｄ一半乳糖苷（ＩＹｒＧ）诱导表达脂联索融合蛋白，经镍柱亲和层析纯化，ＮＤＳＢ２０１高效复性后，使重组蛋白作用于体外培养的肝细胞，ＲＴＰＣＲ法检测重组脂联素对肝细胞葡萄糖一６一磷酸酶转录水平的影响。
结果：成功构建了表达载体ｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ—ａｄｉｇｎｎｅｃｔｉｎ，ＤＮＡ序列测定结果与预期一致。
ＩＰｒＧ诱导表达的融合蛋白经纯化后ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ鉴定具有人脂联素抗原性，并可使培养的肝细胞中葡萄糖－６一磷酸酶转录水平下降。
结论：获得具有生物学活性的重组人脂联素为进一步研究脂联素的生理机制奠定了基础。
关键词脂联索克隆，分子基因表达肝细胞重组蛋白质类葡糖一６—磷酸酶大肠杆菌ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＡｃｔＭｔｙＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＨｕｍａｎＡｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎＧｅｎｅＬ１ＵＤｅｎｔｉｎ，ＹＡＮＧＬｉｆｔ，ＤＩＮＧＹ删抽ｇ，ＳＵＮＹｉｎｇ，ＹＵＤｅｍｉｎＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｗｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭｅｔａｂｏｌｉｃＨｏｐｉｔｕｌ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｌｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｘｐｒｅｓｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｗｉｔｈｂｉｏｌｏ咖ａｌａｅｆｉｖｉＶｉｎＥｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｅＤＮＡｃｏｄｉｎｇｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｇｅｎｅⅧａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲＧａｔｅｗａｙｐｍｋａｒｙｏｆｉｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓｕｓｅｄＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２ｐｌａｓｍｉｄｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｆｕｓｉｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＥＴ—ＤＥＳＴ４２／ａｔｔＢ－ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｓｉｔｅｒＢＰｒｅａｃｆｉｃｍａｎｄＬＲｒｅａｃｔｉｏｎｐＥＴ－ＤＥＳＴ４２／ａｎＢ—ａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎＷａｓｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥｅｏｌｉＢ１２｜ａｎｄｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｗⅡｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙＩＰＴＧｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｄｉｐｏｎｅｅｔｌｎ，ｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎＷ８８ｐｕｎｆｉｅｄｂｙＮｉ・ＮＴＡａⅡｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｍａｔａｎｔａｄｉｐｏｎｅｅｆｉｎｏｎｇｌｕｃｏｓｅ－６－ｐｈ０８ｐｈａｔｏｎｅｗ∞ｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＲＴ—ＰＣＲ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｈｅＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓｈｏｗｅｄ出啦ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｃｔｏｒｐＥＴ—ＤＥｓＴ４２ｆ戬啦＿ａｄｉｐ叫ｅｃ血ｗ啦ｅｍａｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．ｐｕｒｉｆｉｅｄａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｓｈｏｗｅｄａｎｄｇｅｎｉｃｉｔｙａｎｄｒｅｄｕｃｅｄｓｋｏ”６一ｐｈ０８ｐｈａｔａｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｅｖｅｌＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｗｅｈａｖｅｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈａｍａｎａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎｗｉｔｈｂｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ．ｗｈｉｃｈｉｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｖ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓａｄｉｐｏｎｅｅｔｉｎｃｌｏｎｉｎｇ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｇｌｕｅｏｓｅ一６一ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｅｓｃｈｅｆｉｃｈｉａｃｏｌｉ人脂联素（ａｄｉｐ（、ｎｅｃｔｉｎ）基因全长１７ｋｂ，位于染色体３ｑ２７，包含３个外显子和２个内含予。
人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测
人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测徐岚;肖斌;陈慧芹;李晓荣;郝文波【摘要】The objective of this work is to construct a eukaryotic expression vector for the C-Src tyrosine kinase(Csk)gene from human. Total RNA was extracted from HeLa cells. The full-length cDNA sequence of Csk gene was isolated and amplified via RT-PCR,and cloned into a eukaryotic expression vector pENTER,the recombinant pENTER-Csk-his plasmid was constructed. The recombinant plasmid was transfected into 293T cells,after 48 hours,the expression levels of Csk protein were determined by SDS-PAGE and Western blot. The localization of Csk protein was detected via indirect immunofluorescence,and the protein Csk was purified by nickel chelate beads;in addition,the activity of the protein was measured via his-pulldown and CO-IP. Results showed that:Double digestion and sequencing reveled that recombinant plasmid pENTER-Csk-his was constructed properly without mutation. Both SDS-PAGE and Western blot detected a 51 kD protein,indicating that Csk protein was expressed successfully in the 239T cells. The indirect immunofluorescence confirmed the expression of Csk protein in cytoplasm. Finally,the purified protein Csk by nickel chelate beads interacted with the IGF1R and SHC1 by his-pulldown and CO-IP. Conclusively,this study successfully acquired the full-length sequence of Csk,the eukaryotic expression vector pENTER-Csk-his was constructed,and the gene was expressed efficiently in 293T cells,moreover,the expressed protein presented bioactivity.%旨在构建人C-Src蛋白酪氨酸激酶（Csk）基因真核表达系统。
rhKD／APPvar毕赤酵母分泌表达质粒的构建及其重组蛋白的表达和纯化
rhKD／APPvar毕赤酵母分泌表达质粒的构建及其重组蛋白的表达和纯化王心童;王虹蛟;王强;孟威宏;颜炜群;任立群【摘要】目的：构建高效分泌表达重组人淀粉样蛋白前体 Kunitz 型蛋白酶抑制剂结构域变异体（rhKD／APPvar）的毕氏酵母工程菌，建立适合大规模发酵、纯化rhKD／APPvar的工艺。
方法：利用已构建的 rhKD／APP表达质粒，在其活性中心两侧设计2个酶切位点（ApaⅠ和SacⅡ），实现人 KD／APP 活性中心 RAM 与BPTI活性中心KAR的替换，构建 rhKD／APPvar表达质粒。
将重组质粒转化到酵母菌 X-33中，优化 rhKD／APPvar表达最佳 pH值，使 rhKD／APPvar获得高效表达。
利用阳离子交换树脂和超滤除盐对重组蛋白进行纯化。
结果：酶切鉴定和测序分析显示成功构建了KD／APPvar-pPICZαC重组质粒。
经电转化成功地将重组质粒转化至酵母菌 X-33中。
SDS-PAGE分析，甲醇诱导表达后在相对分子质量约6700处出现蛋白条带，pH 6.0、甲醇诱导120 h蛋白表达水平最高，经纯化获得纯度达95％的重组蛋白。
结论：成功构建 KD／APPvar-pPICZαC重组质粒，经毕赤酵母表达和纯化获得了 rhKD／APPvar蛋白。
%Objective To construct the engineering bacteria expressing the recombinant human Kunitz protease inhibitor domain of amyloid protein precursor variant (rhKD/APPvar)in Pichia pastoris,and to establish the methods suitable for large-scale fermentation and purification of rhKD/APPvar.Methods The rhKD/APPvar expression vector was constructed based on therhKD/APPvar-pPICZαexpression vector. Two restriction enzyme loci (ApaⅠ and SacⅡ)were added to two flanks of K D/APP and human KD/APP activity center RAM was replaced by the active site of BPTI KAR.After therhKD/APPvar-pPICZαexpression vector was transformed into Pichiapastoris,optimized expression and purification of rhKD/APPvar was performed.The rhKD/APPvar was purified with cation exchange chromatography and desalting.Results The results of digestion identification and DNA sequencing analysis demonstrated that the recombinant plasmid rhKD/APPvar-pPICZα wassuccessfully constructed and transfected into pastoris X-33. The SDS-PAGE analysis results indicated that rhKD/APPvar expressed after the induction of methanol and the relative molecular weight was 6 700.After a series of experiments the optimal expression conditions of rhKD/APPvar were obtained as follows:the optimal pH was 6.0 and the optimal induction time point was about the 5 th day for the strain.After purified the purity of rhKD/APPvar was about 95%.Conclusion KD/APPvar-pPICZ is successfully constructed;after expression in Pichia pastoris and purification,therhKD/APPvar protein is obtained.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2014(000)003【总页数】5页(P529-533)【关键词】毕赤酵母菌;重组KD/APP变异体;牛胰蛋白酶抑制剂;淀粉样蛋白前体【作者】王心童;王虹蛟;王强;孟威宏;颜炜群;任立群【作者单位】吉林大学中日联谊医院神经内科，吉林长春 130033;解放军第461 医院内科，吉林长春 130021;解放军第461 医院内科，吉林长春 130021;沈阳军区总医院心血管内科，辽宁沈阳110015;吉林大学再生医学科学研究所再生医学系，吉林长春130021;吉林大学再生医学科学研究所再生医学系，吉林长春130021【正文语种】中文【中图分类】Q78牛胰蛋白酶抑制剂（bovine pancreatic trypsin inhibitor，BPTI）是Kunitz家族的丝氨酸蛋白酶抑制剂，已用于急、慢性肝损伤的研究［1－6］。
CUEDC2各种缺失突变体的构建及其功能初探
第一部分克隆构建及表达检测结果与讨论１．ＧＳ％ＣＵＥＤＣ２缺失突变表达载体的鉴定ｐＧＥＸ—ＫＧ—ＣＵＥＤＣ２的各种缺失突变经ＢａｍｔｔＩ和ＸｈｏｌＩ酶切鉴定，分别得到不同碱基数的外源ＤＮＡ插入片段（图２），而空载体ｐＧＢＫＴ７经同样酶切后无插入片段，说明缺失突变表达载体的构建是成功的。
重组质粒经序列测定证明，ＣＵＥＤＣ２（１－１３３）、ＣＵＥＤＣ２（１．１８０）、ＣＵＥＤＣ２（１００．２２６）、ＣＵＥＤＣ２（１３３．２２６）、ＣＵＥＤＣ２（１８０．２２６）、ＣＵＥＤＣ２（１００—１８０）编码区序列完全Ｊ下确（数据略）。
图２ＧＳＴ－ＣＵＥＤＣ２重组质切鉴定图１．ＧＳＴ空载体２．ＧＳＴ＿ｃｕＥＤｃ２（卜１３３）３．ＧＳＴ—ＣＵＥＤＣ２（１３３—２２６）４．ＧＳＴ－ＣＵＥＤＣ２（１—１８０）５．６ＳＴ—ＣＵＥＤＣ２（１８０—２２６）６．ＧＳＴ－ＣＩＪＥＤＣ２（１００—１８０）７．ＧＳＴ—ＣＵＥＤＣ２（１００—２２６）２．Ｆｌａｇ—ＣＵＥＤＣ２缺失突变表达载体的酶切鉴定及表达鉴定２．１Ｆｌａｇ－ＣＵＥＤＣ２缺失突变表达载体的鉴定Ｆｌａｇ～ＣＵＥＤＣ２的各种缺失突变经ＢａａｆｌＩ和ＸｈｏｌＩ酶切鉴定，分别得到约不同长度的缺失突变，与外源ＤＮＡ插入片段大小一致，而空载体ｐｃＤＮＡ３．Ｏ－Ｆｌａｇ经同样酶切后无插入片段，说明克隆是成功的。
重组质粒经序列测定证明，上述构建的克隆编码区序列完全ｊ下确，引入的突变完全『Ｆ确。
（图１４）图３Ｆｌａｇ－ＯＪＥＤＣ２不同缺失突变１．Ｆｌａｇ空载体２．Ｆｌａｇ－ＣＵＥＤＣ２（卜１００）３．Ｆｌａｇ—ＣＵＥＤＣ２（１—１３３）４．Ｆｌａｇ—ＣＵＥＤＣ２（１—１８０）５．Ｆｌａｇ－ＣＵＥＤＣ２（１３３—２２６）６．Ｆｌａｇ—ＣＵＥＤＣ２（１００—２２６）２．２Ｆｌａｇ—ＣＵＥＤＣ２缺失突变在２９３Ｔ细胞中表达鉴定把Ｆｌａｇ—ＣＵＥＤＣ２野生型以及各种缺失突变质粒用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００转入２９３Ｔ细胞后，裂解细胞，最后按常规方法做Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析（用Ｆｌａｇ抗体检测），检测ＣＵＥＤＣ２各种缺失突变在２９３Ｔ细胞中是否表达以及表达大小是否正确（图６）。
FANCJ在HEK293T细胞中的表达 、纯化及活性检测
FANCJ在HEK293T细胞中的表达、纯化及活性检测袁濮玉;刘松柏;撖荣;杜佳慧;储小玲;吴洁;杨凡;苏倩;邱桥成;薛胜利【摘要】目的构建包含FANCJ野生型(wt)及其突变体N196S蛋白的真核表达载体,并对纯化的野生型蛋白及突变体蛋白进行活性检测.方法从HEK293T中提取RNA,并反转录为cDNA,使用带有3xFlag标签序列的特异性引物通过PCR方法扩增出人FANCJ编码区全长,并克隆到plvx-EF1-MCS-PGK-PURO载体上;突变体N196S利用NEBaseChangerTM引物设计工具,并利用NEB公司的点突变构建试剂盒Q5?Site-Directed Mutagenesis Kit技术进行操作.重组的FANCJ及突变体N196S表达质粒通过脂质体polyJet转染到HEK293T细胞中进行表达.使用免疫沉淀及竞争洗脱的方法纯化FANCJ及N196S突变体蛋白.利用荧光标记DNA底物的方法检测FANCJ及N196S突变体蛋白的DNA解旋酶活性.结果 FANCJw t 基因及N196S突变体全长编码序列成功构建到plvx-EF1-MCS-PGK-PURO载体上,蛋白质印迹法(Western blot)及PAGE胶银染方法成功检测到了FANCJwt及N196S突变体蛋白的表达、纯化,荧光标记Oligo DNA底物方法发现FANCJwt 与N196S突变体蛋白DNA解旋酶活性存在差异.结论成功构建了FANCJwt及N196S突变体真核表达载体,通过生化实验发现FANCJ及N196S突变体蛋白存在差异的DNA解旋酶活性.【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2018(047)036【总页数】4页(P4584-4587)【关键词】FANCJ;突变体;蛋白纯化;活性检测【作者】袁濮玉;刘松柏;撖荣;杜佳慧;储小玲;吴洁;杨凡;苏倩;邱桥成;薛胜利【作者单位】苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;苏州大学附属第一医院血液科 ,苏州 215006;苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;苏州大学附属第一医院血液科 ,苏州 215006;苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室 215009;苏州大学附属第一医院血液科 ,苏州 215006;苏州大学附属第一医院血液科 ,苏州 215006【正文语种】中文【中图分类】Q814.1FANCJ(Fanconi anemia complementation group J)基因编码的蛋白是第1个被确认的同乳腺癌相关肿瘤抑制因子BRCA1(breast cancer 1,early onset)相结合的蛋白，因此其最初被命名为BRCA1结合的C端解旋酶(BRCA1-associated C-terminal helicase1， BACH1)；随后又被命名为BRCA1相互影响的蛋白C端解旋酶(BRCA1 interacting protein cterminal helicase 1，BRIP1)以避免同具有类似名称的转录因子相混淆；而近年来该蛋白被发现是范可尼贫血(fanconi anemia，FA)通路的成员之一，故被称为FANCJ蛋白[1-3]。
重组人脂联素基因构建、表达、纯化及活性鉴定
关键 词 ： 脂联素 ； 因构建 ； 白表达 ； 基 蛋 生物活性
中图分 类号 ： ８ Ｑ ７６
文献 标 识码 ： Ａ
文章 编号 ：４８ ４９２０）１ ０６ ４ ０３— ７（０７０— ９— ０ ０ ０
脂联 素 （ ｉｏ ｅｔ ， Ｐ 是 １ ９ Ａｄｐ ｎ ｅｉ ＡＤ Ｎ） ｎ ９ ５年 Ｓ ｈ ｒｒ ｃ ｅｅ 等 ［ 发现 的一 种 由脂 肪 组 织 分 泌 的 细 胞 因子 ， ２ ４ １ ］ 由 ４
脂 联 素在肿 瘤发生 过 程 中所 起 的生 理 、 理 作 用 及 调 病 控机 制仍未 阐明． 为进 一步研 究 脂联 素 的生物 活性 ， 我 们 利用 重叠 Ｐ Ｒ技 术 获 得 ＡＤ Ｎ 基 因 ， 建 重 组 表 Ｃ Ｐ 构 达 载体 ｐ Ｔ ２ ｂ ＋ ） ＡＤ Ｎ， 大 肠 杆 菌 中表 达 ， Ｅ 一２ （ ／ Ｐ 在 并 在 体外 观测纯 化 后 ＡＤ Ｎ 蛋 白对 内皮 细 胞 生 长 的 抑 Ｐ
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第４卷 ６
第 １期
厦 门 大 学 学报 （ 自然 科 学版 ）
Ｊ ｕ ｎ ｌｏ ａ ｎ Ｕ ｎｖ ｒｉｙ （ ｔ ｒ ｌ ｉｎ ｅ ｏ ｒ ａ ｆＸｉｍｅ ｉｅ ｓｔ Ｎａｕ ａ ｅ ｃ ） Ｓｃ
Ｖ ｏ ． Ｎｏ．１ １ ４６
根 据 Ｇｅ Ｂ ｎ ｎ ａ ｋ公 布 的人脂联 素 ｅ Ｎ 序列 ， Ｄ Ａ 去除 Ｎ端信 号 肽序 列 ， 在 ５ 端 和 ３－ 并 Ｌ ， 端分别 引入 Ｂ ｍＨ１ ａ 和 Ｘｈ ｌ 切 位 点 ， 后 按 照 重 叠 Ｐ Ｒ 引 物 设 计 原 ｏ酶 然 Ｃ 则 ， 其核 苷酸序 列 分成 ９条 寡 核 苷 酸 片段 并分 别 合 将
制 作 用．
１ 材 料 与 方 法
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定解析
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：1. 学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2. 学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
3. 学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
4. 掌握利用Cacl2感受态细胞的方法。
5. 学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6. 掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
7. 学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1. 重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。
实验一融合蛋白表达载体构建设计与质粒提取与全面分析
pPROEX HT蛋白表达载体
原核表达系统中的各因素
复制子 ：通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关 筛选标记和报告基因 ：氨苄青霉素 ，卡那霉素 启动子 ：启动子的强弱是对表达量有决定性影响的因素之一 组成型表达 :组成型启动子 诱导调控型表达 :IPTG 融合表达 ：GST, His-Taq 分泌表达 :信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜 可溶性表达 : 转录终止子 :控制转录的RNA长度提高稳定性，避免质粒上异常
克 隆：来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 克隆化：获取同一拷贝的过程。 DNA克隆（分子克隆、基因克隆、重组DNA ）：
应用酶学方法，在体外将外源性遗传性物质（DNA）与 载体结合成重组DNA分子，继而通过转化或转染宿主细 胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提 取获得大量同一DNA分子的过程。
提前IPTG诱导 SDS-PAGE胶 Brand ford 蛋白定量分析 蛋白纯化及活性测定
六、总RNA的提取及测定
组织总RNA的提取，变性胶鉴定 讲解RT-PCR
七、基因组DNA的提取及鉴定
基因组DNA的提取及鉴定 基因组和cDNA PCR，基因结构分析
八、基因的蛋白水平表达检测（Western blot）
移液操作tips
吸酶或母液时，永远用新的干净的枪头。如果不幸污染了酶，请报告 老师。即使是稀释一梯度溶液，如要求很严格的体积，也必须使用新 的头。
检测是否漏气的方法：将吸取液体后的移液器垂直静置 15 秒，观察 是否有液滴缓慢 的流出。若有流出，说明有漏气现象。
严禁吸液后将移液器平放！ 对于粘稠液体可首先吸放几次，然后极缓慢地松开按钮，使溶液慢慢
基于大肠杆菌表达系统的制备多肽的方法与流程
基于大肠杆菌表达系统的制备多肽的方法与流程在大肠杆菌表达系统中，制备多肽已成为生物技术领域的一个重要研究方向。
该系统具有操作简便、成本较低、表达量高等优点，被广泛应用于多肽类药物的研发和生产。
本文将详细介绍基于大肠杆菌表达系统的制备多肽的方法与流程。
一、选择表达载体1.克隆载体：常用的克隆载体有pET、pGEX等，可根据实验需求选择适合的载体。
2.选择适当的启动子：大肠杆菌表达系统中，T7、lac、trc等启动子均可用于驱动多肽的表达。
3.引入合适的终止子和标签：为了提高表达效率和便于纯化，可在目的基因后引入终止子和标签，如His标签、GST标签等。
二、构建表达质粒1.提取模板DNA：以含有目的多肽基因的DNA为模板，进行PCR扩增。
2.双酶切：将PCR产物和表达载体进行双酶切，获得粘性末端。
3.连接：将酶切后的目的基因与表达载体连接，构建表达质粒。
4.转化：将构建好的表达质粒转化至大肠杆菌感受态细胞。
三、诱导表达1.挑选阳性克隆：将转化后的细胞进行培养，挑选生长良好的克隆进行验证。
2.诱导表达：在适当的诱导剂（如IPTG）作用下，诱导目的多肽的表达。
3.收集菌体：诱导表达一定时间后，收集菌体进行后续实验。
四、多肽纯化1.细胞破碎：采用超声波、高压破碎等方法，将细胞破碎，释放多肽。
2.离心：将破碎后的细胞离心，分离上清和沉淀。
3.蛋白质纯化：采用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等方法，对多肽进行纯化。
4.浓缩：对纯化后的多肽进行浓缩，获得较高浓度的目标产物。
五、多肽鉴定与分析1.SDS-PAGE：通过SDS-PAGE电泳，观察多肽的表达和纯化情况。
2.Western blot：利用特异性抗体，对多肽进行定性分析。
3.质谱分析：对纯化后的多肽进行质谱分析，确定其氨基酸序列。
4.生物活性检测：对多肽进行生物活性检测，验证其功能。
六、总结基于大肠杆菌表达系统制备多肽的方法与流程主要包括：表达载体的选择、构建表达质粒、诱导表达、多肽纯化、多肽鉴定与分析等步骤。
溶菌酶的提取,分离纯化,产物纯度鉴定及活性测定
溶菌酶的提取，分离纯化，产物纯度鉴定及活性测定实验目的：1、学习和掌握溶菌酶的制备过程2、学习和掌握溶菌酶的纯化过程3、学习和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的德原理和技术4、测定溶菌酶的分子量和所提取的溶菌酶的浓度5、测定所提取的溶菌酶的活性试验原理：溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。
酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。
从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。
它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。
可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。
2.1、离子交换层析离子交换层析是依据混合样品中各种离子或离子化合物与离子交换树脂的可交换离子之间的交换程度不同而进行分离纯化的。
离子交换层析主要是离子交换剂与溶液中离子或离子化合物以离子交换方式进行，过程是可逆的。
由于离子交换剂对溶液中各种离子具有不同的结合力，也就是说，离子交换剂对各离子的排斥和阻滞作用不同，从而引起各离子在柱内的流速差异，逐渐发生分离，最终分别流出层析柱。
该法可同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择性好，分离速度快等优点。
小鼠CD47-Fc融合蛋白表达载体构建、表达纯化及其生物学活性研究
!第"#卷第$期郑州大学学报!理学版"%&’("#)&($ !$#*+年,月-./012340&56278.!)9:.;<7.=>."-52.$#*+小鼠T!03A(;融合蛋白表达载体构建"表达纯化及其生物学活性研究郭亚楠!!陈!阳!!崔利董!!赵梅杰!!张守涛!郑州大学生命科学学院!河南郑州B"###*"摘要!构建b W B?重组蛋白真核表达载体R<W)M C(*!Q"@b W B?@h<.在真核细胞$ACK中成功表达重组蛋白’经亲和层析获得较高纯度重组蛋白b W B?@h<.通过免疫荧光染色)流式细胞技术和细胞黏附实验测定重组蛋白b W B?@h<的生物学活性’结果显示制备的b W B?@h<蛋白可与腹腔巨噬细胞表面的;U V L(很好地相互作用’制备的b W B?@h<具有较高的生物学活性.关键词!b W B?#;U V L(#亲和层析#重组蛋白中图分类号!‘?+,文献标志码!M文章编号!*,?*@,+B*!$#*+"#$@#*#,@#"!"#!*#(*C?#"N O.7P P2.*,?*@,+B*($#*?#++$%引言b W B?’又名整合素相关蛋白!72:13S729P P&<79:1>RS&:172’U M L"’是一种广泛表达的抗原.b W B?为跨膜糖蛋白’几乎在所有组织不同细胞表面表达’属于免疫球蛋白超家族成员.在不同物种间’b W B?相当保守’大鼠)小鼠)牛和人的b W B?蛋白中,#d n?#d的氨基酸序列都是相同的**+.目前研究b W B?的免疫调控机制及其在肿瘤的免疫监视中的功能多采用b W B?单克隆抗体’用b W B?抗体来抑制或阻断细胞表面b W B?抗原与其配体的结合’从而阐明b W B?在病理和生理中的作用机理*$+.为了进一步探索研究b W B?信号通路在免疫调控及肿瘤免疫监视中的分子机制’有必要表达纯化b W B?’通过b W B?融合蛋白发挥$占位%作用’深入探索b W B?的分子机制.我们构建了一个带有b W B?@h<基因的真核表达载体R<W)M C(*!Q"@b W B?@h<’它可以在$ACK细胞中表达b W B?@h<融合蛋白’纯化后的b W B?@h<可以结合;U V L(’为进一步研究b W B?体内外分子机制以及肿瘤)自身性免疫疾病等相关疾病的治疗奠定了基础.&%材料和方法&,&%材料&,&,&%质粒’菌株和细胞!质粒R<W)M C(*!Q"由本实验室保存#大肠杆菌!U$>@#+"W f"(购自康为生物!北京"公司#$ACK细胞株为本室液氮保存.&,&,’%实验动物%选择野生型E M a E N<纯系小鼠"只’雌性’,n+周龄’体重*+n$#3’购于河南省实验动物中心’饲养于本实验室;L h级动物室.&,&,/%主要试剂%.A K酶)限制性内切酶F&6f))0?@))U>@V*和K B W)M连接酶购自)=E!北京"#W)M 回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自生工生物!上海"公司#W)M)蛋白_9S G1S)琼脂糖等常用分子生物学试剂购自康为生物!北京"公司#辣根过氧化物酶!0&S P1S9>7P0R1S&j7>9P1’f V L"标记的山羊抗兔U3D抗体)兔U3D*抗体购自博士德生物!武汉"公司#=b a化学发光检测试剂盒购自;73F9!美国"#血清及培养基购自生工生物!上海"公司#引物或基因由金维智生物!北京"公司合成.亲和层析柱料购自D=f19’:0<9S1!美国".收稿日期!$#*?@#B@$#基金项目!国家自然科学基金青年科学基金项目!C*"#*#AB"#河南省基础与前沿技术研究项目!*"$C##B*##C$".作者简介!郭亚楠!*A+C&"’男’河南沈丘人’讲师’主要从事分子免疫学)干细胞与再生生物学研究’=@F97’(35&H2I445.1>5.<2#通信作者(张守涛!*A?$&"’男’河南杞县人’教授’主要从事生物技术药物)干细胞与再生生物学研究’=@F97’(40923P:I445.1>5.<2.?#*!第$期郭亚楠#等$小鼠b W B?@h<融合蛋白表达载体构建’表达纯化及其生物学活性研究&,’%方法&,’,&%表达载体R<W)M C(*!Q"@b W B?@h<的构建及鉴定!从)b E U数据库中查到家兔U3D*重链基因序列!登陆号(g##?"$(*"’委托金维智生物!北京"公司合成兔U3D*重链基因部分序列!编码氨基酸*?"n B#$".以合成W)M序列为模板’序列h<@h&S(K K K D D M K b b D D K D D M D D b D D K K b M D D b D D M D D K D D b K b K D D b D D K D D b D D M K b b#h<@V18(M M b K M M D b K K K b M K K K M b b b D D M D M D b D为引物’通过L b V扩增目的基因#然后分别用F&6f*和P+2/U U U对L b V产物和载体R<W)M C(*!Q"进行双酶切’用K B连接酶连接产物#转化至大肠杆菌W f"(菌株’涂平板)筛选阳性克隆#随后提质粒)F&6f*和P+2>U U U双酶切验证’阳性质粒测序’保存测序正确的R<W)M C(*!Q"@h<质粒和菌种.提取E M a E N<小鼠脾脏V)M’经逆转录得到<W)M文库’使用引物b W B?@h&S和b W B?@V18.b W B?@h&S(M K b K b K b D M D M K D K D D b b b K K D D b D D b D’b W B?@V18(M M K b K D D M K b b b D K D b D D K K K K K b M D b K b.通过L b V扩增b W B?基因.以R<W)M C(*!Q"@h<为载体构建质粒R<W)M C(*!Q"@b W B?@h<’构建方法同上.保存测序正确的质粒和菌种.上述所有引物中下划线序列皆为酶切位点.&,’,’%b W B?@h<融合蛋白的表达和纯化!用含A#dW_=_)双抗和*#dh E;的完全培养基’在"db c的$C?v温箱中培养$ACK细胞.待细胞铺满培养皿约,#d n?#d的时候’将阳性R<W)M C(*!Q"@b W B?@h<质粒通过磷酸钙法转染$ACK细胞.磷酸钙转染B+小时后’每隔一天收集培养基一次’共计收集B次.然后离心’收集上清用#($$*F膜过滤’使用f7K S9R L S&:172Mf L纯化柱纯化目标蛋白!纯化步骤按说明书进行"’通过;W;@L M D=和^1P:1S2E’&::723检测蛋白纯化结果.&,’,/%细胞黏附分析!纯化的b W B?@h<!终浓度"*3N F a"或E;M!"d"使用f E;;稀释’通过B v过夜孵育固定在A,孔=a U;M板上.用含*#d正常马血清的f E;;溶液室温孵育*小时封闭非特应性结合位点’然后每孔加入*m*#,个E M a E N<小鼠腹腔巨噬细胞!腹腔巨噬细胞分离方法参见文献*C+"室温孵育C#F72.孵育结束后’每孔用f E;;轻轻洗C次’除去未结合的细胞.然后在显微镜下分析巨噬细胞与b W B?@h<或E;M结合状况.&,’,0%细胞标记’荧光显微镜及流式分析!小鼠腹腔巨噬细胞用含"d正常山羊血清的f E;;溶液冰浴封闭*小时’然后用纯化的b W B?@h<!终浓度"F3N F a"冰浴孵育C#F72并标记细胞表面的;U V L(蛋白.孵育结束后用B v预冷的f E;;溶液轻轻润洗C次’用h U K b标记的羊抗兔二抗冰浴孵育C#F72’标记b W B?@h<融合蛋白.孵育结束后用B v预冷的f E;;溶液轻轻润洗C次’然后通过荧光显微镜或流式细胞仪分析标记结果.使用兔U3D*抗体作为阴性对照.’%结果与分析’,&%鼠T!03真核表达载体B;!O6/,&#^$A T!03A(;构建与鉴定从)b E U数据库下载委托公司化学合成家兔U3D*编码氨基酸*?"n B#$的部分h<W)M序列.为了构建R<W)M C(*!Q"@h<重组质粒’首先通过L b V扩增h<W)M序列.L b V反应产物经琼脂糖凝胶电泳分析后’结果显示扩增条带大小为"#TR左右’与预期理论值相符!图*".质粒R<W)M C(*!Q")切胶回收纯化的h< W)M经F&6f*和P+2>U U酶切)K B连接酶处理后形成重组载体R<W)M C(*!Q"@h<’反应混合物转化感受态细胞W f"(’氨苄青霉素抗性筛选后挑取阳性单克隆’扩大培养后提取质粒进行酶切’电泳结果显示酶切产物大小与理论值相符!图*".测序鉴定酶切阳性质粒’序列比对结果显示与数据库一致’说明质粒R<W)M C(* !Q"@h<正确构建.接下来L b V扩增b W B?W)M序列’L b V产物电泳分析’显示条带大小为B?#TR左右’与理论值相符!图*".质粒R<W)M C(*!Q"@h<)纯化L b V产物经酶切)K B连接酶处理后形成R<W)M C(*!Q"@ b W B?@h<重组载体’载体转化感受态细胞W f"(’氨苄青霉素抗性筛选后挑取阳性单克隆’提取质粒进行酶切’电泳结果显示酶切产物大小与理论值相符!图*".测序鉴定酶切阳性质粒’序列比对显示结果与数据库一致’确定质粒R<W)M C(*!Q"@b W B?@h<构建正确.郑州大学学报!理学版"第"#卷9"兔U 3D *h <基因的L b V 扩增#_(W )MF 9S G1S ’*(L b V 扩增兔U 3D *h <基因T "质粒R<W )M C(*!Q "@h <经E &6f U )P +2>U U U 双酶切电泳图#_(W)MF 9S G1S ’*(质粒双酶切<"L b V 扩增兔小鼠b W B?基因#_(W )MF 9S G1S ’*(L b V 扩增小鼠b W B?基因>"质粒R<W )M C(*!Q "@b W B?@h <经0?@U )P +2>U U U 双酶切电泳图#_(W)MF 9S G1S ’*(质粒双酶切图&!构建质粒R<W )M C(*!Q "@b W B?@h <()*+&!b &2P :S 5<:7&2&[R’9P F 7>R<W )M C(*!Q "@b W B?@h<9";W ;@L M D =检测纯化的b W B?@h <蛋白T "^1P :1S 2E ’&::723检测b W B?@h <蛋白图’!分析检测纯化的b W B?@h <蛋白()*+’!M 29’H P 7P 92>>1:1<:7&2&[R5S 7[71>b W B?@h <RS &:172’,’%鼠T !03A (;融合蛋白的表达和纯化培养$ACK 细胞’待细胞铺满培养皿约,#d n ?#d 的时候’将阳性R<W )M C(*!Q "@b W B?@h <质粒通过磷酸钙法转染$ACK 细胞.质粒转染B+0后’每隔一天收集培养基一次’共计收集B 次.然后离心收集上清用#($$*F 膜过滤’使用f 7K S 9R L S &:172Mf L 亲和层析柱纯化目标蛋白’通过;W ;@L M D =检测融合蛋白纯化结果’结果显示融合蛋白分子量为B"GW’与预期值相符!见图$".同时通过^1P :1S 2E ’&::723鉴定兔h <’结果证实鼠b W B?@h <融合蛋白成功表达!见图$".’,/%鼠T !03A (;融合蛋白活性分析’,/,&%细胞标记及流式分析b W B?@h <活性!大量研究已证实b W B?蛋白的配体为;U V L (’而巨噬细胞高表达;U V L (蛋白.要想分析纯化的bW B?融合蛋白活性’可通过b W B?与巨噬细胞表面表达的;U V L (是否相互作用来检测.分离的小鼠腹腔巨噬细胞用"d 血清冰浴封闭’然后用纯化的b W B?@h <!终浓度"F 3N F a "融合蛋白冰育标记细胞表面的;U V L (蛋白.随后用L E ;润洗除去未结合的b W B?@h <’用h U K b 标记的羊抗兔二抗冰育标记b W B?@h <.孵育结束后轻轻润洗除去未结合的荧光二抗’然后通过荧光显微镜或流式细胞仪分析标记结果.使用兔U3D *抗体作为一抗标记的腹腔巨噬细胞做阴性对照.荧光显微镜和流式细胞仪都显示(bW B?@h <可以标记腹腔巨噬细胞!见图C )图B "’而作为对照的兔U 3D *蛋白则不结合腹腔巨噬细胞.这些结果说明纯化的b W B?@h <活性较高.’,/,’%细胞黏附分析b W B?@h <活性!纯化的b W B?@h <用fE ;;稀释至终浓度"*3NF a ’通过B v 过夜孵育固定在A,孔=a U ;M 板上.用含*#d 正常马血清fE ;;溶液室温孵育*小时’封闭=a U ;M 板上非特应性位点’然后每孔加入*m *#,个纯化的小鼠腹腔巨噬细胞’室温孵育C#分钟.孵育结束后’每孔用fE ;;轻轻洗C 次除去未结合的细胞.用固定的兔U 3D *抗体作为阴性对照.然后在显微镜下分析腹腔巨噬细胞与bW B?@h <或兔U 3D *结合状况.镜下观察’显示大量腹腔巨噬细胞与固定的bW B?@h <蛋白相结合’而作为对照的兔U 3D *蛋白则几乎没有腹腔巨噬细胞与之结合.已证实腹腔巨噬细胞高表达b W B?蛋白的配体;U V L (.大量腹腔巨噬细胞与固相b W B?@h <蛋白相结合’不结合兔U 3D *蛋白进一步说明纯化的b W B?@h <活性较高.+#*!第$期郭亚楠#等$小鼠b W B?@h<融合蛋白表达载体构建’表达纯化及其生物学活性研究图/!标记腹腔巨噬细胞表面;U V L(用b W B?@h<融合蛋白()*+/!a9T1’;U V L(&[R1S7:&219’F9<S&R0931<1’’P THb W B?@h<[5P7&2RS&:172图0!用b W B?@h<标记腹腔巨噬细胞;U V L(的流式分析结果()*+0!h’&\<H:&F1:S H929’H P7P&[;U V L(&2:01P5S[9<1 &[R1S7:&219’F9<S&R0931P TH b W B?@h<[5P7&2RS&:172/%讨论近年来b W B?作为自体识别作用中的关键分子&&&$细胞免死%标志而引起重视.研究还证实b W B?蛋白涉及多种临床疾病.在多种恶性肿瘤中’b W B?蛋白皆呈现高表达与;U V L(结合’产生抑制信号使肿瘤细胞逃避免疫细胞吞噬杀伤.研究还发现肿瘤细胞表面b W B?蛋白表达水平与疾病预后成负相关.因此’b W B?成为肿瘤靶向治疗的一个新靶点*B+.已有报道以b W B?作为靶点’通过制备b W B?的单克隆抗体来阻断或抑制b W B?与;U V L(相互作用’可以治疗肿瘤*"Q,+.但人源化抗体制备耗时较长’成本较高.本文尝试表达b W B?融合蛋白’为进一步研究移植)自身免疫性疾病治和肿瘤等相关疾病奠定基础.因b W B?胞外区U3%结构域含有二硫键’在大肠杆菌系统中表达b W B?易形成包涵体发生降解.通过与K S j标签融合’a72等在大肠杆菌中成功表达出b W B?融合蛋白*?+.但大肠杆菌表达融合蛋白常含有内毒素’限制了b W B?的应用.因此’大多数研究采用真核细胞表达b W B?’并用h<作为融合标签’不仅方便纯化’而且有利于提高b W B?@h<融合蛋白在体内的半衰期.经研究’本文采用真核表达系统f=g$ACK细胞表达鼠b W B?胞外区.f=g$ACK细胞转染效率非常高’可通过瞬转质粒’实现外源蛋白的高表达’不需要筛选稳定表达细胞株’节约了时间. f=g$ACK细胞表达鼠b W B?@h<后’通过亲和层析纯化得到了纯度较高的b W B?@h<融合蛋白.进一步通过免疫荧光染色)流式细胞技术和细胞黏附实验’检测融合蛋白b W B?@h<的生物学活性.结果显示’所制备的融合蛋白b W B?@h<具有较高的生物学活性’可与;U V L(很好地相互作用’为进一步研究b W B?的生物学功能以及肿瘤等相关疾病奠定了基础.参考文献!**+!E V c^)=-’h V M/U=V^M.U2:13S72@9P P&<79:1>RS&:172!b W B?"92>7:P’7392>P*-+.K S12>P b1’’E7&’’$##*’**!C"(*C#Q *C".*$+!_6V M K Me’g c K M)U K’c f)U;f U f’1:9’.K01b W B?@;U V L9’R09P7329’’723P H P:1F(7:P R0H P7&’&37<9’S&’1P92>:01S9R15:7< 9RR’7<9:7&2*-+.-E7&<01F’$#*B’*""!,"(CC"Q CBB.*C+!范仕郡’刘鑫’黄敏’等.小鼠腹腔巨噬细胞的快速提取及培养*-+.局解手术学杂志’$#*"’$B!$"(*C#Q*C*.*B+!;c K c@L M)K c-MWV’;K=U)=%’V c D=V;)_’1:9’.K01S9R15:7<&RR&S:527:71P[&S:9S31:723:015T7J57:&5P<1’’P5S[9<1S1@ <1R:&S b W B?*-+.=j R1S:c R72K01S K9S31:P’$#*C’*?!*"(+A Q*#C.*"+!^=U;g c L hg.b92<1S7F F52&:01S9RH:9S31:723:01b W B?N;U V L9’R099j7P*-+.=5S&R192O&5S29’&[<92<1S’$#*?’?,(*##Q *#A.*,+!E V U D f K^=a aV_’D V/M)g c^;g U g;’a=a=;’1:9’.K01b W B?$>&29:19:F1P7329’%7P0730’H1j RS1P P1>7205F92&@ 89S792<92<1S*-+.D H21<&’&37<&2<&’&3H’$#*,’*BC!$"(CAC Q CA?.*?+!a U)e’e M)i‘’e M)Dh’1:9’.;&’5T’11j:S9<1’’5’9S>&F972P&[05F92;U V L(92>b W B?1j RS1P P1>72U,>?E B+>?+&>@#+12@ 092<1P:01R093&<H:&P7P&[’15G1F79<1’’P TH F9<S&R0931P7287:S&*-+.L S&:1721j RS1P P7&292>R5S7[7<9:7&2’$#*$’+"!*"(*#A Q **,.A#*#**郑州大学学报!理学版"第"#卷8\B><G G)C7’-P>)Q);:D)C7:7=T9:>:;D<>)Z:D)C7CQ ECP G<T!03A(;(P G)C7->CD<)7)7E:I I:H T<H H GD6ce9l292’b f=)e923’b6U a7>&23’/f M c_17O71’/f 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P9@f&’F系统b95<0H问题解的解析性*-+.西北大学学报!自然科学版"’$#*,’B,!$"( *B Q*+.*"+!a U6-’e U)/.c2:01b95<0HRS&T’1F&[9:\&@<&F R&212:T@[9F7’HP H P:1F*-+.)&2’7219S929’H P7PS19’\&S’>9RR’7<9:7&2P’$#**’*$!,"(C,#+Q C,$#.*,+!e M)g’e U)/.M29’H:7<P&’5:7&2P&[:01b95<0HRS&T’1F[&S:\&@<&F R&212:P09’’&\\9:1SP H P:1F P*-+._9:01F9:7P<01 417:P<0S7[:’$#**’$,A!C N B"(***C Q**$?.*?+!f U_c)M;M M’_U;U c a=g D.M29’H:7<7:H&[:01b95<0HRS&T’1F[&S9272:13S9T’118&’5:7&21J59:7&2*-+._9:01F9:7P<01 9229’12’$##C’C$?!C"("?"Q"+B.67:H@D);)D@CQ D9<T:P;9@->CJ H<I Q C>D9<U L CA;CI B C7<7D O C?)S C?M@G D<I/f M)Da7*’$’D M c-592O592*’$!*$9>?@@#@A C&%?E6&%+>,’V@B%?Q E,%H2+I E B,+%5’0+7&2?*#*$?’J?+2&#$$J E2%E B A@B V@2#+2E&B9%K/+E,’V@B%?Q E,%H2+I E B,+%5’0+7&2?*##,A’J?+2&"6J G D>:;D(K01929’H:7<7:H&[:01b95<0H RS&T’1F[&S:01:\&@<&F R&212:)&87G&8P H P:1F\9P<&2<1S21>.E9P1>&2:01\1’’R&P1>21P P S1P5’:[&S:07P RS&T’1F’:01929’H:7<7:H&[7:P P&’5:7&2P\9P RS&81>72T&:089S@ 79T’1P’3’&T9’’H72P R9<192>’&<9’’H72:7F1TH b95<0H@g&\9’18P G7:01&S1F.K<@L C>=G(:\&<&F R&212:)&87G&8P H P:1F#\1’’R&P1>21P P#929’H:7<7:H!责任编辑(方惠敏"。
过表达质粒构建原理
过表达质粒构建原理一、目的基因获取过表达质粒构建的第一步是获取目的基因。
目的基因通常是从基因文库、PCR扩增或者人工合成等方法中获得。
确保目的基因序列的准确性是至关重要的，因为任何突变都可能影响后续的表达结果。
二、载体质粒选择选择适当的载体是构建成功的关键。
常用的载体有质粒、病毒载体等。
在选择载体时，应考虑其容量、复制能力、插入位点等因素，以确保目的基因能够高效地导入宿主细胞并稳定表达。
三、限制性内切酶处理限制性内切酶是一种特异性切割DNA的酶，用于在目的基因和载体质粒上产生相同的黏性末端，以便进行接下来的连接反应。
选择适当的限制性内切酶，并控制其切割时间，可以确保目的基因和载体质粒的准确切割。
四、连接反应连接反应是将目的基因和载体质粒结合的过程，通常在DNA连接酶的作用下完成。
在连接反应中，需要控制反应条件，以确保目的基因和载体质粒的正确结合。
连接后的产物称为重组质粒。
五、转化宿主细胞重组质粒需要导入宿主细胞中进行表达。
选择合适的宿主细胞，如细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞等，根据宿主细胞的特性，采用适当的转化方法，如电穿孔、化学转化或转染等，将重组质粒导入宿主细胞。
六、筛选与鉴定转化后的宿主细胞需要进行筛选和鉴定，以确定是否存在重组质粒。
通过抗性筛选、PCR鉴定或DNA测序等方法，可以初步筛选出含有目的基因的重组质粒。
进一步通过表达产物检测和稳定性检测等手段，对重组质粒进行全面鉴定。
七、表达产物检测表达产物检测是验证目的基因是否成功表达的重要步骤。
通过Western blot、免疫荧光或酶联免疫等检测方法，可以对重组质粒的表达产物进行定量和定性分析。
比较表达前后的蛋白质变化，以评估过表达的效果。
八、稳定性检测稳定性检测是为了评估重组质粒在宿主细胞内的稳定性。
在细胞培养过程中，对目的基因的表达进行定期检测，观察其在不同传代过程中的表达水平变化。
稳定性良好的过表达质粒能够在多次传代后仍保持稳定的表达水平。
CaM突变体质粒的构建、表达纯化及活性鉴定
CaM突变体质粒的构建、表达纯化及活性鉴定苏敬阳;郝丽英;王蓉蓉;袁媛;李松霖;朱正南;黄露婷;封瑞;邵冬雪;孙雪菲【摘要】Objective To construct a CaME141G fusion protein-expressing plasmid,and to express,purify,and identify the activity of the recombinant protein. Methods The 141st site of the wild type CaM,E (GAG),was mutated to G (GGG),using site-specific mutagenesis technology. Escherichia coli BL-21 was transformed with the mutant plasmid. The GST-CaME141G fusion protein was mass-cultured and induced for expression. Subsequently,the GST-CaME141G fusion protein was purified using GS-4B beads. PreScission protease was applied to remove the GST,the Bradford method used to determine the concentration of purified protein,and SDS-PAGE used to detect its relative molecular weight and purity. The GST pull-down assay was used to study the protein's biological activity. Results The CaME141G protein was successfully purified at a high concentration and purity. The protein could interact with PreIQ protein fragments from the myocardial CaV1. 2 calcium channel C terminal,in a CaME141G concentration-dependent manner. Therefore,CaME141G has the ability to bind with the CaV1. 2 calcium channel. Conclusion This study successfully constructed a CaME141G fusion protein-expressing plasmid and purified the CaME141G protein. This lays a foundation for regulating the function of CaM mutations in the myocardial CaV1. 2 calcium channel,and for the study of its relationship with diseases of the cardiovascular system.%目的制备钙调蛋白(CaM)突变体CaME141G的融合蛋白质粒,并进行蛋白表达、提取纯化和活性鉴定.方法利用定点突变技术将野生型CaM的第141个氨基酸E(GAG)突变为G(GGG),再将突变体质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,大量培养后诱导其GST 融合蛋白表达,GS-4B beads纯化,PreScission protease酶切GST标签,采用Bradford方法测定纯化后蛋白浓度,SDS-PAGE凝胶电泳检测CaME141G蛋白的相对分子量和纯度,pull-down实验鉴定纯化后蛋白的生物活性.结果提取纯化后的CaME141G蛋白具有较高的浓度和纯度,且能与心肌CaV1. 2钙通道C末端的PreIQ蛋白片段结合,并具有CaME141G蛋白浓度依赖性,提示该蛋白具有与心肌CaV1. 2钙通道结合的能力.结论成功构建了CaME141G融合蛋白质粒,并获得了纯化后的CaME141G蛋白,为深入研究CaM突变体在心肌CaV1. 2钙通道中的调节作用及其与心血管系统疾病的关系奠定了基础.【期刊名称】《中国医科大学学报》【年(卷),期】2018(047)002【总页数】5页(P97-101)【关键词】钙调蛋白;突变体;质粒;表达纯化;pull-down实验【作者】苏敬阳;郝丽英;王蓉蓉;袁媛;李松霖;朱正南;黄露婷;封瑞;邵冬雪;孙雪菲【作者单位】中国医科大学药学院药物毒理学教研室, 沈阳 110122;中国医科大学药学院药物毒理学教研室, 沈阳 110122;中国医科大学药学院药物毒理学教研室, 沈阳 110122;中国医科大学药学院药物毒理学教研室, 沈阳 110122;中国医科大学药学院药物毒理学教研室, 沈阳 110122;中国医科大学药学院药物毒理学教研室, 沈阳 110122;中国医科大学药学院药物毒理学教研室, 沈阳 110122;中国医科大学药学院药物毒理学教研室, 沈阳 110122;中国医科大学药学院药物毒理学教研室, 沈阳 110122;中国医科大学药学院药物毒理学教研室, 沈阳 110122【正文语种】中文【中图分类】R96钙调蛋白（calmodulin，CaM）是体内一种重要的Ca2+感受器和信号转导蛋白，广泛存在于各种真核生物细胞中［1-2］。
GATA1不同激酶活性突变体质粒的构建及蛋白表达和亚细胞定位
GATA1不同激酶活性突变体质粒的构建及蛋白表达和亚细胞定位李丹妮;刘云鹏【摘要】目的采用大引物法构建GATA1不同激酶活性突变体GATA1 S161AS187A(死型)和GATA1 S161D S187D(激活型)真核表达载体,并证实其融合蛋白在细胞内的表达及定位,旨在进一步探讨其生物学功能和潜在肿瘤治疗靶点.方法以GFP-GATA1WT为模板,采用大引物法扩增S161A S187A、S161D S187D突变体片段,双酶切克隆至pEGFP-C1表达载体中,将重组质粒转染至HEK293中,经免疫印迹鉴定融合蛋白的表达.结果用大引物PCR法成功构建GATA1不同激酶活性突变体的真核表达载体pEGFP-GATA1 S161A S187A和pEGFP-GATA1 S161D S187D,验证了其融合蛋白表达.共聚焦激光显微镜技术显示,融合蛋白主要定位于细胞核内.结论利用大引物法成功构建GATA1不同激酶活性突变体真核表达载体,并为进一步进行该突变体的结构和功能研究奠定了基础.%Objective The GATA1 mutant GATA1 S161A S187A (death type) and GATA1 S161D S187D (activated) eukaryotic expression vectors were constructed using the large primer method,and,to explore their biological function and potential tumor treatment targets,the expression and localization of the fusion protein in cells were confirmed. Methods S161A,S187A,S161D,and S187D mutants were amplified by GFP-GATA1 WT,which served as the template. The recombinant plasmid was cloned into a pEGFP-C1 expression vector and transfected into HEK293 cells by immunoblotting expression of the fusion protein. Results The eukaryotic expression vectors pEGFP-GATA1S161A S187A and pEGFP-GATA1 S161D S187D were successfullyconstructed using the high primer PCR method,and expression of the fusion protein was verified. Confocal laser microscopy showed that the fusion protein was mainly located in the nuclei of HEK293 cells. Conclusion A eukaryotic expression vector of a GATA1 mutant was successfully constructed using the large primer method. This work lays the foundation for further studies on the structure and function of the mutant.【期刊名称】《中国医科大学学报》【年(卷),期】2018(047)001【总页数】5页(P22-26)【关键词】GATA1;PAK5;磷酸化;基因克隆;融合蛋白;转染【作者】李丹妮;刘云鹏【作者单位】中国医科大学附属第一医院肿瘤内科, 沈阳 110001;中国医科大学附属第一医院肿瘤内科, 沈阳 110001【正文语种】中文【中图分类】R730.23;Q782PAK5作为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（p21-activated kinases，PAKs）的一员，可以磷酸化底物GATA1的Ser161和Ser187位点，并协同GATA1发挥重要的转录调控功能。
肿瘤相关抗原MART-1蛋白原核表达载体的构建、表达纯化和活性鉴定
肿瘤相关抗原MART-1蛋白原核表达载体的构建、表达纯化和活性鉴定孟昭婷;李凯;颜焱锋;焦顺昌【期刊名称】《解放军医学杂志》【年(卷),期】2011(36)9【摘要】目的构建编码肿瘤相关抗原MART-l融合基因的原核表达载体,在大肠埃希菌中表达His-MART-1融合蛋白,并对蛋白进行纯化和免疫原性鉴定.方法采用PCR法扩增编码MART-1的基因片段,将该基因片段克隆到含有His标签的pET-28b原核表达载体上,重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定正确后转化大肠埃希菌,IPTG诱导融合蛋白表达,用镍离子亲和层析法纯化融合蛋白并进行脱盐,SDS-PAGE电泳和Western blotting法鉴定.通过ELISA法检测经树突状细胞提呈后的His-MART-1融合蛋白对特异性CD4+T细胞的刺激作用.结果重组质粒经双酶切、PCR和测序鉴定证明载体构建成功.His-MART-1融合蛋白经表达纯化后,分子量约13kD,与预期值相符.Western blotting证实该融合蛋白可与抗His单克隆抗体发生特异性结合.His-MART-1融合蛋白经树突状细胞提呈后能刺激MART-1特异性CD4+T细胞分泌IFN-γ.结论成功构建了编码MART-1基因原核表达载体pET-28b- MART-1,表达及纯化获得该融合蛋白,并证实其具有良好的免疫原性.%Objective To construct a prokaryotic expression plasmid containing a fusion gene of MART-1 expressing the His-MART-1 fusion protein in E. Coli, and to purify the protein and identify the immunogenicity of His-MART-1. Methods The MART-1 coding sequence was amplified by polymerase chain reaction (PCR), and then cloned into the prokaryotic expression vector(pET-28b) containing His tag. The constructed vector, verified by restriction endonuclease digestion, PCR and DNA sequencing, was then transformed into E. Coli for expression. The expression of MART-1 recombinant protein was induced by IPTG in E. Coli, purified with Ni2+-NTA affinity chromatography method, and identified by SDS-PAGE and Western blotting. ELISA was used to detect the IFN-y expression secreted by the His-MART-1 specific CD4+ T cells which recognized the His-MART-1 fusion protein presented by dendritic cells (DCs). Results The successful construction of recombinant plasmid was confirmed by restriction digestion, PCR and sequencing. The molecular weight of the purified fusion protein was identified as 13kD by SDS-PAGE, which was identical to the expected value. It was confirmed by western blotting that His-MART-1 fusion protein could be recognized by His monoclonal antibody. ELISA analysis showed that His-MART-1 fusion protein presented by DCs could induce IFN-γ secretion of MART-1 specific CD4+ T cells. Conclusion The recombinant plasmid of pET-28b-MART-l has been successfully constructed. The expressed His-MART-1 fusion protein has been purified and the immunogenicity of inducing responses between DCs and CD4+ T cells has been determined.【总页数】3页(P909-911)【作者】孟昭婷;李凯;颜焱锋;焦顺昌【作者单位】南开大学医学院;300060 天津天津医科大学附属肿瘤医院肺部肿瘤内科、天津市肿瘤防治重点实验室;100071 北京军事医学科学院微生物流行病研究所;100853 北京解放军总医院肿瘤中心【正文语种】中文【中图分类】R746.2【相关文献】1.Flt3配体基因原核表达载体的构建、表达、纯化及生物学活性鉴定 [J], 刘小林;段秀梅;方艳秋;谭岩;史宏博;车媛媛;刘力华2.HIV-1 Tat基因重组原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与功能鉴定 [J], 邱会平;程晓东;卢春3.含KSHV vIL-6基因原核表达载体的构建及融合蛋白的表达纯化与鉴定 [J], 葛高霞;王平;卢春4.人sCR1活性片段原核表达载体的构建与蛋白表达及生物活性鉴定 [J], 汪正清;罗雪;谭兵5.人野生型S100A10原核表达载体的构建、蛋白表达纯化及鉴定 [J], 王德利;尹显贵;杨华;李赫因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重组融合蛋白MBP-BSH在大肠杆菌中的表达及其纯化、功能鉴定
注：Apr. 具有氨苄青霉素抗性；Kanr. 具有卡那霉素抗性；m-MBP. 具有 MBP 双突变 A317V/I322V。
来源
实验室筛选保藏 实验室保藏 实验室保藏
日本 TaKaRa 公司 尚广东博士馈赠 尚广东博士馈赠 尚广东博士馈赠 尚广东博士馈赠 尚广东博士馈赠 尚广东博士馈赠 尚广东博士馈赠
purification efficiency for MBP-BSH protein than Amylose resin. In addition, His-Tag linked at the C-terminal was favorable
for the binding of nickel ions and as a result, MBP-BSH containing less impurities was obtained in a higher yield. The enzymatic
限制性内切酶 BamHⅠ和 XhoⅠ、250bp DNA Ladder Marker、λ/HindIII DNA Marker、pMD18-TTA 克 隆试剂盒、质粒提取试剂盒和 DNA 凝胶回收纯化试剂 盒 宝生物工程(大连)有限公司；Protein Marker Mid Range、氨苄青霉素、卡那霉素 上海生工生物工程技 术有限公司；酵母粉、胰蛋白胨 英国 Oxoid 公司； T4 DNA 连接酶 美国 New England Biolabs 公司；Amylose Resin、Ni-NTA Resin 德国 Novagen 公司。 1.3 bsh 基因的克隆及测序
海南斑等蝎钾通道阻断剂 Im58的克隆、表达、纯化和鉴定
海南斑等蝎钾通道阻断剂 Im58的克隆、表达、纯化和鉴定尹世金;兰珍;李羽欣【摘要】To express potassium channel blocker Im58, full length DNA sequences of Im58 was amplified by overlap PCR with four designed primers and the cloning with the right sequence was transformed to E. coli/Rosetta ( DE3 ) by vector pGEX-4T-1. Under different inducing time and IPTG concentrations, the expressing quantities of fusion protein were investigated to optimize the inducing conditions. Then the recombinant GSH-fusion proteins were purified by GSH affinity chromatography, treated with enterokinase and purified by C18 column of RP-HPLC. The sample of Im58 purifying peptides was obtained to identify the molecular weight and purity by SDS-PAGE Gel of Tricine system. Accurate molecular weight was also identified by MALDI-TOF-MS. The results showed that the prokaryotic expression plasmid of Im58 was successfully constructed by positive clone. Moreover, the expression, purification and identification of Im58 were confirmed by SDS-PAGE Gel of Tricine system and MALDI-TOF-MS.% 为表达钾离子通道阻断剂Im58,设计了4条搭桥 PCR 引物,通过overlap PCR 的方法扩增出蝎毒肽 Im58 DNA全长片段,选用表达载体pGEX-4T-1,将测序正确的克隆转化至大肠杆菌 E. coli/Rosetta(DE3)中.通过检测不同诱导时间和IPTG浓度下融合蛋白的表达量,筛选出最优表达条件.表达蛋白经 IPTG 诱导后,融合蛋白再经GSH亲和层析柱纯化,将洗脱液经超滤浓缩脱盐、纯化后得GST-Im58融合蛋白,蛋白用小肠激酶酶切后通过 RP-HPLC C18柱分离获得色谱纯的蝎毒肽.蝎毒肽通过 Tricine 系统的 SDS-PAGE 蛋白质电泳鉴定重组多肽的分子量大小和纯度,并由 MALDI-TOF-MS 来精确测定重组多肽的分子量.结果表明：Im58阳性克隆子证明成功构建了Im58原核表达载体,Tricine 系统的 SDS-PAGE 蛋白质电泳和MALDI-TOF-MS鉴定Im58多肽表达纯化成功.【期刊名称】《中南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(000)002【总页数】5页(P36-40)【关键词】钾离子通道阻断剂;Im58;原核表达;蛋白纯化【作者】尹世金;兰珍;李羽欣【作者单位】中南民族大学生物医学工程学院，武汉430074;中南民族大学生物医学工程学院，武汉430074;中南民族大学生物医学工程学院，武汉430074【正文语种】中文【中图分类】TQ464.9;Q784蝎是生存了4亿多年最古老的物种之一［1］，蝎在进化中形态没有很大变化，这与其有一套用于捕食和防御的有效武器——蝎尾腺分泌的毒液有关.蝎毒素是一类由20～80个氨基酸组成的小肽(2～9Kd)，能够选择性地与细胞膜上的K+、Na+、Cl-和Ca2+等离子通道结合，调节细胞对离子的通透能力，进而影响动物机体、组织和细胞的生理功能［2-7］.作用于K+通道的蝎毒肽是一类由20～40个氨基酸通过3或4个二硫键交联而成的具有多种生物活性的小分子多肽，它不仅可作为研究相关的靶离子通道受体调控胞内信息转导的分子探针，还可为构建系列肽类药物提供理想的分子模板［8］.序列比对分析表明，从海南斑等蝎毒腺分离的Im58多肽是哺乳动物Kv1.3通道的阻断剂.Kv1.3通道是电压门控钾通道Kv1.x亚家族中的一员，它在哺乳动物体内分布较广，主要表达在脑、肺、胸腺、脾等组织的 T细胞膜上［9］.当人体自身免疫失调时，体内的T细胞发生大量的激活，增殖和分化，引起自身免疫疾病.研究表明，Kv1.3通道在调节T细胞的膜电位及钙离子信号转导途径中起着非常重要的作用，T细胞表面的Kv1.3通道数目的变化与自身免疫疾病密切相关［10］.近年来国内外正在积极开展自身免疫疾病的治疗，研究表明钾通道Kv1.3可以作为治疗自身免疫疾病的药物靶标，研发靶向钾通道Kv1.3调节剂已成为新型免疫抑制药物的发展方向［11］.在各种有毒动物的天然毒素中，大部分高亲和性Kv1.3通道阻断剂都来自蝎毒素［12］.故以蝎毒肽为基础筛选与设计多肽药物寻找高特异性和选择性的Kv1.3通道调节剂，具有重要的理论意义和应用价值.本研究采用基因重组技术成功构建了Kv1.3通道阻断剂的原核表达载体PGEX-4T-1-Im58，表达、纯化和鉴定了新型蝎毒肽Im58，为进一步研究Im58的生物学功能奠定了基础.1 材料和方法1.1 材料与试剂表达质粒 PGEX-4T-1、实验菌株DH5α、E.coli/Rosetta(DE3)等由武汉大学病毒及分子癌学实验室李文鑫教授课题组提供.限制性内切酶 BamHI、XhoI、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、PCR 所用试剂和酶(TakaRa公司，日本)，T4DNA连接酶、PCR产物回收试剂盒、DNA Marker(Fermentas公司，加拿大)，质粒小量快速提取试剂盒、琼脂糖胶回收试剂盒、小肠激酶(武汉摩尔肽公司)，还原型谷胱甘肽(GSH，武汉众一生物技术公司)，小分量蛋白Marker(武汉凌飞生物技术公司)，10KD截流的超滤管(Milipore公司，德国)，其他试剂均为国产分析纯.1.2 扩增Im58基因序列从海南斑等蝎的毒腺cDNA文库中，分离得到一条新的cDNA Im58，根据其成熟肽的序列和大肠杆菌偏好的密码子，设计的4条overlap引物见表1.表1 Overlap PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for overlap PCR* 单划线为BamhI酶切位点，双下划线为EK酶酶切位点;▲单划线为XhoI酶切位点引物名称引物序列(5’-3’)CTGGGATCCGATGACGATGACAAGCAGGTGCATACCAAAATTATGTGC ACCAAAATTATGTGCAGCGTGAGCCGCGAATGCTATGAACCGTGCCAT CATGCATTTGCCATGCGCGCGGCCGGTCACGCCATGGCACGGTTCATA Im58-FP1 Im58-FP2 Im58-RP2 Im58-RP1*GCATTTGCCATG▲CCGCTCGAGTCACCAATAGCAGGTGCATTTTTTGTTC ATIm58的基因通过2轮PCR扩增获得:第1轮PCR用引物Im58-FP2和Im58-RP2进行overlap PCR扩增.然后将第1轮PCR产物稀释100倍为模板，以引物Im58-FP1和Im58-RP1进行第2轮PCR.两次PCR反应条件均为:95℃预变性5 min，95℃变性 30 s，55℃ 复性 30 s，72℃ 延伸 45 s，72℃ 延伸 5 min，循环25次.PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶成像系统进行观察分析，并用PCR产物回收试剂盒回收纯化.1.3 PGEX-4T-1-Im58重组表达质粒的构建将回收纯化的PCR产物和表达载体PGEX-4T-1用BamHI和XhoI双酶切，37℃酶切12 h后，酶切产物分别电泳，并对双酶切的Im58片段和载体片段分别用PCR产物回收试剂盒和琼脂糖胶回收试剂盒回收纯化.分别取酶切的Im58片段和载体片段以1∶3的比例混合后，在T4DNA连接酶作用下22℃，1 h连接.构建重组表达载体.1.4 阳性重组克隆的筛选将连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃温箱培养过夜后，从含Amp的LB平板上挑取3个单克隆，接种于含Amp的LB液体培养基37℃培养5 h，再用PCR扩增对培养物检测.PCR的引物，反应条件和过程同1.2，扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测.提取阳性克隆的质粒，用BamHI和XhoI酶切重组质粒，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒酶切产物，对筛选的阳性克隆测序.1.5 融合蛋白诱导时间和诱导剂浓度的选择将测序正确的Im58重组载体转化入表达菌种E.coli/Rosetta(DE3).将表达菌37℃摇过夜，次日取菌液1 mL，接种于含Amp(100 μg/mL)的100mL LB液体培养基，37℃培养到OD600=0.6时，取培养的菌液10 mL，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG进行诱导.再将菌液在28℃培养5 h，分别于2，3，4，5 h吸取菌液2 mL，离心、PBS重悬菌体并超声破碎，取上清进行Tricine系统的SDS-PAGE电泳.同法取培养的菌液5管，每管5 mL，加入IPTG的终浓度分别为0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 mmol/L 于28℃继续培养4 h.各收集菌液2 mL，离心、PBS 重悬并超声破碎，取上清进行Tricine系统的SDS-PAGE电泳.1.6 融合蛋白的表达纯化在含Amp的LB液体培养基中接种表达菌，接种量为1∶100，一次表达1 L，37℃培养到 OD600=0.6时，加入终浓度为0.2 mmol/L的 IPTG进行诱导，再将菌液在28℃培养4 h，离心收集菌体.加入40 mL PBS重悬，超声破细胞，离心收集上清，将收集的上清加入到GSH层析柱中.用PBS缓冲液冲洗GSH亲和层析柱以去除杂蛋白，再用40 mL的GSH洗脱液洗脱融合蛋白.将收集到的融合蛋白用10KD截流的超滤管离心浓缩脱盐至每升菌液约1 mL.超滤得到浓缩的融合蛋白用EK酶酶切，23～25℃水浴酶切过夜.1.7 蝎毒肽Im58的RP-HPLC纯化酶切混合液离心后，取上清进行RP-HPLC分离纯化.HPLC的上样体积是1 mL，流速为5 mL/min.RP-HPLC的固定相是C18反相柱，流动相为:溶液B是0.1%TFA，溶液D是0.1%TFA+90%的乙腈.RP-HPLC的洗脱梯度:60 min线性梯度，初始B的体积比为95%，D为5%，结束时 B的体积比为5%，D为95%;测量波长为230 nm.1.8 纯化的重组蝎毒肽的鉴定将表达纯化各个步骤的蛋白样品取样，进行Tricine系统的SDS-PAGE蛋白质电泳，初步鉴定多肽的分子量大小及纯度.并取蛋白样通过MALDITOF-MS精确测量多肽的分子量.2 结果和分析2.1 重组表达载体的构建PGEX-4T-1-Im58重组表达质粒的构建如图1所示，PGEX-4T-1载体是带GST 标签含Amp抗性的克隆载体，GST标签在目的片段Im58前面，这种带GST标签的融合蛋白组合有利于蛋白表达纯化.图1 载体PGEX-4T-1-Im58的构建Fig.1 Construction of vector PGEX-4T-1-Im58注:箭头所指示为Im58基因插入位点2.2 Im58基因的扩增通过overlap PCR扩增两次获得Im58全长片段，如图2所示，经2%的琼脂糖凝胶电泳，可以见一条长度为150bp的明亮的条带，与理论值相符合.图2 Im58基因扩增产物Fig.2 The amplification product of Im58 geneM)DNA标准;1)PCR扩增产物Im58基因2.3 重组质粒的鉴定如图3所示，通过PCR鉴定和BamHI、XhoI双酶切重组克隆质粒鉴定法，获得了约150 bp的目标片段，证明重组质粒 PGEX-4T-1-Im58已经构建成功.图3 重组质粒PGEX-Im58的分子鉴定Fig.3 Identification of the recombinedplasmid PGEX-Im58a)菌落PCR的鉴定结果:1)水，阴性对照;2)DNA标准;3)质粒阳性对照;4～6)不同菌落;b)BamHI和Xho酶切鉴定结果:1)Im58基因;2)酶切质粒;M)DNA标准2.4 表达条件的优化不同诱导条件，融合蛋白的表达结果见图4.由图4可见，在28℃诱导条件下，IPTG的终浓度为1 mmol/L，诱导时间为2，3 h时产量均较低，当诱导时间为4，5 h时产量较高.若 IPTG浓度为0.2 mmol/L时产量略高;故确定融合蛋白表达的最佳条件为:28℃，0.2 mmol/L IPTG，诱导 4 h.图4 不同表达条件下融合蛋白在Tricine系统的SDS-PAGE电泳分析Fig.4 Analysis of fusion protein by SDS-PAGE of Tricine system under different expression conditionsM)蛋白标准;1)未诱导蛋白;2～5)28℃，1mmol/L IPTG下诱导2，3，4，5 h产生的蛋白;6～10)0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 mmol/L IPTG在28℃培养4 h产生的蛋白2.5 融合蛋白的表达纯化融合蛋白的表达纯化结果见图5.图5 Im58多肽在Tricine系统的SDS-PAGE的表达纯化Fig.5 The expression and purification of Im58 peptide by SDS-PAGE of Tricine system1)未诱导蛋白;2)IPTG诱导4h后的蛋白;3)纯化并超滤脱盐得到浓缩的GST-Im58;4)融合蛋白EK酶切后的混合产物;5)RP-HPLC分离纯化后的Im58多肽;M)蛋白标准由图5可见，包含重组质粒的大肠杆菌Rosseta培养到OD600=0.6时，加入0.2 mmol/L IPTG 诱导4 h后，细胞上清蛋白中多出一条约30KD的条带，这是由于在重组表达 Im58的系统中，在 Im58(4KD)前面融合了一个26KD的GST(谷胱甘肽转移酶)标签所形成的GST-Im58融合蛋白.经GST亲和层析柱纯化所得GST-Im58融合蛋白，经超滤脱盐浓缩，蛋白浓度较高.浓缩后的蛋白用EK酶酶切，产生一条26KD的带(谷胱甘肽转移酶)和一条4KD(目的蛋白Im58)的条带.2.6 蝎毒肽的RP-HPLC分离纯化蝎毒肽的RP-HPLC分离纯化结果见图6.如图6所示，经EK酶酶切后的蛋白混合物经RP-HPLC用C18柱分离纯化，60 min溶液梯度线性洗脱，230 nm紫外波长下检测，蝎毒肽Im58得到了很好的分离.图6 Im58经HPLC的分离纯化Fig.6 Separation and purification of Im58 by HPLC2.7 蝎毒肽的分子量鉴定蝎毒肽的分子量鉴定结果见图7.由图7可见，将经RP-HPLC纯化的蝎毒肽进行MALDI-TOF-MS测定分子量，测得分子量为4369.38，与预期分子量4369.4 一致.图7 Im58的分子量鉴定Fig.7 Identify the molecular weight of Im583 讨论蝎毒素是一类富含二硫键的小肽，其中大部分多肽可作用不同类型的离子通道，在研究离子通道的性质和药物开发等方面具有重要的应用价值.蝎毒素由于富含二硫键，在重组表达毒素过程中常有诸多困难，如二硫键不能正确配对，表达产物易降解，缺乏转录加工修饰蛋白的机制等.本实验采用GST融合表达系统成功地在大肠杆菌 E.coli/Rosetta(DE3)中表达了GST-Im58.GST融合表达系统广泛用于各种融合蛋白的表达，该系统与其他系统相比表达效率高，操作简便，表达的蛋白质带有GST头部，可利用含有还原型谷胱甘肽的纯化柱进行纯化，得到单纯的融合蛋白，去除背景蛋白的干扰;它还具有剪切的功能，可将GST的头部切除，得到单一的目的蛋白，进行相关功能的研究［13］.为获得和天然毒素氨基酸序列相同的蝎毒素，本研究选用单向识别切割的小肠激酶(EK酶)，它能识别DDDDK序列，并且在K之后切割蛋白，获得的蛋白在N端不含多余的氨基酸序列，并对一些表达条件和工艺进行了优化，使重组蝎多肽纯度高并具有良好生物活性.由于蝎多肽基因是真核生物的基因，其蛋白编码采用的密码子与大肠杆菌有一定的区别，采用大肠杆菌表达会在翻译水平上对蛋白质表达产生不良的影响，故本研究采用经过修饰的Rosetta菌株，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达［14］.本研究为融合蛋白的原核表达提供一定的参考价值，同时本实验成功表达了Im58多肽，可直接用于深入研究其生物学功能.致谢:感谢武汉大学病毒及分子癌学实验室李文鑫教授课题组提供的材料和陈宗运博士方法上的指导.参考文献【相关文献】［1］Briggs D E G.Scorpions take to the water［J］.Nature，1987，326:645-646.［2］Debont T，Swerts A，Van der Walt J J，et parison and characterization of the venoms of three Parabuthus scorpion speciesoccurring in southern Africa［J］.Toxicon，1998，36(2):341-352.［3］Garcia M L，Hanner M，Knaus H G，et al.Pharmacology of potassium channels ［J］.Adv Pharmacol，1997，39:425-471.［4］Gordon D，Savarin P，Gurevitz M，et al.Functional anatomy of scorpion toxins affecting sodium channels［J］.J Toxicol 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ｗａｓ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｐｕｒｉｆ ｉｅｄ ａｔ ａ ｈｉｇｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｔｙ．Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｌｄ ｉｎｔｅｒａｃｔ ｗｉｔｈ ＰｒｅＩＱ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ
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（中国医科大学药学 院药 物毒理 学教研 室 ，沈阳 １１０１２２）
摘 要 目的 制备钙调蛋 白 （ＣＡＭ）突变体ＣａＭ 。。的融合蛋 白质粒 ，并进行蛋 白表达 、提取 纯化 和活性鉴 定。方法 利 用定点突 变技 术将野 生型ＣａＭ的第１４１个氨基酸Ｅ（ＧＡＧ）突变为Ｇ（ＧＧＧ），再将 突变体质粒转化 大肠杆 菌ＢＬ２１感受态细胞 ，大量培 养后诱 导 其 ＧＳＴ融 合 蛋 白表 达 ，ＧＳ．４Ｂ ｂｅａｄｓ纯化 ，ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ酶 －Ｄ￣ＧＳＴ标 签 ，采 用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ方 法 测 定 纯 化 后 蛋 白浓 度 ，ＳＤＳ—ＰＡＧＥ 凝 胶 电 泳检 ￣ＮＣａＭ Ｇ蛋 白 的相 对分 子 量 和 纯 度 ，ｐｕｌｌ—ｄｏｗｎ实验 鉴 定 纯化 后 蛋 白的 生 物 活 性 。结 果 提 取 纯化 后 的 ＣａＭ 。蛋 白 具有较 高的浓度和纯度 ，且 能与 ￣２）Ｙｔ，Ｃａｖ１．２钙通道ｃ末端 的ｐｒｅｌＱ蛋 白片段 结合 ，并具有ＣａＭ 。蛋 白浓度依赖性 ，提 示该蛋 白具 有 与·￣２Ｙ￣Ｃａｖ１．２钙通道 结合 的能力。结论 成功构建 了ＣａＭⅢ 融合蛋 白质粒 ，并获得 了纯化后的ＣａＭ ．。蛋 白，为深入研 究ＣａＭ 突变体在心肌ｃａ １．２钙 通道 中的调 节作用及其与心血管 系统 疾病 的关系奠定 了基础。 关键词 钙调蛋 白；突变体 ；质粒；表达纯化 ；ｐｕｌｌ—ｄｏｗｎ实验 中 图 分 类 号 Ｒ９６ 文 献标 志 码 Ａ 文 章 编 号 ０２５８—４６４６（２０１８）０２—００９７—０５ 网 络 出版 地 址 ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／２１．１２２７．Ｒ．２０１８０１０８．１０５４．００４．ｈｔｍｌ Ｄ０Ｉ：１０．１２００７／ｊ．ｉｓｓｎ．０２５８—４６４６．２０１８．０２．００１
ｉｎｄｕｃｅｄ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ，ｔｈｅ ＧＳＴ—ＣａＭ Ｅ１４１Ｇ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ＧＳ一４Ｂ ｂｅａｄｓ．ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｒｅｍｏｖｅ ｔｈｅ ＧＳＴ，ｔｈｅ Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｍ ｅｔｈｏｄ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍ ｉｎｅ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｆ ｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｎｄ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｐｕｒｉｔｙ．Ｔｈｅ ＧＳＴ ｐｕｌｌ—ｄｏｗｎ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ’ｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｒ ｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ＣａＭ ｌＧ ｐｒｏｔｅｉｎ
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中 国医科大学学报 第４７卷 第２期 ２０１８年２月
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｉｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｖｏ１．４７ Ｎｏ．２ Ｆｅｂ．２０１ ８
·９７ ·
ＣａＭ突变体 质 粒 的构 建 、表 达 纯化 及 活 性鉴 定
· 论 著 ·
苏敬 阳 ，王 蓉蓉 ，袁媛 ，李松 霖 ，朱正 南 ，黄露 婷 ，封 瑞 ，邵 冬 雪 ，孙 雪菲 ，郝 丽英