蛋白质组学技术在药物肝毒性研究中的应用_王莹

新药申报与审评技术蛋白质组学技术在药物肝毒性研究中的应用王 莹1,2,王全军1,廖明阳1(1军事医学科学院毒物药物研究所,国家北京药物安全评价研究中心,北京100850;2辽宁医学院药物研究所,锦州121002)[摘要] 蛋白质组学技术的发展促进了许多学科的发展,毒理蛋白质组学(tox icoproteo m ics)整合了经典毒理学、病理学和蛋白质差异表达分析技术,使毒理学研究上升到了一个新的高度。

药物性肝损伤是肝脏疾病的一个重要原因,也是药物开发所面临的一项重大挑战。

现就蛋白质组学的主要技术,包括双向凝胶电泳 质谱(2 DE M S)、液相色谱 串联质谱(LC M S M S)、保留色谱 质谱(RC M S)和蛋白质阵列,以及其在药物肝毒性研究中的应用,包括毒性蛋白标志物的筛选、毒性机制研究、毒性预测与毒性蛋白质数据库的建立方面进行综述。

[关键词] 蛋白质组学;肝毒性;药物[中图分类号]R965.3 [文献标识码]A [文章编号]1003-3734(2008)04-0348-05Application of the technologies of proteo m ics i n drug i nduced hepatotoxicityWANG Y i n g1,2,WANG Q uan j u n1,LIAO M i n g yang1(1Institute o f P har m acology and Tox icolo gy,A cade my of M ilitary M edical Sciences, N ational B eijing C enter for D rug Safet y Evaluation and R esearch,B eijing100850,China;2Institute of M ateria M ed ica,L iaoning M edical Co llege,J inzhou121002,China)[Abstract] The i m proved techno log ies of proteo m ics have pro m oted t h e deve lopm ents i n m any fie l d s.Tox i copro teo m ics that i n tegrates classic tox ico logy,pathology and prote i n s express analysis techno l o gy has pro m oted tox ico l o gy to a ne w leve.l Drug i n duced i n j u ry is one of t h e m ai n eti o log ical factors o f liver diseases.H epato tox icity is a v ita l cha llenge duri n g dr ug deve l o pm en.t The m a i n technologies of proteo m ics i n clude t w o d i m ensenta l ge l elec trophoresis m ass spectr um(2 DE M S),li q u i d chro m atog raphy tande m m ass spectru m(LC M S M S),reten tate chro m atography m ass spectro m etr y(RC M S),prote i n arrays and so on.The app lication o f techno l o g i e s o f pro teo m ics i n tox ic ity inc l u de screen i n g tox icity bio m ar kers,exp l o r i n g m echan is m o f tox ic effec,t predicting tox ic ity and establishing prote i n databases related to tox ic effects.I n the present article,w e rev ie w ed both the m a i n tec h nolog i e s o f proteo m ics and the app licati o n i n drug hepa totox ic ity research.[Key w ords] pr o teo m ics;hepatox ic ity;drug随着人类基因组计划的完成,生命科学研究已进入了后基因组时代,研究重心也从揭示生命的全套遗传信息转移到对基因的生物学功能的系统研究,蛋白质组学(pr o teo m ics)随之产生并成为后基因组时代的研究热点。

蛋白质组(proteo m e)是指某种组织、某个器官或细胞在特定时刻所表达的全部蛋白质[1]。

蛋白质组学是研究生物系统内特定时间或条件下蛋白质表达规律的科学,主要包括: 蛋白质组表达模式研究,主要研究不同状态下蛋白质组的组成、含量及其变化规律。

蛋白质组功能模式研究,主要研究蛋白质组各成员间的相互作用,了解蛋白质结构与功能的相互关系[1]。

蛋白质组学研究已应用到许多领域,可为揭示生命活动规律、探讨重大疾病机制、疾病诊断和防治、环境与健康的关系、新药开发等提供重要的理论基础。

新药开发是蛋白质组学的重要应用领域之一,包括利用蛋白质组学技术确认药物作用新靶点;鉴定和优化先导化合物;有效性和毒性研究等。

毒性348是新药开发中淘汰率高的主要原因,也一直是制药业面临的重大挑战。

目前常规的安全性评价方法已不能满足需要,毒理基因组学(tox icogeno m i c s)、毒理蛋白质组学(tox icopro teo m ics)、代谢组学(m etabo no m ics)等一系列新的手段已用于毒理学研究[2]。

毒理蛋白质组学作为毒理基因组学延伸的研究领域,是利用全蛋白质表达分析技术来确认生物体系中受有害化学物和环境因素影响的关键蛋白质和信号通路[3]。

肝脏是生物转化和解毒的主要场所,也是毒性损伤的易感靶器官之一,肝脏毒理学是靶器官毒理学的一个重要研究领域。

据报道,药物性肝损害占药物不良反应的10%~15%[4],严重者可致肝衰竭,需肝移植,甚至死亡。

药物性肝损伤已成为医生、卫生机构及制药业持久性挑战性的研究课题。

现就蛋白质组学的主要技术,包括双向凝胶电泳 质谱(2 DE M S)、液相色谱 串联质谱(LC M S M S)、保留色谱 质谱(retentate chro m atography m ass spec tro m etry,RC M S)和蛋白质阵列(prote i n arrays)以及其在药物致肝毒性的生物标志物的筛选、毒性机制研究及毒性预测方面的应用进行综述。

1 蛋白质组学的主要技术二维电泳/色谱分离技术、生物质谱鉴定技术、生物信息学是蛋白质组学的三大基本技术,目前主要形成以下几个技术平台。

1.1 2 DE M S 2 DE M S是目前蛋白质组学研究最常用的技术平台。

该平台首先通过双向聚丙烯酰胺凝胶电泳按等电点和相对分子质量不同对蛋白质进行分离;建立2 DE电泳图谱,利用软件进行图像分析;再将感兴趣的蛋白点从胶上切下来,酶消化后得到肽片段混合物,进行质谱鉴定;最后进行生物信息学分析。

2 DE分辨率高,是目前惟一能将数千种蛋白同时分离展示的技术,但也存在一些缺陷,如对低丰度蛋白、疏水性蛋白、极酸和极碱性蛋白、极大和极小蛋白分离性差;不同样本间不易进行定量比较;费时、费力,不容易自动化和重复性差等。

新出现的分步顺序抽提、亚细胞结构预分离及去除高丰度蛋白等样品制备方法、窄pH范围胶条的使用、胶内差示电泳(DI GE)技术等改善了上述不足。

D I G E是将不同样品用不同的荧光染料进行标记后在同一块胶上进行电泳分离,在相同的电泳条件下可以在一块胶上分离2或3个样品,一种改良的加内标的DI GE 技术能更好地进行定量分析。

随着技术的不断完善,2 DE目前仍是大多数蛋白质组学研究中分离复杂蛋白质混合物的首选技术。

生物质谱鉴定是蛋白质组学的关键技术之一。

质谱技术的基本原理是带电粒子在磁场或电场中运动的轨迹和速度依粒子的质量与携带电荷比(m/z)不同而变化,并以此来判断粒子的质量和特性。

质谱仪包括离子化源、质量分析器、离子检测器3大组件。

目前生物质谱仪的主要离子化方式是基质辅助激光解吸离子化(MALDI)和电喷雾离子化(ESI),质量分析器主要有离子阱、飞行时间(TOF)、四级杆和傅立叶变换 离子回旋共振加速器(FT I CR)。

按离子化和检测方式不同,质谱主要有MALD I TOF M S,ESI M S/M S,TOF TOF和FT I CR M S。

1.2 LC M S M S 作为2DE M S平台的重要补充, LC M S M S成为蛋白质组学技术的新亮点,在其基础上发展了2大技术,即多维蛋白质鉴定技术(M uDPI T)和同位素亲和标签(I CAT)技术。

M uD PI T是将蛋白质酶解后得到多肽混合物进样到强阳离子交换色谱柱,直接洗脱后进样到反相液相色谱柱,再进行梯度洗脱,用串联质谱对分离的馏分进行鉴定。

该技术适用于大规模的蛋白质分离鉴定,而且可以分离鉴定2 DE M S难以检测的低丰度蛋白(如转录因子、蛋白激酶、膜整合蛋白等)[5],其不足是不能进行蛋白定量。

I C AT技术不仅适于分析低丰度蛋白,还可进行蛋白定量分析[6]。

其原理是用化学性质相同而质量不同的2种同位素分子对蛋白样品的半胱氨酸进行标记,然后对混合样品进行质谱分析,2个样品的同一类蛋白会形成易于辨识比较的2个峰,通过比较质谱峰的强弱对蛋白进行定量比较。

1.3 RC M S RC M S的原理是色谱固定相(疏水相、正相、弱阳离子交换、强阴离子交换或固相金属亲和性载体等)根据蛋白的性质不同对样品进行选择性蛋白吸附,而杂质和未吸附的蛋白随流动相洗脱掉,仅对吸附的蛋白进行质谱鉴定。

表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(SELD I TOF MS)就是在此基础上产生的,该技术将蛋白芯片和质谱技术整合在一起,样品用量小,分析速度快,还可定性定量相结合分析靶蛋白,目前主要用于血清/血浆中生物标志物的鉴定[7]。

1.4 蛋白质阵列 将不同种类的探针蛋白点布于芯片表面可制备不同类型的蛋白微阵列,蛋白质阵列技术根据探针蛋白与待测蛋白的特异性结合对蛋白质进行分析鉴定,其特点是高度并行性、高通量、349微型化和自动化。