脉冲场凝胶电泳.
pfge脉冲场凝胶电泳具体操作
pfge脉冲场凝胶电泳具体操作PFGE（Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一种高分辨率的凝胶电泳技术，可用于分离和检测大分子量DNA片段。
该技术常用于研究基因组结构、遗传变异和DNA断裂等领域。
下面将详细介绍PFGE的具体操作步骤。
1. 准备DNA样品:a. 从细胞中提取DNA。
可以使用标准的DNA提取方法，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
b. 用酶切酶或限制酶对DNA进行切割。
选择使DNA在所需大小范围内切割的酶，以便获得所需的DNA片段。
2. 制备凝胶:a. 准备1% - 2% 的琼脂糖溶胶。
将所需琼脂糖加入TE缓冲液中，并在适当的温度下加热搅拌，直到完全溶解。
b. 将琼脂糖溶胶倒入制作凝胶的模具中。
在模具顶部放置梳子以制作凝胶槽，并确保梳子的位置水平。
c. 让凝胶固化。
根据琼脂糖溶胶中指定的温度和时间，将模具放入冰箱或培养箱中，使凝胶完全固化。
3. 负载和电泳样品:a. 准备DNA样品。
将所需比例的DNA标记物和DNA样品混合，并加入适量的加载缓冲液，如Bromophenol Blue。
b. 用吸管吸取混合物，并将其轻轻注入凝胶槽中的样品孔中。
确保尽量避免气泡进入凝胶槽。
c. 启动电泳。
电泳前，确保样品中有足够的时间固定在凝胶上。
启动电源，并将电流设置为所需的值。
4. 设置电泳条件:a. 选择适当的电泳缓冲液。
常用的电泳缓冲液包括TBE缓冲液（三硼酸钠缓冲液）和TAE缓冲液（乙醋酸/三乙酸片性缓冲液）。
b. 设置电泳条件，如电流密度，脉冲时间和频率等。
这些条件可以根据所研究的DNA分子量和所使用的电泳设备进行调整。
5. 进行电泳:a. 启动电泳设备，确保电泳条件设置正确，并在所需时间内运行电泳。
b. 当电泳结束时，关闭电源，并小心地取出凝胶，以免损坏样品。
6. 可选的染色和可视化:a. 将凝胶放入染色缓冲液中，如溴化乙锭溶液，使DNA可被视觉化。
b. 在染色缓冲液中搅拌凝胶，确保各个区域充分染色。
BIO-RAD脉冲场电泳介绍
﹡这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生 物基因组结构的研究。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
PFGE的原理
PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场,其方向 、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改变时,大分子DNA 便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重新定向后,才能继续向前泳 动,DNA分子越大,这种重新定向需要的时间就越长,当DNA分子改 变方向的时间小于脉冲时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开, 经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。
一、PFGE在分子分型方面的应用 通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致、比较它们的亲缘
关系,对于细菌性传染病的监测、传染源追踪、传播途径的调查 和识别有着非常重要的意义。
传统的微生物分型技术主要是基于表型特性分类,如生化分 型(biotyping)、血清学分型(serotyping)、耐药谱测定(antmi icrobial susceptibility testing)、噬菌体分型(bacterialphage typing) 等。由于微生物易受环境的影响,很容易改变其表达性状,使得表 型分类很不准确。
CHEF-DR III
脉冲场电泳系统的配件
脉冲场电泳（PFGE）的实验流程
Cultured Cells
Unicellular Organisms
Harvest Cells
Tissues
Dissociate
Wash Cell Suspension
Determine Cell Concentration Resuspend to needed Concentration
质粒DNA的提取纯化与电泳检测
法、羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放
法、酸酚法等。
1 .碱裂解法提取质粒DNA
1.1原理
共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓
扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线
性的DNA双螺旋结构解开而被变性，共价闭合
接种含pUC-mT质粒的大肠杆菌到1.5ml含有60μg/ml Amp抗生素
的LB 液体培养基
37℃摇培过夜（10~12h）12000rpm,
3min
弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。
加100μl Ⅰ液，涡旋震荡，充分混匀
配制适量的Ⅱ液
加200μl Ⅱ液，迅速轻轻混匀（以颠倒EP管5-10次为宜），
电泳介质相同（电泳液和凝胶）：
• 分子在电场中迁移的速度主要取决于
分子本身的大小和形状。
• 形状相似的分子的迁移速度主要与分
子量相关: 分子量越大，移动越慢。
凝胶板
（二）琼脂糖凝胶电泳介绍
琼脂糖:
是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物
琼脂中提取而来。
琼脂糖凝胶:
琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点
电泳缓冲液的组成。
5.溴化乙锭染料
Biblioteka EB:溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐
Ethidium Bromide，EB），EB能插入DNA分子碱基
对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫
外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的
射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。
离子交换层析法
脉冲场凝胶电泳(PFGE)
脉冲场凝胶电泳
报告人：吉尚雷 2013-03-13
一、原理
常规的电泳采用的是单一的均匀电 场，DNA分子经凝胶的分子筛作用由负 极移向正极。而脉冲场凝胶电泳(Pulse dfield gel electrophoresis，PFGE) 采用 了两个交变电场，即两个电场交替地 开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随 着电场的变化而改变。电场方向的交 替改变使大分子DNA得以分离。
普通凝胶电 泳
PFGE
二、PFGE在分子生物学中的应用
在普通的凝胶电泳中，大于10kb的 DNA分子移动速度接近，很难分离形成足 以区分的条带。脉冲场凝胶电泳可以用来 分离大小从10kb到10Mb的DNA分子 。主 要用于基因组DNDR-II脉冲场电取出凝胶，放在电泳槽中 适当位置。调节脉冲场电泳参数，4V/cm、 脉冲时间1-40s, 14℃ 电泳18h，泵 70。
将电泳完的凝胶用EB染色20min， 清水漂洗20min，置凝胶成像系统 中检测
四、影响PFGE的因素
1.琼脂糖凝胶浓度
低熔点琼脂糖是经过羟乙基化修饰的琼 脂糖，30℃左右成胶，熔点是65℃。熔化 温度低于大多数双链DNA熔点。这种性质可 以从凝胶中回收天然形式的DNA
1 PFGE是公认的比较繁琐耗时的技术。一次电泳至少需 要两天时间。 2 电泳带型易受人为等多种因素的影响，需要较高的技 术水平。 3 不能同时优化胶的每个部分的条带分布。 4 不能确切地认为相同大小的条带就是相同的DNA片段。 5 一个酶切位点的变化可能引起不止一个条带的变化。 6 PFGE分型技术在大肠杆菌O157：H7等细菌的分子生 物学分析中得到了广泛的应用。但有些菌种用PFGE是 不可分的。研究人员发现对于有广泛基因重组现象的 细菌，PFGE并不是一个适宜的分子分型工具。
脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌感染性疾病中的应用分析
脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌感染性疾病中的应用分析在细菌的相关研究中，比如其流行特征、追踪传染源等，有多种方式可以实现。
其中应用比较广泛的方法是将菌株分型，以此来得到同源性关系。
具体来说，脉冲场凝胶电泳技术是实现基因分型的一种最为常用的方法，该方法得到的结果的重复性和分辨率都是非常好的，很多相关的研究人员都会采用该种方式来研究细菌感染性疾病的相关知识。
本文对脉冲场凝胶电泳技术的应用进行相关分析和探究，具体内容如下。
1 原理脉冲场凝胶电泳技术也称为PFGE技术，该技术是在1984年被美国科学家提出的。
PFGE技术主要是通过限制性核算内切酶可以将DNA实现消化，最终可以产生多个有限的，并且各段长度都不一样的DNA片段，一般来说，片段数量通常在5到20之间。
之后便可以采用常用的电泳方式实现分离。
根据跟李的电泳条带图谱，可以正确地判断细菌的种类。
基于以上原理，PFGE技术可以很好地反应细菌所有基因组的情况，包括一些细微的地位，这将对细菌的相关研究具有非常有利的影响。
2 结果判断如果在图片条带上的大小以及出现的数量都是相同的，则可以认为其型别是相同的。
如果在所有的图片条带中，有两个或者三个是有所差别的，则可以认为其亲缘关系是较为密切的。
如果在所有的图片条带中，有四到六个是有所大的，则可以认为它们之间有可能会存在亲缘关系。
而如果在所有的图片条带中出现了大于等于七个有所差异的条带，则认为两者之间不存在任何的亲缘关系。
考虑到细菌间的变异特性，将85%作为判断相关的标准。
3 主要影响因素第一，是缓冲液温度。
缓冲液的温度会产生一定的影响。
这是因为缓冲液的温度越高，那么电泳对应的速度是越快的，这就使得整个的时间变得更短，这会导致条带的分辨率变得较低，不能很好得进行识别。
在缓冲液温度较低的情况下，对应的电泳所需要的时间就会变得越长，会让条带更好地进行分辨，通常将温度维持在14度左右，第二，是脉冲的角度。
脉冲的角度也会对结果产生一定的影响。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一
种常用于分析测定大分子量DNA分子种类、外源DNA同源度、DNA长度等
实验的灵敏度相当高的一种电泳技术。
该技术是利用 DNA 分子在脉冲场
条件下的电泳运动，将不同类型的 DNA 集合体根据其分子质量分离而得
到细菌的 DNA 指纹图谱，从而用于基因检测、基因定位、系统发育研究、菌种识别、菌群分析、植物起源及食品安全检测等领域。
其实验原理是在
原电泳的基础上，增加了两个梯度磁场，形成脉冲场条件下，DNA 分子会
从均匀电荷有序分布转变为非均匀电荷分布，在脉冲场条件下，它会产生
不均匀向偏冲，从而实现对 DNA 集合体的分离，再加上同时对 DNA 分子
进行大量的微量操纵，有效的分离了DNA分子，使它们能够产生端粒酶消
化片段，最终可以经过比较求得大分子量DNA分子种类，外源DNA同源度、DNA长度等实验结果。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis ，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA 序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。
电泳结果通常是条带图谱。
该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。
通过分型可以鉴定比较菌株是否一致， 对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。
一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE 与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA 分子经凝胶的分子筛作用由负极移向正极。
而PFGE 采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA 分子的电泳方向随着电场的变化而改变。
正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA 得以分离。
图l 是根据Carle 和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1field gel electrophoresis ，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。
A 、B 代表两个交替开启和关闭的电场。
当A 电场开启时，B 电场关闭，DNA 分子从A 电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B 电场开启时，DNA 分子改变原来的运行方向，随B 电场由负极向正极移动。
这样，随着电场方向的交替变化DNA 分子 即呈“Z” 字形向前移动。
目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA 分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。
如果电场方向改变 DNA 分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。
这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA 分子必须相应地变化移动方向。
可以想象， 较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulse Field Gel Electrophoresis, PFGE），是一种通过交替改
变电场方向和大小等参数，使得大分子DNA在凝胶中得到更好的分离的电泳技术。
该技术
主要依靠电场对DNA分子的移动与定向拉伸，通过一系列的脉冲场控制形成脉冲态运动，
使DNA分子得到更广泛的电泳分离。
在经过凝胶电泳之后，得到的分离图谱呈现出一组带状分布的DNA分子，每条带都代
表着分子的大小。
DNA分子越大，迁移的速率就越慢，因此大的分子在凝胶上迁移的距离
要比小的分子短。
这个技术被广泛应用于基因编辑、基因检测和病原体的快速分型等领域。
实验中，将DNA分子高压加在凝胶中，通过影响电场的大小和方向，脉冲场凝胶电泳
可以将DNA分子拉伸成一系列不同长度的线条。
接下来应该是经过染色或者转移等方法，
对凝胶进行图像处理，得到DNA分子的带状图谱。
带状图谱中，每一条带代表一个不同的DNA分子长度，因此可以确定DNA的大小。
根据带的数量、大小和密度等参数，可以进一
步区分样品中不同的DNA分子。
需要注意的是，PFGE并不能很好地分离具有相同长度的DNA分子，因为它们将聚集成一个带状图。
但总的来说，PFGE是一种用于高分辨率DNA分离的强大工具，已被广泛用于研究多种生物学和医学问题，例如：身份鉴定、结构基因组学、基因突变分析等。
脉冲场凝胶电泳技术
5、 把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。 如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在 第1、5、10个齿上。 6、 用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在 室温下风干约3分钟。 7、 把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上， 并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的下部中央 缓慢到入100ml熔化的在55℃－60℃平衡的1％ SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在 室温下凝固30分钟左右。 8、 记录加样顺序。
多余的部分。
5、 保证胶块在液面下而不在管壁上。
6、 将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速
约170转/分钟。
7、 将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。
三、洗胶块 1、 从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的 screened-cap。轻轻倒掉CLB。在实验台上轻磕管 底使胶块落在管底。 2、 每管中加入15ml预热的纯水。 3、 确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回 50℃水浴摇床中，摇10分钟。 4、 倒掉水，用纯水再洗一次。 5、 倒掉水，加入15ml预热的TE，在50℃的水浴 摇床中摇15分钟。 6、 倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10－15分钟。 7、 倒掉TE，加入10ml TE，放在4℃冰箱保存备 用。
四、胶块内DNA的酶切 1、 在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及 H9812的名称。 2、 按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。 试剂 µl/胶块 µl /10胶块 纯水 180µl 1800µl Buffer D 20µl 200µl 总体积 200µl 2000µl 注意：缓冲液要置于冰上。
调整至3.6~4.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA一般长度超过20kb，在某些情况下，超过40kb在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10〜2000kb之间的DNA片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显着地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE 设备能把大小范围在10〜2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris ，pH7.5；0.15mol/LNaCl ；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris ，pH7.5；lmol/L NaCl ；0.5%4ESP缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，Img/mL蛋白酶K。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
7 胶模( 由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。
90.5匕g/mL溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。
脉冲场凝胶电泳试验流程
脉冲场凝胶电泳实验流程一、准备样品1. 琼脂糖包埋的样品常用的DNA提取方法不能得到完整的大分子量DNA。
大分子量DNA很脆弱，在制备过程中容易因移液等操作造成机械剪切。
将完整细胞包埋入琼脂糖后再进行裂解，去除蛋白的操作，可防止大分子量DNA的断裂。
琼脂糖块包埋的DNA可以避免被机械剪切，并且是一种简单的操作方法。
处理过的包埋有DNA的琼脂糖块可以直接放入琼脂糖凝胶的点样孔。
在将细胞包埋入琼脂糖之前要先确定细胞浓度，尽管吸光度很常用，但是并不可靠。
单位吸光度对应的细胞浓度会因菌株不同或培养基不同而有差异。
这会影响琼脂糖块中DNA的含量，导致上样量过大或不足。
不论细菌、真菌还是哺乳动物细胞，使用血球计数板均可得到准确和高重复性的细胞浓度。
Bio-Rad提供一次性的样品模具（货号：170-3713）。
每个模具可制备50个10 x 5 x 1.5 mm的琼脂糖胶块。
样品制备过程中的酶可以快速有效的扩散进入胶块，用Bio-Rad标准梳子制胶，胶块不需要修剪就可直接放入点样孔。
2. 液体样品小于200kb的DNA片断可以不用琼脂糖包埋，可直接以液体形式加入点样孔。
当操作的DNA大于50kb时，必须用大开口的吸头。
如果只电泳液体样品，使用厚度0.75 mm的梳子可以获得更锐利的条带和更高的分辨率。
3. 制备琼脂糖包埋的哺乳动物DNA该方法中用到的缓冲液，酶和琼脂糖均包含于试剂盒CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit （货号：170-3591）。
1)将细胞悬浮于等渗盐溶液或不含血清的培养基中并置于冰上。
用血球计数板对细胞计数，每毫升琼脂糖块需要5 x 107个细胞，每个10 x 5 x 1.5 mm的样品块需要0.1 mL琼脂糖。
2)准备2% CleanCut™琼脂糖（货号：170-3594），用微波炉融化并置于50 °C水浴。
3)1000g、4 °C离心细胞悬液5分钟，用琼脂糖块一半体积的细胞悬浮缓冲液（10 mM Tris, pH 7.2,20 mM NaCl, 50 mM EDTA）重悬细胞并置于50 °C水浴。
PFGE原理及注意事项[指南]
![PFGE原理及注意事项[指南]](https://img.taocdn.com/s3/m/4457755dce84b9d528ea81c758f5f61fb7362837.png)
脉冲场凝胶电泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis ,PFGE)是通过脉冲电场方向、时间与电流大小交替改变完成分离大分子DNA。
00PFGE注意事项：：00蠕动泵的流速：电泳过程中，控制好蠕动泵的流速，一般控制在50-70左右，以免速度太快，使胶在溶液中移动。
00冷却泵的开启：冷却泵开启时，一定要把蠕动泵打开，以避免冷却泵管道内的溶液因为过度制冷，凝结成冰块而堵塞管道。
00电泳结束后，应及时取出凝胶，进行染色等操作，以避免因为时间太长，而造成条带的弥散。
00脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理00脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理大致为:细菌包埋于琼脂块中,用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切,酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。
PFGE中内切酶的选用至关重要,所采用的内切酶常为寡切点酶(low frequency cleavage restriction endonucleases),这种酶切后的片段少而大,适合于作PFGE电泳。
McClelland等[8]通过对细菌的PFGE 电泳图谱的内切酶的选择研究发现,四核苷酸CTAG在许多GC含量>45%的细菌染色体中是很少见的,在他们所试验的16个细菌的染色体中,被1个或多个可识别CTAG位点的内切酶酶切,每100000ｂｐｓ中不到一次,这些酶的识别序列分别为:XbaI(TCTAGA), SepI(ACTAGT),AvrII(CCTAGG)和NheI(GCTAGC)。
同样地,在许多含Ｇ+Ｃ<45%的基因组,CCG和CGG更少。
这样用SmaI(CCCGGG)、RsrII(CGGWCCG)、NaeI(GCCGGC)和SacII(CCGCGG)进行酶切,对产生平均超过100000bps片段是非常合适的。
对PFGE结果的观察,可因不同研究者而出现较大差异,据此,Tenover 等[6]经过多年的研究提出了PFGE的解释标准:(1)相同(indistinguishable):酶切图谱间有同样的条带数,且相应条带大小相同,流行病学上则认为相同,这种经PFGE证实的结果,用其它方法检测不可能显示实质性的差异。
脉冲电场凝胶电泳
脉冲电场凝胶电泳引言脉冲电场凝胶电泳是一种常用的生物分子分离和分析技术。
它利用凝胶的孔隙结构和电场的作用，在不同大小和电荷的生物分子之间实现分离。
本文将全面、详细、完整地探讨脉冲电场凝胶电泳的原理、应用、优缺点等方面内容。
原理1. 凝胶基质凝胶基质在脉冲电场凝胶电泳中起到了重要的作用。
凝胶可以是聚丙烯酰胺（polyacrylamide）或琼脂糖（agarose）等材料制成的。
凝胶的孔隙结构可以根据精确的浓度和固化条件来调控，从而实现对不同大小分子的分离。
2. 电场作用脉冲电场是脉冲电场凝胶电泳的核心。
通过在凝胶两端施加电场，带电生物分子将受到电场力的作用而在凝胶中运动。
根据生物分子的电荷大小和大小等因素，不同分子会以不同速度迁移，从而实现分离。
3. 可视化方法分离完成后，需要对生物分子进行可视化。
一种常用的方法是使用DNA或蛋白质染料来染色，如乙溴化乙锭（ethidium bromide）等。
通过紫外光照射，染色的生物分子将呈现出特定的荧光或色带，便于观察和记录。
应用脉冲电场凝胶电泳在生物科学研究中有着广泛的应用。
1. DNA分析脉冲电场凝胶电泳可以用于DNA分析，如DNA片段的大小分离、DNA测序等。
通过将PCR扩增产物或限制性内切酶切割的DNA样品经过脉冲电场凝胶电泳的分离，可以得到DNA的大小分布图谱，进而对DNA进行分析和研究。
2. 蛋白质分析脉冲电场凝胶电泳也可以用于蛋白质的分离和分析。
蛋白质样品经过电泳分离后，可以通过染色和荧光成像等方法观察和记录蛋白质带的位置和分布。
进一步可以进行蛋白质质量测定、蛋白质结构和功能的研究等。
3. 检测突变脉冲电场凝胶电泳在检测突变上也有着重要的应用。
通过将突变位点的DNA样品与野生型的DNA样品分离，可以方便地鉴定突变位点和分析突变的类型和数量。
优缺点1. 优点•分辨率高：脉冲电场凝胶电泳可以实现生物分子的高分辨率分离，对于大小相近的分子也有很好的分辨能力。
脉冲电场凝胶电泳
脉冲电场凝胶电泳1. 介绍脉冲电场凝胶电泳（Pulsed-field Gel Electrophoresis，简称PFGE）是一种用于分离、检测和鉴定大分子DNA的技术。
它通过在凝胶中施加脉冲电场，利用DNA 分子在电场作用下的迁移速度差异来实现DNA分离。
2. 原理PFGE的原理基于DNA分子在脉冲电场中的迁移速度与其大小有关。
在传统的水平凝胶电泳中，小分子DNA会快速迁移，而大分子DNA由于受到凝胶孔隙限制而迁移较慢。
然而，在一定的时间尺度内，大分子DNA可能无法完全穿过凝胶网络，导致其无法被有效分离。
为了解决这个问题，PFGE引入了脉冲电场。
它通过交替改变电场方向和强度来创造一个“混合模式”，使得大分子DNA能够在不同方向上进行迁移，并最终穿过凝胶网络。
这种方式可以有效地增加大分子DNA的迁移距离，从而实现对大片段DNA 的高效分离。
3. 实验步骤3.1 制备凝胶需要制备PFGE所需的琼脂糖凝胶。
通常使用琼脂糖浓度较高的凝胶（通常为1-2%），以增加凝胶网络的致密程度。
3.2 DNA提取从待检测样品中提取待测DNA。
可以使用常规的DNA提取方法，例如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
3.3 准备DNA样品将提取得到的DNA进行适当的处理和纯化，以去除杂质和降解产物。
可以通过酶处理、有机溶剂萃取或商用纯化试剂盒等方法进行。
3.4 打孔和载入DNA将处理后的DNA溶液加入到琼脂糖凝胶孔中。
为了确保DNA在电泳过程中不会由于重力而下沉，可以在凝胶上方放置一层透明塑料薄膜，并用夹子固定。
3.5 脉冲电场电泳将装有DNA样品的琼脂糖凝胶放置在电泳槽中，并加入适当的缓冲液。
将电泳槽连接到电源上，并设置合适的电场参数，如电压、脉冲时间和脉冲方向等。
3.6 可视化和分析电泳结束后，可以使用DNA染料（如乙溴黄）对凝胶进行染色，并使用紫外线照射仪观察DNA分离结果。
通过比较不同样品的DNA迁移距离和带状图案，可以分析样品中的DNA差异。
脉冲场电泳
脉冲场凝胶电泳- 高分子量DNA琼脂糖凝胶块制备和加工1．收集10ml全血，加入30ml细胞裂解液。
置冰浴中至少20min直至红细胞完全溶解。
2．2000r/min离心10min，移去红色上清液，再次用细胞裂解液洗涤细胞，然后用PBS重悬细胞。
3．稀释单细胞悬液并取一小份用Neubauer腔计数细胞。
4．用PBS重悬细胞，以达到40μl PBS中含1百万个细胞比例（1百万个二倍体哺乳动物大约含有基因组DNA 10μg）5．用PBS配制2％浓度低熔点琼脂糖溶液并保持在50℃。
6．将等体积（各1ml）细胞悬液与琼脂糖溶液于室温下混匀，立即倒入凝胶块模具中。
7．静置20min让琼脂糖固化，用无菌塑料杯（通常用作划菌）将凝胶块自模具中取出并置入蛋白酶缓冲液中，加入2mg/ml的蛋白酶K。
8．将带有凝胶块的蛋白酶K缓冲液于50℃保持2～3天。
每个盛有50ml蛋白酶缓冲液的Falcon管可容纳多达100个凝胶块。
9．蛋白酶K消化后，可将凝胶块保留在此缓冲液或0.5mol/L EDTA溶液中保存于4℃。
10．此外，继续将凝胶块用高压消毒过的TE缓冲液冲洗数遍的步骤。
11．将凝胶块放入装有TE及0.04mg/ml PMSF溶液的Falcon试管中，灭活残留的蛋白酶K。
12.室温下用TE溶液漂洗凝胶块数次,将凝胶块放入另一干净的试管，可直接用于酶切反应或用0.5mol/L EDTA，（pH8.0）4℃保存凝胶块。
13．若用EDTA保存凝胶块，取出后应用TE溶液室温下漂洗30 min×2次。
脉冲场凝胶电泳- 大小标准物的制备λ多联体1．以TE缓冲液悬浮λ多联体（Boehringer MA宝灵曼公司产品），浓度为4μg/40μl。
2．用等体积TE配制的2％低熔点琼脂糖（温度保持在45℃）混匀。
3．移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。
4．室温下用TE及100 mmol/L NaCl溶液温育2天。
酵母染色体1．从YPD（酵母提取物，蛋白胨和葡萄糖）培养基瓶皿中挑选单一克隆加入10ml YPD预培养的肉汤中，30℃下剧烈震荡生长24小时，然后加入200ml YPD肉汤，剧烈振荡24～48h（产量大约100块）。
脉冲场凝胶电泳原理
脉冲场凝胶电泳原理嘿，咱聊聊脉冲场凝胶电泳这神奇的玩意儿！这脉冲场凝胶电泳啊，那可真是个厉害的角色。
就好像一位超级侦探，能在微观世界里找出各种秘密。
它是咋工作的呢？简单来说，就是让DNA 分子在特殊的电场中“奔跑”。
这可不是普通的跑哦，是一种有策略的“长跑”。
普通的电泳呢，就像让一群人在直道上跑，跑得快的很快就冲出去老远，跑得慢的就落在后面，最后全乱了套。
可脉冲场凝胶电泳不一样，它就像是给这些DNA 分子设置了一个迷宫赛道。
一会儿这边通电，一会儿那边通电，让DNA 分子不得不拐着弯地跑。
这样一来，不同大小的DNA 分子就会根据自己的“步伐”和“耐力”，逐渐分开。
你想想，那些巨大的DNA 分子，平时就像一群懒洋洋的大象，很难被分开。
但脉冲场凝胶电泳有办法，它不断地变换电场方向，就像在赶着大象走不同的路。
小一点的DNA 分子呢，就像灵活的小兔子，跑得比较快，但也得跟着电场的变化调整自己的路线。
在这个过程中，可不能小瞧了那些电场。
它们就像是一双双无形的大手，推着DNA 分子往前走。
有时候强，有时候弱，让DNA 分子一会儿加速，一会儿减速。
这就好比我们玩的跷跷板，一会儿这边高，一会儿那边高，保持着一种动态的平衡。
而且啊，脉冲场凝胶电泳的精度那是相当高。
它能把那些看起来差不多的DNA 分子分得清清楚楚。
这就像一个超级细心的画家，能把每一根线条都画得恰到好处。
比如说在研究细菌的基因组的时候，脉冲场凝胶电泳就能发挥大作用。
细菌的基因组虽然小，但也有各种各样的结构。
通过脉冲场凝胶电泳，我们可以清楚地看到不同细菌的基因组有哪些不同，就像分辨不同人的脸一样容易。
还有啊，在医学研究中，脉冲场凝胶电泳也功不可没。
它可以帮助医生们找出一些疾病的病因。
比如说某些遗传病，可能就是因为DNA 分子出现了问题。
通过脉冲场凝胶电泳，医生们就能像侦探一样，找到那些有问题的DNA 片段，从而更好地治疗疾病。
再想想，如果没有脉冲场凝胶电泳，我们对很多生命现象的理解可能还停留在表面。
微生物分子验证方法
微生物分子驗證方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：微生物分子验证方法是指利用分子生物学技术对微生物进行鉴定和检测的方法。
随着科学技术的不断发展，分子验证方法已经成为微生物学研究和实践中不可或缺的一部分。
它不仅可以更加准确地鉴定微生物的种类和品质，还可以快速、高效地进行检测和分析。
本文将介绍一些常用的微生物分子验证方法，以及它们在不同领域的应用。
一、PCR技术PCR（聚合酶链反应）技术是一种常用的微生物分子验证方法。
通过PCR技术可以在微生物体内特异性地扩增某一段特定的DNA序列，从而对微生物的种类进行鉴定。
PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的优点，可以检测极微量的微生物。
PCR技术还可以在短时间内完成大批样本的检测，适用于高通量的微生物鉴定和检测。
二、基因测序技术基因测序技术是一种通过测定微生物DNA序列来鉴定微生物的方法。
基因测序技术可以获得微生物的全基因组序列信息，从而对微生物的种类和基因组结构进行深入分析。
通过基因测序技术可以快速、准确地鉴定微生物的种类，并了解微生物的遗传变异和进化过程。
基因测序技术在微生物学研究、环境监测、食品安全等领域具有广泛的应用价值。
三、质谱技术质谱技术是一种通过分析微生物体内的代谢产物来鉴定微生物的方法。
质谱技术可以通过测定微生物代谢产物的分子质量和碎片谱图等信息，快速、准确地鉴定微生物的种类和代谢途径。
质谱技术具有高分辨率、高灵敏度和高准确性的优点，可以对微生物的多种代谢产物进行全面、快速地检测和分析。
质谱技术在微生物学领域的研究和应用方面具有重要意义。
四、荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术是一种通过检测微生物的核酸序列来鉴定微生物的方法。
荧光原位杂交技术可以利用荧光标记的核酸探针与微生物DNA或RNA特异结合，从而在显微镜下观察到目标微生物的位置和数量。
荧光原位杂交技术具有高特异性、高敏感性和高分辨率的优点，可以对微生物的种类和数量进行快速、直观地检测和分析。
脉冲场电泳仪操作规程
脉冲场电泳仪操作规程1 .在电泳槽内加入约2.2升合适的电泳缓冲液。
2 .打开主机开关，待主机自检结束后，打开循环泵开关，使电泳缓冲液开始循环，泵的速度设在“70”左右。
然后开启冷凝系统开关，按“settemp”键设置所需电泳温度，按“actua 1temp”显示实际温度。
3 .灌胶，等胶凝固后，上样4 .待电泳缓冲液到达设置的温度后，将加好样的凝胶连同底座一起放入电泳槽内的黑色方框内，并保证电泳缓冲液超过胶面b2≡ι,盖好电泳槽盖5 .在主机上设置电泳程序，先选择采用哪种类型程序，例如最常用的TWoState 方法：FIGETWOSTATEMU1TISTATE(1)按TWOSTATE 键，屏幕显示a Youwi11destroythe1astprogram-Goon?"，输入"1”确认后，系统显示AUrO A1GORITHM ⅛/一、Gradient≡[]V∕cmRunTime≡[]Inc1udedAng1e=[ ]0输入相应的参数后，按ENTER键,屏幕显示输入相应的参数后，按ENTER键确认(其中RamPingfactor默认是线性增长，如果欲采用默认值直接回车即可)。
CHEFMapper屏幕会显示AProgramisinmemory.P1easeenteranothercommand.若需存储程序，按SToREPGM 进行存储。
按STARTRUN即开始运行，此时可观察到电泳槽内电极开始出现气泡。
(2)如选用autoa1gorithm方法，按“autoa1gorithm,,键,键入欲得到的线性范围的最大片段和最小片段的kb数，确认所有给出参数，按“startrun”键，即可进行电泳。
(3)如选用MUItiState及FIGE方法,请参阅说明书。
6.电泳开始后，“highVo1tage”灯亮，此时切不可打开电泳槽盖进行操作，以免发生触电危险。
7.电泳结束后，"highVoItage”灯灭。
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脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。
8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。
90.5μg/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。
210mg/mL tRNA。
35mol/L NaCl。
4 苯酚/氯仿。
53mol/L NaAc，pH5.2。
695%乙醇。
3. 设备1TBE 缓冲液。
2Seakem HGT 琼脂糖。
3Wide Mini-Sub Cell 凝胶电泳设备。
4 变速泵或蠕动泵 (Bio-Red Laboratory。
5IBI FIJI 600 HV 程序性开关设备。
6 缓冲液冷却循环器 (Fotodyne ， New Britain ，WI 或Mini Chiller(Bio-Rad Laboratory 。
【实验步骤】1. 脉冲电场凝胶电泳的DNA 样品的制备为避免大分子DNA 在提取过程中断裂，细胞需在琼脂糖凝胶块中进行原位裂解，在本实验中，我们使用金黄色葡萄球菌(StapHylococcusaureus 作为例子。
1 取100mL 对数生长期金黄色葡萄球菌细胞于4℃，5000g 离心5min 。
2 用20mL TEN 缓冲液冲洗沉淀，同样条件离心5min 。
之后用10mL EC 缓冲液使细胞悬浮。
3 取1.5mL 细胞样品与相同体积含2%SeaPLaque 琼脂糖的EC缓冲液迅速混合混匀并等分流溶液至封闭的模块中于4℃凝固，混合前加热至琼脂糖熔解并冷却至50℃。
4 对于每一个菌株，需要15～20 个凝胶块，将它们放至含有30～45μg/mLRNase(50mL 的10mg/mL 的RNase 的10mL EC缓冲液中，于37℃振摇过夜。
5 去掉裂解缓冲液，换为10mL ESP 缓冲液于50℃轻度振摇温育48h 。
6 将凝胶块放在10mL 含有174μg/mL 苯甲基磺酰氟(PMSF的TE 缓冲液中，室温温育4h(2h 换液一次，以灭活ESP 中的蛋白酶K 。
7 用TE 清洗琼脂块6h(2h 换液一次，置于TE 中4℃保存。
2. 限制酶消化提高PFGE 的分辨率取决于100～1000kb 片段电泳结果的重复率，它与酶切关系密切，可在琼脂糖凝胶块中使用合适的内切酶消化。
（生物秀实验频道125μL10× 反应缓冲液，30U 限制酶，加双蒸水至250μL 混匀。
2 取一个凝胶块置其中，合适温度下温育过夜(按内切酶要求后，用TE 缓冲液洗涤并贮存。
3. 应用PFGE 对样品DNA 进行分析1 用0.5×TBE 缓冲液制备一个0.8%SeakemHGT 琼脂糖凝胶，胶的厚度尽量与样品凝胶块相符。
若用Wide Minisub Cell进行电泳的话，50mL 该溶液即可。
2 胶凝后，小心移去样品梳。
将凝胶块用小刀切成与加样孔一致的大小，将样心地插入加样孔，避免产生气泡。
(若样品在溶液中，以l:1的比率与50℃2%Seaplaque 琼脂糖相混合，迅速注入加样孔中。
3 把胶放入电泳槽内，加缓冲液，刚好覆盖胶的表面即可，缓冲液事先14℃冷却。
4 将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关设备相连。
打开电源，调节蠕动泵到适当流速(5～10mL/rain或打开变速泵至40。
5 通过计算机启动极性转换程序。
大于50kb 的限制性片段在1.2s 和0.4s 正向和反向的电脉冲下得以分离，时间一般为3.5h 或更长。
小于50kb的限制性片段在0.4s 正向和0.2s 反向的电脉冲(比率为2:1下得以分离，时间为3～5h 。
6 在 0.5μg/mL 溴化乙锭中进行染色并拍照。
4. 分离、纯化大的DNA 片段1 凝胶染色、分析后，在目的带前(靠近正极处切一个 0.25cm2左右的槽，注入0.8%Seaplaque琼脂糖，使之凝固。
2 重新打开极性转换开关，用紫外递质检测DNA 的迁移，当目的带进入Seaplaque 凝胶中时，关闭开关，切下目的带，移至1.5mL EP 管中。
3 加入2μL 的tRNA ，30μL 5mol/L NaCl，370μL 蒸馏水，在65～70℃之间，化胶并保温10min 。
4 苯酚/氯仿500μL 抽提两次。
5 用2.5 倍体积95%乙醇和1/10 体积NaAc(3mol/L，pH5.2 于-70℃10min 沉淀水相。
再用70%乙醇洗两次并将沉淀溶于TE缓冲液中。
【注意事项】1. 换缓冲掖时尽可能小心不要碰坏琼脂凝胶。
2.PMSF 是一个强烈的蛋白酶共价抑制剂，即有毒又挥发，操作时应在通风橱中进行。
3. 用蛋白酶K 包埋的材料时50℃温育时间很长(24～48h ，有些学者提出如此长时间不必要(Mortimer etal.1990 ，且可能造成高分子质量DNA 降解。
在实验中可视情况而定。
4. 琼脂糖凝胶块在TE(pH7.6中4℃可存放数年，如在0.5mol/L EDTA 中可存放更长时间。
5. 一些高压电源并不适合脉冲电场凝胶电泳，因为这些电源设计时均带有保护电路，它可以检测到负载的突然降低并且引发外加电源自动关闭。
6. 由于电压较高，就会产生热量，为了保证温度为14℃，需要一些冷却设备(缓冲液冷却循环器或MiniChiller 。
此外，把电泳系统放在一个敞口的冰盒中也可保持恒温。
PFGE （脉冲场凝胶电泳）标准操作规程(SOP目的：运用PFGE 方法对20Kb 至数Mb 的DNA 进行分子分型背景知识：这个试验是公认的操作繁琐，至少要2天，而且每一步操作对结果的好坏都有很大影响，因此，一个严格、标准的操作方法是十分十分必要的。
主体内容：一、胶块的制备1、在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约2ml 细胞悬浊液(CSB；2、在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称；3、在模具上标记好对应样品的名称；4、用CSB 湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB 中，用bioMerieux Vitek colorimeter 测其OD 值，并调整至3.6~4.5。
如果OD 值大于4.5，加入CSB 稀释；如果OD 值小于3.6，增加菌量提高其浓度。
5、取400µl细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管中，置于37℃水浴中孵育5分钟。
将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。
6、从水浴箱中取出eppendorf 管，每管加入20µl蛋白酶K(储存液浓度为20mg/ml混匀，使其终浓度为0.5mg/ml。
7、制备好1%Seakem Gold：1%SDS，放于56℃水浴箱中。
8、在eppendorf 管中加入400µl的1% Seakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻混匀。
9、将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。
注意事项：(1用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。
(2细胞悬浊液、蛋白酶K 要置于冰上。
(3在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold：1%SDS时要避免气泡的产生。
(4混合物加入模具时不能产生气泡。
(5在加1% Seakem Gold：1%SDS的过程中1% Seakem Gold：1%SDS要一直放在56℃水浴箱中。
二、细胞的裂解1、在50ml 的screw-cap tube上做好标记。
2、配制细胞裂解液(CLB：每5ml 细胞裂解液加入25µl蛋白酶 K(20mg/ml，使其终浓度为0.1mg/ml，然后颠倒混匀。
注意：蛋白酶K 要置于冰上，配制好的细胞CLB 也要置于冰上。
3、每个管子加入5ml 蛋白酶K/CLB混合液。
4、如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。
(1可重复利用的模具：打开模具，用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap 管中。
(2一次性模具：撕掉模具下面的胶带，用小铲将胶块捅进相应的screw-cap 管中，将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。
5、保证胶块在液面下而不在管壁上。
6、将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速约170转/分钟。
7、将纯水和TE 放在50℃水浴摇床中预热。
三、洗胶块1、从水浴摇床中拿出screw-cap 管，盖上绿色的screened-cap 。
轻轻倒掉CLB 。
在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。
注意：把管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排除干净。
随后的操作中也如此。
2、每管中加入15ml 预热的纯水。
3、确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50℃水浴摇床中，摇10分钟。
4、倒掉水，用纯水再洗一次。
、5、倒掉水，加入15ml 预热的TE ，在50℃的水浴摇床中摇15分钟。
6、倒掉TE ，用TE 重复洗三次，每次10－15分钟。
7、倒掉TE ，加入10ml TE，放在4℃冰箱保存备用。
注意：要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。
四、胶块内DNA 的酶切1、在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及H9812的名称。