蓝莓贮藏期病原细菌的分离与鉴定

蓝莓贮藏期病原细菌的分离与鉴定作者：邓佳郭晓月史正军王芳
来源：《现代园艺》2015年第13期
摘要：为明确云南省玉溪市蓝莓果实腐烂的病原细菌种类，对玉溪市澄江地区蓝莓果实进行致病细菌分离，对分离的病原细菌进行形态学鉴定和分子生物学鉴定。

实验结果表明，从发病腐烂的蓝莓果实上分离出3株病原细菌，初步确定属于沙雷氏菌属（Serratia）微杆菌属（Microbacterum）和短小杆菌属（Cuttobacterium）。

研究结果对玉溪澄江地区蓝莓贮藏期腐烂病害的防治和进一步深入研究将提供一定的参考理论依据。

关键词：蓝莓；细菌；分离鉴定
蓝莓（Vaccinium spp.），学名越橘，属杜鹃花科越桔属多年生落叶或常绿灌木。

蓝莓果实富含维生素E、SOD、大量矿质元素及花色苷等抗氧化物质，具有改善视力、抗氧化、抗癌及延缓脑神经衰老等保健功能，被誉为“水果之王”。

国际粮农组织将其列为人类五大健康食品之一，具有广阔的市场前景和较高的经济价值，成为当前全球发展最迅速的第三代果树。

云南省玉溪市蓝莓一般成熟于6～8月，属于高温多雨季节，且蓝莓是呼吸跃变型浆果，
果实糖分含量较高，采后呼吸作用旺盛，各种生理代谢加快，又因含水量较高，因此采后贮藏
过程中果实易发生变质、腐烂等贮藏病害，造成大量损失，严重影响其商品性和经济价值。

蓝莓耐藏性特别低，常温下（18～22℃）放置5～15d，果实易腐烂。

Connor等研究表明，蓝莓果实在22～℃温度下，2～4日开始出现失水萎蔫、软化、褐变、腐烂等症状。

目前，国外关于蓝莓贮藏病害的研究报道，主要集中在采后病害防治，而在国内，蓝莓贮藏病害致病病原菌已经分离鉴定出几种常见的真菌，包括灰葡萄孢、草酸青霉、褐孢霉、链格孢和枝顶孢，关于蓝莓贮藏期腐败细菌分离鉴定鲜有报道。

本试验采用分子、形态鉴定方法，对蓝莓果实贮藏病害中几种常见腐败细菌进行分离鉴定，判断其所属种类。

本实验结果对蓝莓腐败细菌予以初步识别，为防治蓝莓果实贮藏病害、延长蓝莓贮藏保鲜期提供了理论依据和技术指导。

1材料与方法
1.1材料
蓝莓果实采摘于云南省玉溪市澄江地区蓝莓基地，蓝莓采后立即运回西南林业大学微生物实验室。

选择大小一致、无病虫、无损伤的健康果实作为试验材料，用蒸馏水清洗后置于室温条件（温度18～22℃，相对湿度90%～95%）贮藏3～7d，从自然发病果实的新发病害部位获得分离材料。

1.2培养基
牛肉膏蛋白胨培养基（NA培养基）：蛋白胨10g，牛肉膏5g，琼脂粉16g，氯化钠5g，pH值7.4～7.6，加水补足1 L，121℃高压灭菌20min。

NA液体培养基配方同固体培养基但不加琼脂粉。

1.3试验仪器
PCR仪，美国Bio-RAD公司；电子恒温不锈钢水浴锅，萧山永发电器有限公司沪南实验仪器厂；电泳仪和电泳槽，北京六一仪器厂；制冰机，美国Grant雪花制冰机公司；离心机和微量移液器，德国eppendorf公司；高速冷冻离心机，德国SORVALL公司；超净工作台，Thermo公司；光照培养箱SPX-300B-G型，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；凝胶成像仪G：BOX，英国svngene公司；奥林巴斯光学显微镜。

2试验方法
2.1病原细菌的分离与鉴定
从蓝莓新发病害交接处取果皮组织，用无菌水冲洗3次后，于NA平板上采用平板划线法分离，后于恒温培养箱30℃倒置培养2d；将获得的菌落纯化3次以上直至获得单一菌落后，镜检，转接到NA斜面，待菌苔长出后于4℃临时保存。

2.2病原细菌的显微观察
挑取少量处于对数期的病原细菌菌体制作涂片，采用革兰氏染色法染色后[6]后在显微镜下观察照相。

2.3病原茵细菌的分子鉴定
2.3.1病原菌细菌DNA的提取。

将纯化后菌株接种于NA液体培养基，30℃振荡培养
24h，13000r/min，离心1min，收集菌体。

收集的菌体用生理盐水离心洗涤3次，后用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取试剂盒提取细菌基因组DNA。

提取的DNA在含有荧光染色剂的0.8%琼脂糖凝胶上水平电泳检测，并用凝胶成像系统观察照相。

2.3.216srDNA的扩增。

16srDNA的PCR扩增采用细菌通用引物27F和1492R，引物由硕阳生物技术有限公司合成。

正向引物27F：5’AGA GTT TGA TCC TGGCTC AG3’；反向引物1492R：5’TAC GGY TAC CTTGTT ACG ACTT3’。

反应采用25μL细菌PCR反应体系.反应体系见表1。

按上述组分配制好反应液，混匀后进行PCR扩增，反应程序：94℃起始变性5min；94℃45S，56℃45S，721℃min30S，35个循环；72℃延伸5min。

PCR产物在含有染色剂的0.8%琼脂糖凝胶上水平电泳检测，并用凝胶成像系统观察照相。

2.3.316srDNA的测序及序列分析。

将上述16srDNA的PCR产物送到北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，测序引物同扩增引物。

测序结果利用DNAMAN软件拼接，拼接好的序列在Eztaxon Server2.1进行序列比对，并在GeneBank的数据库（http：//），下载相近的参比16srDNA序列，用MEGA6软件构建系统发育树，并进行序列相似性分析。

3结果与分析
3.1病害发生症状
蓝莓果实腐烂初期表面呈浅褐色水渍状病斑，继而变褐软腐，3～7d后扩展全果，使果肉变褐软腐，表面密生灰白色软毛，发病部位没有一定的规律，腐烂部分可深入到果心。

3.2病原细菌传统形态学鉴定结果及革兰氏染色结果
病原细菌培养后的菌落形态如图1，菌落形态观察结果：L-5菌落平坦，不透明，不光滑，有粉红色分泌物；L-6菌落平坦，不透明，菌落表面有浅桔黄色分泌物；L-7菌落平坦，不透明。

菌落表面有桔黄色分泌物。

细菌采用革兰氏染色显微图像如图2，菌株L5、L6和L7菌均为短杆状，革兰氏染色程阳性，且都具荚膜。

3.3病原细菌分子鉴定结果
3.3.116srDNA的PCR扩增结果。

以细菌通用引物27F和492R作为引物，对蓝莓贮藏期分离出的3株病原细菌进行16srDNA扩增，扩增的电泳检测结果如图
3，均能得到清晰稳定的条带，片段约为1500bp。

3.3.216SrDNA全序列测定和同源性分析。

将上述所得供试菌株的PCR产物测序，测序结果用DNA-MAN软件拼接，拼接结果于Eztax-0n Server2.1进行序列比对，比对结果如表3，由表2可知：菌株L-5与Serratia nematodiphila DZ0503SBSl相似性为98.48%；菌株L-6与Microbacterium arborescens DSM 20754相似性为99.09%，菌株L-7与Curtobacterium albidumDSM 20512相似性为98.93%。

根据16S rRNA序列相似性达到97%以上则认为是同一个属，若序列相似性小于96%～97%的可以认为不是同一个种，小于93%～95%的可以认为不是同一个属的划分原则，确定分离得到的3株病原细菌L5、L6和IJ7分别属于沙雷氏菌属（Serratia）、微杆菌属（Mierobaeterium）和短小杆菌属（Curlobacterium）。

在GenBank上下载与分离得到的3株病原菌序列相近的菌株序列，利用MEGA 6软件建立系统发育树，进行系统发育学分析如图4，由图4可见L5、L6和L7分别隶属于3个系统发育分支，分别为沙雷氏菌属、微杆菌属和短小杆菌属分支，这与序列比对分析结果一致。

综上所述，通过平板划线培养分离得到引起蓝莓贮藏期腐烂的3株优势细菌，经形态学观察结合16srDNA序列分析，分别属于沙雷氏菌属、微杆菌属和短小杆菌属。

4讨论与展望
引起果品腐败的微生物通常包括细菌、霉菌和酵母，以细菌和霉菌引起的果品腐败最为常见，其中：细菌中的非芽孢杆菌由于不产生芽孢且热抵抗力较弱，是新鲜果品中的常见腐败菌。

在自然界存在的细菌中，非芽孢细菌的种类比有芽孢细菌多，因此污染果品的机会较多。

本实验中分离鉴定出引起蓝莓腐烂的3种杆菌分别属于沙雷氏菌属、微杆菌属和短小杆菌属，实验表明，非芽孢杆菌的腐败细菌可以导致贮藏期蓝莓腐烂。

据报道，在冬季贮存甜瓜腐烂组织也分离出沙雷氏菌属的菌株。

分离的细菌类群中沙雷氏菌属是在自然界中作为人类的条件致病菌，该属有的种可能与人类菌血症有关。

崔慧玲等在鲜切生菜贮藏过程中分离鉴定出腐败细菌微杆菌属的某一种，本实验也从贮藏蓝莓果实腐烂发病部位分离鉴定出1株微杆菌属中的腐败细菌。

此外，本次实验首次从蓝莓果实中分离得到1株短小杆菌属细菌。

上述结果表明，腐烂蓝莓组织中存在有害细菌类群，针对此隋况，可以采用低温控制结合化学灭菌的方法进行蓝莓采后贮藏，具体操作工艺流程有待后续进一步深入研究。

收稿：2015-06-12。