原位杂交技术(in situ hybridization)

原位杂交的基本原理

原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物(曾呈奎等2000)。

RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体 (Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。

原位杂交技术（in situ hybridization）是以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异核酸分子的技术。这一技术不需要从组织细胞中提取核酸，对组织中含量极低的靶序列有很高的灵敏度，并可保持组织与细胞的结构完整，反映特异核酸分子的定位。特别是配合使用能定位特异蛋白分子的免疫细胞化学技术，就能对生理或病理条件下从DNA 到mRNA到蛋白质这样一个基因表达过程进行定性和定位的分析，是基因表达研究强有力的手段。

（一）原位杂交技术的原理

原位杂交技术的原理是：使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

1、核酸分子杂交

DNA双链分子在一定条件下可以发生变性和复性的过程。分子杂交技术利用的就是两条互补的DNA单链能够复性的性质。分子杂交是碱基互补的两条异质核酸单链在一定条件下缔合形成双链分子的过程。这一过程相当于DNA的复性，只是核酸单链的来源不同。

原位杂交技术中，以经过标记的已知核酸分子为探针，以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子，造成一定条件使探针与靶核酸分子在原位发生杂交，然后再对其探测。

2、探针标记

探针是经过标记的核酸分子，与待测DNA或RNA序列互补。探针主要有cDNA、RNA和寡核苷酸。

探针标记物有放射性的和非放射性的两类。常用的放射性标记物主要有35S、32P、33P 和3H。非放射性标记物主要有荧光素、生物素、地高辛和溴脱氧尿嘧啶等。通常标记物被

-UTP、生物素-UTP、地高辛-dUTP 等。然后通过各种酶促反应，如随机引物法或PCR法，使标记分子参入探针。

3、杂交

不同来源的序列互补的单链核酸分子在一定条件下借氢键相连而形成双链杂交分子的过程为杂交。杂交可发生于RNA与DNA、DNA与DNA、RNA与RNA之间。形成的双链杂交分子为杂交体（hybrids）。

4、杂交体的探测

对杂交体的探测根据探针标记物的不同而采用各种方法，目的是使标记的杂交体在光镜或电镜下可见。

⑴放射自显影如果探针是同位素标记的，显示杂交反应的方法就是光镜或电镜水平的放射自显影技术。方法是在切片上涂覆核子乳胶膜后置于暗盒中于4℃自显影一段时间，然后经显影和定影后观察银离子在细胞和细胞器分布情况。

⑵免疫细胞化学对于非同位素标记的探针，可根据免疫细胞化学原理用直接法或间接法将探针标记物显示出来。也就是采用那些在光镜或电镜下具有可见性的免疫细胞化学标记

联结的抗地高辛抗体，再加入酶的底物来显示杂交体。

（二）实验方法

原位杂交技术的实验方法主要包括：标记探针的准备，组织样品制备，杂交和杂交体探测。

1.标记探针的准备对cDNA、RNA和寡核苷酸三种探针的选择，要考虑

所要检测的靶核酸分子的性质，如cDNA 和RNA 适宜于检测mRNA分子，寡核苷酸对mRNA的杂交效率和特异性都不如RNA探针。

2.组织样品制备光镜原位杂交标本的固定多使用4%多聚甲醛，常规石蜡包埋和切片，但在操作过程中应提防RNA酶污染。电镜原位杂交标本的固定也采用4%多聚甲醛。与免疫细胞化学技术一样，电镜水平的原位杂交可以在未经包埋的组织切片上进行，称包埋前技

术；也可以在超薄切片上进行，称包埋后技术。冷冻切片能较好的保存靶核酸因而较易获得杂交信号，但对细胞结构的保存较差。

3.杂交杂交是在一定温度和离子强度条件下让标记探针与组织中靶分子结

合的过程。杂交的效率和特异性是优化杂交条件的出发点，也是需要兼顾的两个方面。影响因素主要是探针的结构、杂交温度、杂交液中的甲酰胺浓度和离子强度、杂交后漂洗等。要通过实验对条件进行优化。

4.杂交体探测根据探针标记物的不同采用放射自显影方法或免疫细胞化学

方法显示杂交结果。

5.基本实验过程

探针标记→纯化→(变性)

↓→涂覆乳胶→放射自显影

原位杂交→杂交体探测：→加酶联抗体→加酶底物显色

↑→金银染色

样品制备→切片→通透处理

2 荧光原位杂交技术

荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是在已有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切片上的特异fl-N：~行杂交，通过荧光检测系统(荧光显微镜)检测信号DNA序列在染色体或DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂交位点。FISH技术检测时间短，检测灵敏度高，无污染，已广泛应用于染色体的鉴定、基因定位和异常染色体检测等领域。FISH是原位杂交技术大家族中的一员，因其所用探针被荧光物质标记（间接或直接）而得名，该方法在80年代末被发明，现已从实验室逐步进入临床诊断领域。基本原理是荧光标记的核酸探针在变性后与已变性的靶核酸在退火温度下复性；通过荧光显微镜观察荧光信号可在不改变被分析对象（即维持其原位）的前提下对靶核酸进行分析。 DNA荧光标记探针是其中最常用的一类核酸探针。利用此探针可对组织、细胞或染色体中的DNA进行染色体及基因水平的分析。荧光标记控针不对环境构成污染，灵敏度能得到保障，可进行多色观察分析，因而可同时使用多个探针，缩短因单个探针分开使用导致的周期过程和技术障碍。