通过小鼠腹水如何大量制备单克隆抗体
单克隆抗体制备技术
单克隆抗体制备技术单克隆抗体制备标准化操作方案（McAb—sop）第一章：小鼠免疫第二章：细胞融合第三章: 细胞建株第四章：细胞株鉴定第五章：腹水制备第六章：抗体纯化和鉴定(略）第一章. 小鼠免疫（BALB/c）小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证.一.小鼠免疫分两程方案：根据免疫学原理小鼠免疫方案设计如下:1.短程免疫方案:第一次: 1d 100ug（可溶性Ag)+等体积完全佐剂。
腹腔注射。
0.4ml/只第二次: 7d 100ug+等体积不完全佐剂腹腔注射。
0.4ml/只第三次: 12d 50ug IV 0.3ml/只(强化）第四次：15d 20ug IV 0。
3ml/只第17 d~24d内融合2长程免疫方案:第一次: 1d 100ug+等体积完全佐剂腹腔注射（IP）0。
4ml/只第二次: 14d 100ug+等体积不完全佐剂IP 0。
4ml/只第三次：21d 100ug IP或IV 0.4ml/只第四次: 25d 50ug IV 0.3ml/只(强化）第五次: 28d 20ug IV 0.3ml/只第30d~37d内融合。
注意:a。
在融合前(即加强免疫前)必须测定免疫鼠血清滴度,短程免疫滴度必须≥1:8000,长程免疫≥1：32000,方可做融合。
b。
免疫周期完成后所有小鼠需在一周内做完融合. 否则不能保证融合质量.二．小鼠免疫质控标准1．免疫鼠血清滴度短程≥1:8000，长程≥1：32000；2．小鼠免疫后需在一周内做完融合；3．免疫鼠脾脏明显大于空白鼠脾脏并且较粘连。
免疫鼠选择：免疫种类为：balb/c小鼠；性别。
雌性佳；大小:6—7周龄：体重：20g;健壮。
活泼。
第二章．细胞融合一．融合前准备1．脾细胞：取符合免疫质控标准的鼠在无菌条件下取出其脾脏,并制成单个脾细胞悬液,每只鼠的脾细胞约1～3亿.在制备过程中严格保证无菌。
制备脾细胞可选择研磨器+筛网或用无菌注射器吹吸。
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。
○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。
应用辛酸硫酸胺法提取小鼠腹水和血清中的IgG抗体
应用辛酸硫酸胺法提取小鼠腹水和血清中的IgG抗体
白丽;钱金;王晶
【期刊名称】《大理学院学报（医学版）》
【年(卷),期】2000(009)004
【摘要】目的:从小鼠腹水和血清中纯化IgG抗体.方法:首先用辛酸沉淀小鼠腹水和血清中的非免疫球蛋白,然后用固体硫酸胺提取抗人T和B细胞白血病单克隆抗体(IgG1和Ig2b)和多克隆IgG抗体.结果:经SDS-PAGE和活细胞免疫荧光法鉴定,获得了纯度高、活性好的抗体,腹水中单抗的回收率达80%以上.结论:本方法是一种简单、价廉且有效的纯化小鼠腹水和血清IgG抗体的方法.
【总页数】2页(P3-4)
【作者】白丽;钱金;王晶
【作者单位】大理医学院微生物学及免疫学教研室云南大理 671000;大理医学院微生物学及免疫学教研室云南大理 671000;大理医学院微生物学及免疫学教研室云南大理 671000
【正文语种】中文
【中图分类】R392.11
【相关文献】
1.辛酸-硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应用 [J], 陈丹;孙广瑞;柳增善
2.改良的紫外荧光光度计法检测小鼠血清中多巴胺β羟化酶活性的方法 [J], 刘林林;孙宝胜;杨巍;刘晓岚
3.ELISA法检测囊尾蚴虫病IgG抗体中弱阳性质控血清的制备及应用 [J], 杨柳莹;孙黎;赵仪;陈曦阳;王晓凤;凌攀
4.应用辛酸硫酸铵法提取纯化兔IgG [J], 马贵军;韩素娟;剡根强;周霞
5.辛酸-硫酸铵法在纯化血清旋毛虫特异性IgG抗体中的应用 [J], 刘俊琴;申丽洁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
一种提高单克隆抗体产量的简易方法
一种提高单克隆抗体产量的简易方法近年来单克隆抗体已广泛应用于基础理论与临床应用研究［1］。
如何制备质量好产量高的单克隆抗体是当前各有关实验室研究的重要问题，通常用于生产单克隆抗体的方法有两种：①利用纯系小鼠生产免疫腹水，该法的优点是产量和效价高，但纯化困难，价格昂贵，生产周期长；②杂交瘤细胞常规体外培养法，此法虽然产量不高效价低，但不含正常小鼠免疫球蛋白，较易纯化且成本低，但此法若需大量生产则需特殊设备［2］。
最近有人报道用杂交瘤细胞培养也可提高单克隆抗体的产量且方法简便［3］。
经我们对3株抗人衰变加速因子（Decay-Accelerating Factor，DAF，CD55）单克隆抗体的制备和产量测定，获得较为满意的结果，现报道如下。
1 材料与方法1.1 纯化抗原及抗体纯化的可溶性重组DAF由英国Reading大学Goodfellow博士惠赠。
抗人DAF单克隆抗体IC6培养上清（1μg／ml）由日本Fukushima医学院Fujita博士惠赠。
辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（工作浓度1∶1000），购自中山生物制品有限公司。
1.2 培养基RPMI 1640（Gibco产品），含2mmol L-谷氨酰胺，100U／ml青霉素，100μg ／ml链霉素和10％FCS。
1.3 杂交瘤细胞系DA11、DG3、DG9杂交瘤细胞均由本实验室建立，经SP2／0与免疫小鼠脾细胞融合筛选而成，抗体亚类均为IgG1，能稳定分泌抗人DAF单克隆抗体［4］。
1.4 平卧式常规法培养将DA11、DG3、DG9杂交瘤细胞用常规细胞培养法培养在25ml 的方瓶中加培养液5ml，置37°C孵箱3～4d后，当瓶中只剩下少于5％有活力的细胞时离心收集上清，－20°C保存备用。
1.5 直立式培养将DA11、DG3、DG9杂交瘤细胞常规培养在平卧式细胞培养瓶中直到细胞密度达90％～95％时，补充培养液至瓶颈（总量为30ml），加橡皮塞直立式放置在37°C 孵箱中，每天观察细胞并晃动1次，可见死细胞不断脱落至瓶底，活细胞继续增殖，直到培养液变酸后离心收集上清，－20°C保存备用。
小鼠单克隆抗体的制备
小鼠单克隆抗体的制备小鼠单克隆抗体是利用小鼠免疫系统产生的B细胞，经过细胞融合技术获得的单克隆抗体。
这种抗体具有高亲和力和高特异性，可用于治疗和诊断多种疾病，是目前最常用的单克隆抗体制备方式之一。
1. 免疫小鼠选择目标抗原，一般为蛋白质或多肽。
将抗原与佐剂混合后注射给小鼠，以激发小鼠B细胞产生特异性抗体。
免疫方案应根据抗原的种类、大小和来源等因素进行优化，一般需要进行多次免疫。
2. 制备小鼠脾细胞将小鼠处死，取出脾脏，用PBS洗涤并制备单细胞悬液。
可采用机械打碎法、酶消化法等方法提取脾细胞。
3. 合并小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞将小鼠脾细胞与无限增殖的骨髓瘤细胞混合，使用聚乙二醇或电融合等方法融合成杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有小鼠脾细胞的抗原识别能力和骨髓瘤细胞的无限增殖能力。
4. 限制杂交瘤的生长并筛选细胞可使用一些特定的选择剂或条件限制杂交瘤细胞的生长，如耳蜗毒素（HAT）缺失培养基等。
在特定条件下，只有细胞融合后获得完整染色体的杂交瘤细胞才能存活。
存活的杂交瘤细胞称为单克隆细胞，并通过ELISA等方法筛选出目标抗体的阳性细胞。
5. 扩增单克隆细胞并提取抗体将单克隆细胞进行扩增即可获得大量的目标抗体。
提取抗体可使用乙酸铵等方法，得到纯度较高的抗体液。
小鼠单克隆抗体制备的优点是制备简便、成本低廉，且能够获得高特异性的抗体。
但是，由于小鼠单克隆抗体来源于小鼠免疫系统，因此可能存在的抗原表位的差异、抗体的可溶性和稳定性等问题需要仔细考虑。
此外，还需要注意到小鼠单克隆抗体的制备和饲养过程中可能存在的伦理道德问题。
因此，在抗体制备过程中需注意合理规划实验设计，遵守伦理规范。
制备单克隆抗体的原理
制备单克隆抗体的原理
单克隆抗体制备的原理是使用相同的抗原去刺激小鼠免疫系统产生抗体，然后利用细胞融合技术融合小鼠脾细胞和肿瘤细胞，形成的杂交瘤细胞能够长期稳定地分泌单一种抗体。
制备单克隆抗体的步骤包括：免疫小鼠、采集脾细胞、合并脾细胞和肿瘤细胞、筛选杂交瘤细胞、克隆化杂交瘤细胞、培养单克隆细胞、收集单克隆抗体。
首先，将目标抗原注射到小鼠体内，刺激其免疫系统产生抗体。
随后，采集小鼠脾脏，分离脾细胞。
接下来，将脾细胞与骨髓瘤细胞（如myeloma）进行细胞融合，形成杂交瘤细胞。
这个步骤可以通过短暂的高温、聚乙二醇或其他化学物质来促进细胞融合。
随后，将杂交瘤细胞进行筛选。
通常通过培养基中加入选择性抗生素来杀死未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，只留下融合细胞的杂交瘤细胞。
这些细胞称为杂交瘤克隆细胞。
然后，将杂交瘤克隆细胞进行克隆化。
将单个克隆细胞分离，分别培养成单个细胞克隆，并扩展培养。
接下来，用ELISA等技术对克隆细胞的细胞上清进行筛选，
以检验其对目标抗原的特异性。
只有对目标抗原产生特异性抗体的克隆细胞才能被选择出来。
最后，收集特异性单克隆抗体。
将特异性的克隆细胞进行扩增
培养，并收集细胞上清中的单克隆抗体。
通过上述步骤，可以制备出具有高特异性、高亲和力的单克隆抗体，用于特定抗原的检测、定量、纯化等实验和应用中。
制备分泌单克隆抗体杂交瘤细胞小鼠腹水的方法
维普资讯
２ ０ 年 ６月第 ４ 卷第 ５ ＿ ０７ ５ 期 ＿－ ——
［ 关键词］抗体 ； 单克 隆抗来自 ； 腹水 ； 鼠 小【 图 分类 号】Ｒ ９ 【 献标 识码 】Ａ 【 章 编 号】１７ — ７ １ Ｏ ７０ — ３ ０ 中 ３２ 文 文 ６ ３ ９ ０ （ ０）５ ０ — ２ ２
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小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。
○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。
○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。
单克隆抗体的制备原理及方法
单克隆抗体的制备原理及方法单克隆抗体是一种来源于同一种细胞的抗体，具有高度的特异性和亲和力。
它在生物医药领域有着广泛的应用，包括疾病诊断、药物治疗、生物学研究等方面。
本文将介绍单克隆抗体的制备原理及方法，希望能够为相关研究工作者提供一些帮助。
首先，单克隆抗体的制备原理是基于对特定抗原的高度特异性识别。
在制备过程中，首先需要选择合适的抗原，通常选择蛋白质、多肽或小分子等作为抗原。
然后，通过免疫动物（如小鼠、大鼠、兔子等）注射抗原来诱导免疫应答，激发机体产生特定的抗体。
接着，从免疫动物中获取免疫细胞，如B细胞，然后将其与癌细胞融合，形成杂交瘤细胞。
这些杂交瘤细胞具有免疫细胞的抗体合成能力和癌细胞的无限增殖能力，能够长期产生单克隆抗体。
其次，单克隆抗体的制备方法主要包括免疫动物免疫、细胞融合、筛选和培养等步骤。
在免疫过程中，需要确定合适的免疫动物种类、抗原的免疫方案和免疫时间等因素，以提高单克隆抗体的特异性和亲和力。
在细胞融合过程中，需要将免疫细胞与癌细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
接着，通过细胞培养和筛选，筛选出产生特定单克隆抗体的杂交瘤细胞，并进行大规模培养和抗体的纯化。
在单克隆抗体的制备过程中，需要注意一些关键技术和方法。
例如，在抗原的选择和免疫动物的免疫过程中，需要进行充分的实验设计和控制，以确保抗体的特异性和亲和力。
在细胞融合和筛选过程中，需要选择合适的细胞融合剂和培养基，以提高杂交瘤细胞的产量和纯度。
此外，在单克隆抗体的纯化过程中，需要选择合适的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析等，以获得高纯度的单克隆抗体。
总之，单克隆抗体的制备原理及方法是一个复杂而又关键的过程，需要在实验设计、技术操作和实验控制等方面进行精心的策划和执行。
通过不断的实验探索和技术创新，相信单克隆抗体制备技术将会得到进一步的提高和发展，为生物医药领域的发展做出更大的贡献。
腹水制备MANF单克隆抗体
腹水制备MANF单克隆抗体
1.领取6周龄的成年BALB/c 小鼠，SFP级。
2.使用前用弗氏不完全佐剂对小鼠腹腔进行预处理，0.5ml/只，腹腔注射。
3.1周后，收集处于对数生长期的杂交瘤细胞，用无血清DMEM 培养基调整
至2 ×106 个细胞/ml ，给予小鼠腹腔注射，0.5 ml/只小鼠。
4.注射后每天观察小鼠腹部膨大情况，待小鼠腹部明显膨大时收集腹水，时间
大约7～10 d 后。
注：腹部明显膨大时要及时收集腹水，以免小鼠死亡。
5.腹水在4℃以3 000 rpm 离心10 min。
6.收集上清液，4℃暂存，然后进行纯化
7.或者将少量腹水分装，-80℃冻存备用。
8.将杂交瘤细胞培养过程中收集的培养上清液一起送去纯化。
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化步骤小鼠单抗是一种通过免疫响应体外制备的抗体，通常通过腹水提取方式来获得。
下面是小鼠单抗腹水纯化的一般步骤：1.小鼠免疫将小鼠注射目标抗原，通常使用免疫佐剂将抗原与免疫系统刺激起来。
免疫期间要注意小鼠的饮食和生活环境，保证其健康状态。
2.收集腹水在免疫后，根据小鼠的体重和免疫剂量，使用注射器从小鼠的腹腔中收集腹水。
使用无菌器具，注意操作过程要无菌。
3.储存和预处理腹水收集到的腹水用离心机离心，去除其中的杂质和细胞。
然后将澄清的腹水分装入无菌离心管中，并进行储存。
4.蛋白质浓缩和沉淀将腹水进行浓缩，可以使用离心或超滤等方法。
浓缩过程中要注意温度和时间的控制，以避免蛋白质降解。
浓缩后的腹水可以进一步进行封冻保存。
5.抗原亲和纯化使用亲和层析柱，将浓缩的腹水与目标抗原相互作用。
亲和层析柱可以选择已经与目标抗原结合的树脂，或者通过动态亲和层析的方法进行柱填充。
6.纯化和洗脱将亲和层析柱上结合的抗原-抗体复合物进行洗脱。
可以使用洗脱液来改变物质之间的亲和力，以实现复合物的解离。
洗脱后的洗脱液可以进行进一步的分析和检测。
7.鉴定和分析对纯化后的抗体进行鉴定和分析，可以使用免疫层析、SDS-、Western blot等方法。
这些方法可以检测纯化后的抗体的纯度、抗体滴度和特异性。
8.储存和保存将纯化后的抗体进行分装并储存，通常以冷冻的形式保存。
在保存的过程中要注意使用无菌的存储容器，避免污染和降解。
以上是小鼠单抗腹水纯化的一般步骤。
根据实际需求和具体实验条件的不同，可能会有所调整。
另外，为了保证实验的安全和可重复性，建议在进行实验前充分了解相关实验操作和操作流程，并遵守实验室安全规范。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程制备单克隆抗体的流程包括动物的选择与免疫以及细胞融合两个步骤。
在动物的选择方面，纯种BALB/C小鼠是较为理想的选择。
这种小鼠温顺、离窝的活动范围小，体弱，食量及排泄物也较少，适合在洁净的实验室中饲养。
目前，许多实验室都选择纯种BALB/C小鼠来进行杂交瘤技术。
在免疫方案的选择方面，合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功以及获得高质量的单克隆抗体至关重要。
一般来说，根据抗原的特性不同，需要制定不同的免疫方案。
对于可溶性抗原，由于免疫原性较弱，需要加佐剂。
常用的佐剂包括XXX完全佐剂和XXX不完全佐剂。
初次免疫时，抗原的剂量一般为1-50μg，加福氏完全佐剂进行皮下多点注射或脾内注射（一般0.8-1ml，0.2ml/点）。
之后，每隔3周进行一次免疫，剂量同初次免疫，但XXX不完全佐剂进行皮下或腹腔内注射（ip剂量不宜超过0.5ml）。
第三次免疫时，剂量同前两次，不加佐剂，进行腹腔内注射，5-7天后采血测其效价。
如果需要加强免疫，剂量一般为50-500μg，可以进行腹腔内或静脉内注射。
对于可溶性抗原，还有一些更新的免疫方案，如将可溶性抗原颗粒化或固相化、改变抗原注入的途径以及使用细胞因子作为佐剂等。
对于颗粒抗原，免疫性较强，不需要加佐剂就可以获得很好的免疫效果。
以细胞性抗原为例，免疫时要求抗原量为1-2×107个细胞。
初次免疫时，抗原剂量为1×107/0.5ml，进行腹腔内注射，之后每隔2-3周进行一次免疫，剂量同初次免疫。
如果需要加强免疫，在融合前三天进行1×107/0.5ml的腹腔内或静脉内注射。
在细胞融合前的准备工作中，选择合适的骨髓瘤细胞系也是十分重要的。
骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样可以提高杂交融合率，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量的单克隆抗体。
在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖。
为了促进细胞的生长繁殖，需要加入其他活细胞，这些细胞被称为饲养细胞。
11.7小鼠腹水纯化
2．方法：
1、把小鼠腹水和binding buffer按1：2或者更高的比例混合，之后用0.45um滤膜过滤。
2、把填料小心的装入合适的柱子中，等待大约30min填料就会沉淀好。
3、用binding buffer平衡柱子直至平衡，测流出液体的pH值为9.0，流速设置为1.00ml/min
4、加入处理好的样品，此时要把流速设置为0.5ml/min
5、继续用binding buffer洗脱杂蛋白直至平衡。
6、用elution buffer洗脱目的蛋白，待等到目的蛋白波峰出现时立即收集。
7、使用洗脱液洗脱柱子直至平衡
8、使用保存液（不含叠氮钠）洗脱直至平衡
9、取出填料用含有叠氮钠的保存液4℃保存。
试验结果
1．纯化得到纯抗体
2．
3．
4．
5．
试验分析
问题分析
1．
2．
3．
4．
5．
结果分析
1．
2．
3．
4．
5．
试验进一步设计方向
问题解决设计
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整体试验设计
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备注说明
试验记录整理说明：
1．学生每天试验务必进行试验记录，并进行规范整理；此工作为实验进行过程中的例行工作；
2．试验目的、方法应与试验日期当天记录整理；试验结果、试验分析和试验进一步设计应予试验完成后及时记录整理；
试验技能训练记录整理表
实验室名称
动物传染病与基因芯片实验室
试验学生姓名
李俊材
试验日期
小鼠单克隆抗体的制备过程
小鼠单克隆抗体的制备过程嘿，朋友们！今天咱就来唠唠小鼠单克隆抗体的制备过程，这可有意思啦！你想想啊，就好像要盖一座特别的房子。
首先呢，得选好“地皮”，也就是要选一只健康的小鼠。
这小鼠可不能随随便便找一只，得是那种身强体壮、精神头十足的。
然后呢，给这小鼠来点特别的“刺激”，把咱要研究的抗原注射到它身体里。
这就好比给它一个任务，让它记住这个抗原长啥样。
小鼠呢，也不含糊，身体就开始有反应啦。
过一段时间后，把小鼠体内产生抗体的细胞取出来，这些细胞就像是一个个小战士，它们知道怎么对付那个抗原呢。
但是光有这些小战士还不行啊，咱得给它们找个好地方培养。
接下来，把这些细胞和一种叫骨髓瘤细胞的家伙放到一起。
这骨髓瘤细胞就像是个好伙伴，能和那些小战士一起成长。
然后在一些特殊条件下，让它们融合在一起，变成杂交瘤细胞。
这杂交瘤细胞可厉害啦，既有小战士的本事，又有骨髓瘤细胞的特点。
然后呢，就把这些杂交瘤细胞一个一个地分开培养，就像种一棵棵小树苗一样。
这可得细心着点，别让它们长坏了。
培养好了后，就得看看哪些小树苗是最棒的，能长出我们想要的单克隆抗体。
这就好比挑将军，得挑出最厉害的那个。
最后，把这些厉害的杂交瘤细胞扩大培养，让它们大量生产单克隆抗体。
哇，就像收获了满满的果实一样让人开心！你说这过程是不是很神奇？就像一场奇妙的冒险！从选小鼠到得到单克隆抗体，每一步都充满了挑战和惊喜。
这可不是随便谁都能搞定的事儿，得有耐心，有技术，还得有点运气呢！咱再想想，如果没有这小鼠单克隆抗体，那好多医学研究和疾病治疗不就没办法进行啦？所以说啊，这小小的制备过程，可有着大大的意义呢！总之，小鼠单克隆抗体的制备过程就像是一场精彩的演出，每一个角色都很重要，每一个步骤都不能马虎。
咱得好好对待，才能让这场演出圆满成功呀！。
小鼠单克隆抗体制备的原理
小鼠单克隆抗体制备的原理
嘿，朋友们！今天咱们就来聊聊小鼠单克隆抗体制备的原理，这可真是个超级有趣的事儿呀！
你看哈，就像我们盖房子需要砖头一样，制备单克隆抗体也得有它的“基石”呀。
这其中的关键就是小鼠啦！我们先把特定的抗原注射到小鼠体内，哎呀，这就好比给小鼠一个特别的“任务”。
小鼠收到这个“任务”后，它的免疫系统就开始行动啦！它的身体里就会产生各种各样针对这个抗原的抗体。
这时候就像是一场热闹的“派对”在小鼠体内举行呢！
然后呢，我们把小鼠的脾脏细胞取出来，和骨髓瘤细胞融合在一起。
哇塞，这融合的过程就好像是两个小伙伴手牵手一起去冒险！融合后的细胞就有了既能产生抗体，又能无限增殖的能力，多厉害呀！
接着就是筛选啦，就像在一堆苹果中找出最甜的那一个一样，我们要找出能产生我们想要的单克隆抗体的细胞。
这可不是一件容易的事儿呀，但也正因为不容易，才更有意思呢，对吧？
经过一系列的培养和筛选，最终我们就得到了纯化的小鼠单克隆抗体啦！这抗体就如同是小鼠送给我们的一份超级珍贵的“礼物”。
想想看，通过这么一系列神奇的步骤，我们就能得到这么厉害的单克隆
抗体，这多让人兴奋啊！这就是小鼠单克隆抗体制备的原理呀，是不是超级有趣？让我们一起为这个神奇的科学而感叹，为科学家们的智慧点赞吧！
结论：小鼠单克隆抗体制备原理就是通过一系列巧妙的操作，让小鼠的
免疫系统和细胞融合等技术相结合，最终制备出具有特定功能的单克隆抗体，这真的是非常了不起的科学成就！。
单克隆抗体的纯化
单克隆抗体的纯化一、腹水型单抗的纯化在单抗纯化之前，一般均需对腹水进行预处理，目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质、以及脂肪滴等。
常用的方法有二氧化硅吸附法和过滤离心法，以前者处理效果为佳，而且操作简便。
1、二氧化硅吸附法新鲜采集的腹水（或冻存的腹水），2000r/min 15分钟，除去细胞成分（或冻存过程中形成的固体物质）等；取上层清亮的腹水，等量加入PH7.2巴比妥缓冲盐水（VBS；0.004mol/L巴比妥，0.15mol/L NaCl，0.8mmol/L Mg2+，0.3mmol/L Ca2+）稀释；然后以每10ml稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温孵育30分钟，不时摇动；2000g离心20分钟，脂质等通过该法除去，即可得澄清的腹水。
2、过滤离心法用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；用10000g 15分钟高速离心（4℃）除去细胞残渣及小颗粒物质。
3、混合法即上述两法的组合，先将腹水高速离心，取上清液再用二氧化硅吸附处理。
二、单抗的粗提1、硫酸铵沉淀法（1）饱和硫酸铵溶液的配制500g硫酸铵加入500ml蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。
临用前取所需的量，用2mol/L NaOH调PH至7.8。
（2）盐析吸取10ml处理好的腹水移入小烧杯中，在搅拌下，滴加饱和硫酸铵溶液5.0ml；继续缓慢搅拌30分钟；10000r/min离心15分钟；弃去上清液，沉淀物用1/3饱和度硫酸铵悬浮，搅拌作用30分钟，同法离心；重复前一步1-2次；沉淀物溶于1.5ml PBS（0.01mol/L PH7.2）或Tris-HCl缓冲液中。
（3）脱盐常用柱层析或透析法。
柱层析法是将盐析样品过Sephadex G-50层析柱，以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速每分钟1ml。
第一个蛋白峰即为脱盐的抗体溶液。
透析法是将透析袋于2% NaHCO3，1mmol/L EDTA溶液中煮10分钟，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10分钟，冷至室温即可使用（并可于0.2mol/L EDTA溶液中，4℃保存备用）。
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教学中产生的问题：单克隆抗体的制备过程中，大家都关注了筛选过程，往往没有关注制备的两条途径，其中之一，细胞培养的途径许多学生能理解，而腹水生产的途径就不熟悉，教材中也没有介绍，而这对内环境的知识也是有帮助的。
单克隆抗体（monoclonal
antibody，MAb），是针对专一的抗原决定簇产生的抗体。
单克隆技术又名杂交瘤技术起源于1975年，主要原理是利用产生抗体的B细胞与骨髓瘤细胞杂交融合成杂交瘤细胞，生产抗体。
两种方法生产单克隆抗体：
目前大量制备单抗的方法主要有两种方法，一种是动物体内生产法（腹水制备），在小鼠腹腔内接种杂交瘤细胞，杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体，约1-2周，可见小鼠腹部膨大，用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体；另一种是细胞体外培养法，将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养，在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。
由于腹水中单克隆抗体的产生通常会导致内源性宿主蛋白的污染，因此细胞培养对于小规模和大规模单克隆抗体的生产至关重要。
重点问题解疑：如何通过腹水产生单克隆抗体？
杂交瘤细胞被注射到小鼠腹腔内，由于有组织液提供足够的营养，所以能够大量分裂。同时部分杂交瘤细胞分泌抗体，这些细胞和抗体导致腹腔组织液渗透压增高，血浆和淋巴就会渗出并潴留在腹腔内形成腹水。
腹水制备法的优点：
腹水制备法操作简单、制备成本低，是目前国内生产抗体的主要方式，但是，得到的腹水常混有小鼠的各种杂蛋白（包括免疫球蛋白Ig），而且还有污染动物病毒的危险。而体外培养法通过转代培养制备的细胞培养得到的抗体，不但不含小鼠杂蛋白和动物病毒，而且抗体易纯化，目前在国外抗体生产中非常流行。