重组质粒的转化
重组质粒连接转化过程
重组质粒连接转化过程
重组质粒连接转化过程是指将外源DNA片段与质粒DNA片段进行连接，并将其转化到宿主细胞中的过程。
该过程通常包括以下步骤:
质粒DNA的提取和纯化：从质粒库中获取质粒DNA，并进行纯化和扩增。
外源DNA的提取和纯化：从基因组DNA中分离出外源DNA片段，并进行纯化和扩增。
质粒DNA和外源DNA的连接：将纯化的质粒DNA和外源DNA片段进行连接，生成重组质粒。
转化宿主细胞：将连接好的重组质粒转化到宿主细胞中，使其获得新的基因表达或功能。
筛选阳性克隆：通过筛选方法，选出携带重组质粒的宿主细胞，并鉴定其是否成功表达了外源基因。
总之，重组质粒连接转化过程是一种重要的基因操作技术，可广泛应用于基因治疗、基因疾病治疗、农业生物技术等领域。
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程
在大肠杆菌中表达重组蛋白的流程通常包括以下步骤：
1. 克隆：首先需要将目标基因克隆到适当的表达载体中。
这可以通过PCR扩增目标基因，然后将其与表达载体连接，形成重组质粒。
2. 转化：将重组质粒转化到大肠杆菌细胞中。
可以使用化学方法（如热冲击法）或电穿孔法将质粒导入细胞。
3. 选择：转化后，将细胞分散在含有适当抗生素的琼脂平板上培养。
只有带有重组质粒的细胞能够存活并形成菌落。
4. 培养：将含有重组细胞的培养液转移到适当的培养基中，并在适当的条件下培养。
这可能包括调节温度、pH值和搅拌速度等。
5. 表达：在培养期间，目标基因会被大肠杆菌细胞转录和翻译为蛋白质。
使用适当的启动子和调控序列，可实现目标蛋白的高效表达。
6. 细胞破碎：一旦细胞达到最佳表达水平，就需要破碎细胞以释放目标蛋白。
这可以通过多种方法实现，如超声波、高压破碎或化学方法。
7. 纯化：通过使用各种分离和纯化技术（如亲和层析、凝胶过滤、离子交换层析等），从细胞裂解液中纯化目标蛋白。
以上是在大肠杆菌中表达重组蛋白的一般流程。
具体的步骤和条件可能因实验设计和目标蛋白的特性而有所不同。
实验六重组质粒的连接、转化及筛选
PART A 分子生物学实验 实验六 重组质粒的连接、转化及筛选内 容 提 要采用T4 DNA连接酶对带有粘性末端的外源基因和载体pUC19进行连接，产物通过转化和筛选，得以构建重组的质粒DNA分子。
本实验要求：1、学习重组质粒的构建和筛选。
2、了解几种连接反应策略。
原 理先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段，然后体外使两者相连接，再用所得到重组质粒转化细菌，即可完成在质粒载体上进行克隆。
为提高克隆的效率，通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例，可以将载体的自身环化限制在一定程度之下，也可以进一步采取一些特殊的克隆策略，如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化，还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。
外源DNA 片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：1、带有相同的粘性末端：用相同的酶处理可得到这样的末端。
由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA 均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物，而且正反两种连接方向都可能有。
所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA 的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。
还可将载体DNA 的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA 的自身环化。
带5'端磷酸的外源DNA 片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli 受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。
2、带有平末端：是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA 聚合酶补平所致。
由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA 连接酶的浓度和外源DNA 及载体DNA 浓度均要高得多。
通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA 分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。
本实验所使用的载体质粒DNA为pUC19，转化受体菌为E. coli DH5α菌株。
重组质粒的转化及蛋白表达
重组质粒的转化及蛋白表达
1、将连接好的重组质粒加入到25 µl的感受态中，冰浴30 min，然后42℃热激60 s，冰浴5 min后加入400 µl的LB培养基，37℃培养45 min后吸取100 µl涂有Amp的LB平板，37℃过夜培养。
2、次日，从平板中随机挑取5个菌落于2 ml具有Amp抗性的LB培养基中，摇混后，利用PCR进行验证，选择有阳性克隆的菌液进行蛋白表达，其次送菌液至测序公司进行测序分析。
3、将选择的菌液按照1:100的比例扩大培养，37℃ 200 rpm摇培至OD600值为1.0~1.2左右（用时约4~5 hours）。
4、将菌液转至16℃，200rpm继续摇培1~2hours，待菌液冷却至16℃后加入400μl 0.5M的IPTG，诱导过夜。
5、收集菌体，4000 rpm×20℃×10 min，100 µl灭菌PBS重悬细菌，5×loading buffer 煮沸10 min后，12% SDS-PAGE检测表达情况。
101分子生物学实验3重组质粒转化
实验重组质粒的转化实验原理：利用CaCl2处理感受态体细胞，然后通过热休克处理，即置于42℃高温热激90秒，热休克后，需要使受体细胞在不含有抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够的蛋白，以便能在含有抗生素的平板上生长菌落。
实验目的：学习外源DNA导入原核生物细胞的方法。
实验内容：化学转化法。
一、实验材料感受态细胞，重组质粒，LB培养基，抗生素AMP，质粒T+P。
二、主要设备微量移液器，微量离心管，台式离心机、恒温振荡摇床、恒温水浴锅、制冰机和记时器。
三、实验方法1. 制备含有Amp抗生素的LB平板。
2. 取一个1.5ml离心管，加入100μl感受态细胞悬液，置冰上：加入10ul质粒T＋G（提取的质粒DNA稀释500X），用移液器轻柔混匀。
冰上静置20min。
3. 42℃水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3~5min。
整个过程不要振荡菌液。
4. 加入1ml LB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃振荡培养（180rpm）1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
5. 取100ul菌液，至含有抗生素Amp的LB固体培养基上，涂布均匀。
7. 待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12~16小时，菌落生长良好而又未互相重叠时，取出。
8.计算转化率统计每一个培养皿中的菌落数。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积；转化频率（转化子数/μg质粒DNA）=转化子总数/质粒DNA加入量（μg）；。
表达质粒重组和转化的主要技术流程
表达质粒重组和转化的主要技术流程1.首先，需准备目的质粒和DNA的供体质粒，用于质粒重组实验。
First, the recipient plasmid and the donor plasmid needto be prepared for plasmid recombination experiment.2.将供体质粒进行酶切，以释放目的基因片段。
The donor plasmid is digested with enzymes to release the target gene fragment.3.将目的基因片段和目的质粒进行连接，形成重组质粒。
The target gene fragment is ligated with the recipient plasmid to form a recombinant plasmid.4.将重组质粒转化至宿主细胞中，使宿主细胞具有目的基因。
The recombinant plasmid is transformed into host cells to introduce the target gene into the host cells.5.转化宿主细胞的方法包括热冲击法、电穿孔法、化学法等。
Methods for transforming host cells include heat shock, electroporation, and chemical methods.6.通常使用大肠杆菌作为转化的宿主细胞。
E. coli is commonly used as the host cell for transformation.7.转化宿主细胞后，将细胞在含有选择性抗生素的培养基中培养。
After transforming the host cells, the cells are cultured in a selective antibiotic-containing medium.8.选择性抗生素可杀死未转化的细胞，只留下携带质粒的转化细胞生长。
重组质粒的转化(转菌)
重组质粒的转化重组质粒的转化(热休克法)本方案不仅适合于转化连接体系，同样适合于转化已有的质粒（一般1~2µl质粒即可）。
本流程以α-互补鉴定为例。
适用于含有β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的载体（如T载体），载体含有LacZ的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。
不能使用α-互补鉴定的载体可以使用含相应抗生素的平板鉴定（即直接使用LB/Amp或LB/Kana等，不用加IPTG/X-Gal）。
㈠试剂及材料:1.IPTG溶液(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，200mg/ml): 2g IPTG溶于8ml双蒸去离子水中，用双蒸去离子水调节体积至10ml，0.22um滤器过滤除菌，分装1ml/管，-20℃保存。
2.X-Gal(5-溴-4氯-3吲哚-β-D-半乳糖苷):已购入，铝箔纸包裹避光，-20℃保存。
3.LB液体培养基（无抗生素）。
4.含有ampicillin/IPTG/X-Gal的LB培养板（LB/Amp/IPTG/X-Gal）: 在含有ampicillin的LB培养板表面加入4µl 200mg/ml IPTG和16µl 50mg/ml X-Gal，用无菌玻璃涂布器均匀涂布平板表面，37℃×30min可完全吸收，即可使用。
（注意：4µl 200mg/ml IPTG 加上16µl 50mg/ml X-Gal不足以涂布整个平板表面，可同时加入含与平板相同抗生素的LB液体培养基100µl左右。
）5.感受态细胞。
6.42℃水浴。
7.冰浴。
㈡操作流程:1.准备LB/Amp/IPTG/X-Gal平板或者其它筛选用平板，使用前将平板预热至室温。
2.从-80℃中取出冰冻的感受态细胞(如JM109)，臵冰浴中约5min至刚刚融化。
轻轻晃动使细胞混匀，仍臵冰浴中。
3.离心连接反应管，吸取5~20µl连接体系至臵于冰上的感受态细胞中。
4.轻轻晃动使其混匀，臵冰上30min。
实验11、重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞
实验十一、重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞【实验目的】掌握质粒转化大肠杆菌的方法。
【实验原理】大肠杆菌感受态细胞中加入质粒，则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面，经过42℃短暂的热激处理后，DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞，在不含抗生素的培养基中短暂培养，使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达，在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌（含质粒）与未转化细菌分开，转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落，而未转化的细菌则不能。
【器材与试剂】1．实验仪器培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22μm滤膜），酒精灯2．实验试剂氯化钠（AR），无水氯化钙（AR），蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，800 mL 蒸馏水溶解后，用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min；LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121℃高压灭菌20min，分别倒入无菌培养皿。
若配制选择性培养基，当温度降至60℃左右时，加入1 mL氨苄青霉素溶液（100mg/mL），混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯化钙11.1 g，用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min，4℃保存；氨苄青霉素钠溶液：准确称取氨苄青霉素钠0.5 g，用蒸馏水溶解并定容至5 mL，用微孔滤器过滤除菌后，分装于Eppendorf管中，-20℃保存。
3.实验材料E.coli DH5α，pUC18质粒【实验步骤】1、取制备好的存放于超低温冰箱的大肠杆菌DH5α感受态细胞，放置于冰上静止5~10min 待其完全溶解。
将重组质粒导入大肠杆菌的方法
将重组质粒导入大肠杆菌的方法
将重组质粒导入大肠杆菌有多种方法，其中包括化学转化、电转化和共转化等。
1. 化学转化：通过将重组质粒与大肠杆菌细胞一起暴露在一种化学溶液中，使细胞发生渗透增强，从而使质粒能够进入细胞。
常用的化学转化方法有钙离子诱导法、聚乙二醇法等。
2. 电转化：通过利用强电场作用，使质粒能够通过细胞膜进入细胞。
将含有重组质粒的细胞与电极片一起置于电场中，施加脉冲电压，使细胞膜发生破裂，从而实现质粒的导入。
3. 共转化：将含有重组质粒的细胞与另一种质粒（例如载带质粒）一起转化，使质粒通过共转化机制进入细胞。
在共转化过程中，载带质粒的存在可以提高重组质粒的转化效率。
以上是常用的将重组质粒导入大肠杆菌的几种方法，具体使用哪种方法取决于实验需求和条件。
感受态细胞的制备及重组质粒的转化
experiments of molecular biology
重组DNA技术
分：分离外源基因 目的基因。
切、接：利用酶学 方法，将外源基因 与载体连接，形成 复制子。
转：转化宿主细胞， 使复制子可以扩增 复制。
筛：筛选含有目的 基因的细胞(转化子) 并扩增以获得目的 基因克隆。
宿主细菌 含Amp培养基
实验仪器、材料
1 ．超净工作台 2 ．高速离心机 3 ．恒温摇床 4 ．恒温培养箱 5 ．恒温水浴锅 6 ．制冰机 7 ．移液枪
实验材料、试剂
1．大肠杆菌JM109菌株 2．重组质粒 3．1.5mL 离心管，Tip头 4．试管、培养皿
1． LB液体培养基 2．含有Amp的LB平板培养基（终浓度为50µ g／mL） 3．氨苄青霉素贮存液（浓度50mg／mL） 4．0.1mol/L CaCl2溶液
3、4000rpm离心10min，弃上清； 4、每管加入50μL冰预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮细菌，冰上放置，
即为感受态细胞。
三、质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化
1、实验管加5μL重组质粒DNA，对照管加5μL灭菌水，轻轻 混匀，置冰浴20min；
2、42℃水浴热应激90s（精确计时），迅速放回冰浴，冷却 5min后加入1mL LB液体培养基（不含Amp），37℃ 250rpm振荡培养约1h；
转化（transformation）
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞 获得新的遗传性状的一种手段。
转化是微生物遗 传、分子遗传、基因 工程等研究的基本实 验技术。
转化的方法
化学的方法(CaCl2法、热休克法)：使用化学试 剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热休克 处理将载体DNA分子导入受体细胞。
重组质粒的转化.ppt
提高转化效率的方法
• 感受态质量 • 质粒DNA的相对分子质量和浓度 • 防止杂菌和杂DNA污染
重组子的筛选
• 转化后的细胞在筛选培养基中培养，可筛选出转化子
蓝白斑筛选
• 蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。野生 型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal 切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可 以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛 选的最直观有效的方法。
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花粉管通道
花粉管通道法是指在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液，利 用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵 细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而 成为带转基因的新个体。
重组质粒的转化
• 外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，重组的 DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存 在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体 分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态 细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通 过各种方法筛选出重组子，并可通过酶切电泳进行重组子 的鉴定。
操作步骤
• 取100µl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面 的操作)，加入10 µl重组质粒DNA(体积不超过10µl)+ 100µl感受态 细胞
• 将以上样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保温1－ 2min，然后迅速冰上冷却2min
• 立即向上述管中分别加入 LB液体培养基（不需在冰上操作），摇匀 后于37℃振荡培养约45-60min ，使受体菌恢复正常生长状态，并使 转化体表达抗生素基因产物。
重组质粒的构建与转化2
姓名系年级10级生命基地组别JD-4 同组者科目分子生物学实验题目重组质粒的酶切与P C R验证学号实验目的1.掌握通过酶切与PCR扩增鉴定重组DNA分子的基本方法。
2.学习和掌握PCR扩增的基本原理和实验技术。
实验原理1.酶切法鉴定重组DNA重组质粒是外源基因通过单酶切（或双酶切）与用相同的（或两种）限制性核酸内切酶切割的质粒载体连接后获得的，因此在连接处仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列，用该酶（或两种酶）再次切割重组质粒，能把插入片段切离载体，根据琼脂糖凝胶电泳检测可见有载体片段和插入的外源DNA片段，并可知插入片段的大小。
2.PCR扩增法鉴定重组质粒PCR反应可以用来鉴定载体上是否重组了外源DNA片段，并可估测外源插入片段的大小，。
根据载体多克隆位点上下游基因的序列设计一对PCR引物，两引物之间的距离即是空载体PCR 扩增的大小，如果在多克隆位点内插入外源DNA片段，就会改变PCR扩增产物的大小，扩增产物的大小减去两引物之间的距离即是插入片段的长度，也可以直接基于外源DNA两端的序列设计一对引物，分分别以空载体和重组质粒为模板进行PCR反应，只有重组质粒能扩增出一定大小的产物，则该产物的大小即是插入片段的大小。
3.PCR扩增原理具有模板DNA，寡核苷酸引物，Mg2+，4种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）、DNA聚合酶和缓冲液所有组分的PCR反应体系中，在模板变性，引物退火后，模拟体内半保留复制过程——即在DNA聚合酶的作用下，以变性单链为模板，依据碱基互补配对原理，在引物的3’端加入合适的核苷酸分子，不断延伸直至完成新DNA的合成。
新合成的DNA分子也可以作为模板，参与后续的扩增反应，使目的分子呈指数增长。
因此，变性、退火和延伸循环反复25~30次姓名系年级10级生命基地组别JD-4 同组者科目分子生物学实验题目重组质粒的酶切与P C R验证学号后，即可以从少量的模板DNA中扩增出大量的目的产物。
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定实验目的：1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
3.学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
4.掌握利用Cacl2感受态细胞的方法。
5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6.掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。
并鉴定体外导入目的DNA片段的大小。
7.学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。
实验原理：外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。
重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。
将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的鉴定。
1.重组子的构建酶切时首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源工体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
单酶切法简单易行单是后期筛选工作比较复杂。
重组质粒的转化实验报告
重组质粒的转化实验报告
一、实验目的
本实验旨在构建重组质粒，以提高转录和表达的效率。
二、实验原理
重组质粒技术是一种细胞分子遗传学技术，它可以将一种特定的DNA片段插入另一种特定的质粒中，以改变质粒的表达模式。
它的基本原理是利用酶切，将特定的DNA片段插入质粒中，然后将其复制到另一个质粒中，从而改变质粒的表达模式。
三、实验步骤
1. 提取质粒：首先，使用适当的抗性菌株（如E.coli）提取质
粒DNA，使用特定的质粒提取试剂提取质粒DNA；
2. 克隆DNA片段：使用PCR技术，将要插入质粒中的DNA
片段克隆到另一个质粒中；
3. 制备重组质粒：将克隆的DNA片段插入质粒中，使用特定
的酶切试剂，完成重组质粒的制备；
4. 测序：使用测序仪，测试重组质粒的序列，以确保重组质粒的正确性。
四、实验结果
1. 质粒提取：成功提取质粒，提取的质粒DNA纯度达到99%以上；
2. 克隆DNA片段：成功克隆目标DNA片段，PCR扩增结果与理想结果一致；
3. 重组质粒制备：重组质粒制备成功，酶切结果与理想结果一致；
4. 测序：重组质粒的序列与理想序列一致，证明重组质粒制备成功。
五、结论
本次实验成功地构建了重组质粒，从。
(整理)感受态细胞的制备和重组质粒的转化
1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。
2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
【实验原理】质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象，一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生了遗传性状的改变，这种现象叫做转化，获得了外源DNA 的细胞称为转化子。
在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。
质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因,使我们能够进行进一步的DNA操作，如亚克隆等；或者获得其表达产物。
转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。
细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞（competent cell）。
有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态,如本实验所用的大肠杆菌。
用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。
对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。
这种转化方法称为“化学法”。
目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。
电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1 x 108转化子/μg DNA，甚至1 x 109转化子/μg DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。
微生物转化是基因工程的常用技术，大肠杆菌是基因工程中最常用的受体菌，本实验即是用前面实验获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。
【试剂与器材】〈一〉试剂1．LB液体培养基: 参见附录每组配200mL, 其中100mL分装于500mL三角瓶中，另各取3mL装于2只大试管中，其余装于装于500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
实验8重组质粒的转化及筛选
实验8重组质粒的转化及筛选实验⼋、重组质粒的转化及筛选转化（transformation）：是将异源DNA分⼦引⼊受体细胞，使其获得新的遗传性状的⼀种技术⽅法。
进⼊细胞的DNA分⼦通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
热激转化将⼤肠杆菌感受态细胞与待转化的DNA样品⼩⼼混合均匀，置于冰上约10min，使DNA充分粘附于细胞表⾯，经42℃短时间热激处理，促进细胞吸收DNA样品。
将已转化处理的细胞置于⽆选择压⼒的培养基中保温⼀段时间，然后涂布于有选择压⼒的平板培养基上，获得重组⼦。
实验材料DNA材料：连接产物、质粒pQE30-EGFP；感受态细胞：⼤肠杆菌DH5α；培养基：LB抗⽣素：AMP（氨苄青霉素），在培养基冷却到60℃以下添加，添加量为1/1000。
已灭菌的EP管操作步骤1.从冰箱取出的感受态细胞放置冰上融化，分别取100µl转移到2⽀已灭菌的1.5ml离⼼管中，分别加⼊质粒1µl、连接产物10µl，温和混匀，冰上放置5~10min；2.热激处理：将EP管置于42℃恒温⽔浴锅中，保温90秒，不要摇动，然后迅速转移到碎冰块中，冷却1~2分钟。
3.往EP管中加⼊500µl新鲜LB培养液（37℃预热），37℃，培养30min~60min（注：转纯质粒可省略，转连接产物需进⾏）。
4.取100~150µL细胞（可离⼼，重悬）涂布于含有抗⽣素的LB平板上，室温放置3~5分钟。
5.37℃培养12~16h（过夜）；然后把培养箱温度调⾄30℃培养3~4h，观看EGFP基因表达情况。
转化实验流程感受态细菌100µl 质粒1 µl冰浴中10′混匀420C⽔浴90′冰浴1-2 ′加⼊500 l LB370C培养30′涂板培养过夜勿动热激＋⽤CaCl法制备的感受态细胞，可使每微克超2螺旋质粒DNA产⽣5 106-2 107个转化菌落。
实验报告构建重组质粒(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习DNA体外重组技术的原理和方法。
2. 掌握重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定技术。
3. 熟悉实验操作步骤和注意事项。
二、实验原理DNA体外重组技术是指将外源DNA片段与载体DNA片段在体外进行连接，形成重组DNA分子的技术。
通过该技术，可以将外源基因导入宿主细胞，实现基因表达和功能研究。
三、实验材料1. 载体：pUC19质粒2. 目的基因：基因片段3. 限制性核酸内切酶：EcoRI、BamHI4. DNA连接酶：T4 DNA连接酶5. DNA聚合酶：Klenow片段6. 琼脂糖凝胶电泳试剂7. DNA标记物8. 转化试剂：CaCl2、SDS、乙醇9. 受体细胞：大肠杆菌DH5α四、实验步骤1. 目的基因的扩增（1）设计引物：根据目的基因序列设计一对引物，引物长度一般为20-25bp，5'端添加EcoRI和BamHI酶切位点。
（2）PCR扩增：以基因片段为模板，引物为引物，进行PCR扩增。
2. 载体的酶切（1）将pUC19质粒和PCR扩增的目的基因分别用EcoRI和BamHI进行酶切。
（2）回收酶切片段：琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，回收目的片段。
3. DNA连接（1）将回收的目的基因片段和载体片段混合，加入DNA连接酶，进行连接反应。
（2）将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。
4. 转化后细胞的培养与筛选（1）将转化后的细胞在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜。
（2）取适量菌液进行PCR检测，筛选出阳性克隆。
5. 阳性克隆的鉴定（1）提取阳性克隆的质粒DNA。
（2）用EcoRI和BamHI进行酶切，琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段。
（3）将酶切片段与标记物进行对比，验证重组质粒的正确性。
五、实验结果与分析1. PCR扩增结果：在PCR产物中，可见一条与预期片段大小相符的条带。
2. 酶切结果：在琼脂糖凝胶电泳中，可见目的基因片段和载体片段的酶切片段。
3. 阳性克隆的鉴定：在琼脂糖凝胶电泳中，可见与预期片段大小相符的条带，证明重组质粒构建成功。
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实验五重组质粒的转化
【实验目的】
通过本实验，掌握重组质粒的转化方法和原理。
【实验原理】
经CaCl2法制备的感受态细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
本实验采用大肠杆菌 DH5α菌株感受态细胞，与以上实验所得重组连接的质粒载体共保温实现转化。
【实验步骤】
1. 取100 μL 新鲜配制的感受态细胞，加入实验四所得重组质粒DNA10 μL (50 ng）轻轻混匀，冰上静置30 min。
2. 超净台上操作：在预制的含有氨苄青霉素（50μg／mL ）的LB 琼脂平板上，加40μL 20 mg/mL的X-gal 和16μL50 mg/mL的IPTG 溶液，并用之前已灭菌的涂布器均匀涂布于LB培养基表面，37℃温箱中放置30 min （正放）。
3. 将第一步静置后装有感受态细胞的1.5 mL EP管放到42 ℃水浴锅中，热激90sec （必须准确）。
4. 从水浴锅中取出EP管，立即冰浴2 min 。
5. 超净台上操作：每管加500μL 室温LB液体培养基（轻轻混匀），37 ℃温育45 min ，130rpm 慢摇。
6. 超净台上操作：将第4步的产物取出，3500rpm，离心2min。
弃约500 μL上清（用枪吸），将剩余菌液轻轻吹打混匀涂在含有氨苄青霉素（50μg／mL ）的LB平板上，晾至液体被吸收。
7. 倒置平皿37 ℃培养12-16h ，出现菌落。
培养皿上的会长出蓝色和白色菌落，其中白色菌落为含有重组DNA 质粒的菌落
【结果与分析】
经培养后，转化培养皿上生长着很多白色菌落和蓝色菌落，白色菌落为含有DNA 重组质粒。
阴性对照没有菌落，阳性对照长有大量白色菌落。
经过蓝白斑筛选后，正对照长出的菌落较多全部为白斑，有的地方连成一片，可能是由于涂板时没有涂均匀。
试验中做的LB平板蓝白斑间隔分布，蓝斑体积较小。
所有转化平板都长有蓝斑，说明我们的X-gal涂布比较均匀。
做本次实验需要在超净工作台操作的部分一定要严格按照要求，要把台子、手、
枪用75%的酒精消毒。
在凃平板时一定要要涂布器凃的均匀，并且注意涂布器一定要晾凉以后再涂布。