重组质粒的转化

实验五重组质粒的转化

【实验目的】

通过本实验，掌握重组质粒的转化方法和原理。

【实验原理】

经CaCl2法制备的感受态细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

本实验采用大肠杆菌 DH5α菌株感受态细胞，与以上实验所得重组连接的质粒载体共保温实现转化。。

【实验步骤】

1. 取100 μL 新鲜配制的感受态细胞，加入实验四所得重组质粒DNA10 μL (50 ng）轻轻混匀，冰上静置30 min。

2. 超净台上操作：在预制的含有氨苄青霉素（50μg／mL ）的LB 琼脂平板上，加40μL 20 mg/mL的X-gal 和16μL50 mg/mL的IPTG 溶液，并用之前已灭菌的涂布器均匀涂布于LB培养基表面，37℃温箱中放置30 min （正放）。

3. 将第一步静置后装有感受态细胞的1.5 mL EP管放到42 ℃水浴锅中，热激90sec （必须准确）。

4. 从水浴锅中取出EP管，立即冰浴2 min 。

5. 超净台上操作：每管加500μL 室温LB液体培养基（轻轻混匀），37 ℃温育45 min ，130rpm 慢摇。

6. 超净台上操作：将第4步的产物取出，3500rpm，离心2min。弃约500 μL上清（用枪吸），将剩余菌液轻轻吹打混匀涂在含有氨苄青霉素（50μg／mL ）的LB平板上，晾至液体被吸收。

7. 倒置平皿37 ℃培养12-16h ，出现菌落。培养皿上的会长出蓝色和白色菌落，其中白色菌落为含有重组DNA 质粒的菌落

【结果与分析】

经培养后，转化培养皿上生长着很多白色菌落和蓝色菌落，白色菌落为含有DNA 重组质粒。阴性对照没有菌落，阳性对照长有大量白色菌落。经过蓝白斑筛选后，正对照长出的菌落较多全部为白斑，有的地方连成一片，可能是由于涂板时没有涂均匀。试验中做的LB平板蓝白斑间隔分布，蓝斑体积较小。所有转化平板都长有蓝斑，说明我们的X-gal涂布比较均匀。做本次实验需要在超净工作台操作的部分一定要严格按照要求，要把台子、手、

枪用75%的酒精消毒。在凃平板时一定要要涂布器凃的均匀，并且注意涂布器一定要晾凉以后再涂布。