总黄酮测定
总黄酮含量测定
1 总黄酮含量测定1．1 紫外可见分光光度法严赞开［1］综述了紫外分光光度法测定植物中黄酮含量的方法．重点介绍了单波长法、差示法、双波长法、三波长法、导数法等紫外分光光度法测定黄酮类化合物含量的原理及分析特性。
1．1．1 紫外可见分光光度法: 是以分子吸收光谱为基础的紫外－可见分光光度法，利用某些物质的分子在峰带I( 300 ～400 nm) 和峰带Ⅱ( 220 ～280 nm) 光谱区的吸光度来进行分析测定的方法。
具有简便、适用性广、准确度、精密度和重现性较好等特点，在总黄酮含量分析中发挥着重要作用。
1．1．2 比色法: 是一些药典最常用的总黄酮含量检测方法，它主要以Al( NO3 ) 3 为显色剂，在碱性条件下，利用其与总黄酮形成红色螯合物为特征。
常用于总黄酮类化合物含量测定的金属盐试剂有Al( NO3 ) 3、AlCl3 等。
1．1．3 差示分光光度法简称ΔA 法: 使用稍高于样品或稍低于样品的标准作参比，测量样品和参比间的相对吸光度。
而此相对吸光度又与样品和参比间的浓度差成比例关系，借差示工作曲线而求出样品的含量。
1．1．4 双波长和导数分光光度法: 用于测定吸收光谱曲线重达的混合物的含量而不须用解联立方程，还可分析高浓度及混浊样品，其灵敏度和准确度比普通分光光度法好。
在选择波长时，原则上除了要干扰物有相等吸光度外，还要求两波长比较接近，被测组分在该两波长处的摩尔吸收系数相差大些，这样方法的灵敏度会更高。
如果将上述双波长分光光度计上两个波长尽可能指近，使只相差1 ～2 nm，并且同时进行扫瞄，能得到试样一阶导数吸收光谱-吸光度对波长的变化率曲线，即导数分光光度法。
2 药理作用2．1 镇痛作用赵铁华等［4］研究结果显示灌胃、腹腔注射、皮下注射适宜剂量的黄芩茎叶总黄酮，对实验动物经化学和热刺激导致的疼痛反应皆有一定的抑制作用，其镇痛作用机制与中枢作用相关。
银杏总黄酮( TFG) 腹腔内注射可显著抑制甲醛致小鼠疼痛反应，延长小鼠舔足潜伏期并减少小鼠扭体反应数。
总黄酮含量测定-比色法
总黄酮（Flavonoid）含量(铝盐显色法酶标仪96样)（一）检测原理：总黄酮，即黄酮类化合物，包括黄酮，黄酮醇，黄烷酮，橙酮，异黄酮，黄烷醇，花青素等，是植物重要的一类次生代谢产物，具有有较强的抗氧化活性，可捕捉活性氧自由基，降低氧化伤害，在果实中影响其色泽和风味；对植物的抗逆性（比如抗紫外）和抗病虫害方面有重要作用。
实验采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法测定黄酮总含量，即在碱性亚硝酸盐溶液中，黄酮类化合物与铝离子形成在510nm处有特征吸收峰的红色络合物，测定反应产物在510nm处的吸光值，即可计算样品中总黄酮含量。
（二）试剂组分与配制：试剂名称规格保存要求备注试剂一液体1.6m L×1支4℃保存试剂二液体3m L×1瓶4℃保存试剂三液体12m L×1瓶4℃保存标准品粉剂mg×1支4℃保存做标曲，则用到该试剂（三）所需的仪器和用品：酶标仪、96孔板、粉碎仪、筛子、60%乙醇、离心机、蒸馏水。
（四）总黄酮测定：建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！1、样本制备：①组织样本：称取约0.1g新鲜样本(若水分充足，可增加样本取样质量)；或者称取约0.03g烘干样本（将样本在105℃下杀青3min，然后60℃烘干至恒重，粉碎，过40-60目筛，得到烘干样本），加入1.5mL的60%乙醇（若鲜样需研磨均质），60℃振荡提取2h（若蒸发用60%乙醇定容至1.5mL），25℃×12000rpm，离心10min，取上清待测。
【注】：若样本量较少，可同比例缩减样本量，如取0.02g干样，加入1mL60%乙醇，60℃振荡提取2h。
25℃×12000rpm，离心10min，取上清，用60%乙醇定容至1mL待测。
②液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：①酶标仪预热30min，调节波长至510nm。
总黄酮测定含量
1 各批次药材含量测定使用已经确定的总黄酮含量检测方法分别进行5个批次原料含量的测定总黄酮含量测定：分别精密称取药材粗粉0.5g，置100ml锥形瓶中，加70%乙醇50ml，称定重量，超声60分钟，放冷，称定，加入70%乙醇补足减失重量，摇匀，过滤，弃去粗滤液，精密量取续滤液10.0ml上聚酰胺树脂，待充分吸附后，用乙醇进行洗脱，至流出液基本无色，以洗脱液定容至25ml量瓶中，备用。
精密量取供试品溶液5ml，置10ml比色管中，加 5％亚硝酸钠溶液0.4ml，使混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液0.4ml，摇匀，放置6 分钟，加2mol/L氢氧化钠溶液3ml，再加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15分钟，照分光光度法（《中国药典》2010版一部附录Ⅴ B），在504nm 的波长处测定吸收度。
表1 不同批次药材总黄酮含量测定结果批号含量（%）1 2 3 X±S20140516 0.16350.16480.17010.1661±0.003520140516紫外扫描色谱图2 药材总黄酮转移率研究2.1 单个药材转移率研究2.1.1 单个药材的转移率测定同一批次的各药材，分别按照产品生产工艺提取得单个药材的总黄酮浓缩液样品，进行总黄酮含量检测，与“1”项下同批药材的总黄酮含量相比得出单个药材的转移率（如下式），分别进行5批次药材测定。
黄芪、桑叶、黄精、山茱萸：分别取黄芪、桑叶、黄精、山茱萸各100g，加水煎煮两次（回流），第一次加水12倍量，煎煮2.0h，过滤；第二次加水10倍量，煎煮1.0h，过滤，合并滤液浓缩至100ml，备用。
黄芪不同浓缩程度的考查：取黄芪100g，加水煎煮两次（回流），第一次加水20倍量，煎煮2.5h，过滤；第二次加水20倍量，煎煮2.0h，过滤，合并滤液，重复试验三次，分别浓缩至50ml、100ml、200ml，备用。
精密量取上述溶液5ml，加乙醇15ml，摇匀，过滤，弃去粗滤液，精密量取续滤液10.0ml上聚酰胺树脂，待充分吸附后，用乙醇进行洗脱，至流出液基本无色，以洗脱液定容至25ml量瓶中，备用。
总黄酮含量测定标准曲线
总黄酮含量测定标准曲线总黄酮含量是衡量植物中抗氧化活性的重要指标，也是评价植物药材质量的重要参数之一。
因此，建立准确可靠的总黄酮含量测定标准曲线对于保证植物药材质量的稳定性和可靠性具有重要意义。
本文将介绍总黄酮含量测定标准曲线的建立方法及相关注意事项。
首先，建立总黄酮含量测定标准曲线需要准备一定浓度范围内的标准溶液。
通常可以选择相对纯净的总黄酮标准品，按照一定的比例配制成不同浓度的标准溶液。
在配制标准溶液的过程中，需要注意溶解度、稳定性等因素，以确保标准溶液的准确性和可靠性。
其次，建立总黄酮含量测定标准曲线需要选择合适的测定方法。
常用的方法包括分光光度法、高效液相色谱法等。
在选择测定方法时，需要考虑样品的特性、仪器设备的可用性、实验操作的便捷性等因素，以确保测定结果的准确性和可靠性。
在进行总黄酮含量测定标准曲线的建立过程中，需要注意以下几点：1. 标准曲线的线性范围，需要选择合适的标准溶液浓度范围，确保在该范围内标准曲线呈现良好的线性关系。
2. 标准曲线的斜率和截距，通过线性回归分析，计算标准曲线的斜率和截距，以确定总黄酮含量与测定数值之间的关系。
3. 标准曲线的相关系数，通过计算标准曲线的相关系数，评估标准曲线的拟合度，以确保标准曲线的可靠性和准确性。
4. 标准曲线的验证，建立标准曲线后，需要进行验证实验，验证标准曲线的准确性和可靠性，以确保标准曲线的适用性和稳定性。
总之，建立总黄酮含量测定标准曲线是保证植物药材质量稳定性和可靠性的重要步骤。
在建立标准曲线的过程中，需要选择合适的标准溶液、测定方法，注意标准曲线的线性范围、斜率和截距、相关系数等参数，以确保标准曲线的准确性和可靠性。
建立准确可靠的总黄酮含量测定标准曲线，对于推动植物药材质量控制和质量评价具有重要意义。
总黄酮的含量测定方法
总黄酮的含量测定方法
总黄酮的含量测定方法主要包括以下几种：
1. 酸性条件下的比色法：将样品与酸反应生成有色化合物，测定其吸光度。
如盐酸或硫酸与总黄酮反应生成有色化合物，可通过紫外可见光谱测定吸光度，进而计算总黄酮的含量。
2. 高效液相色谱法(HPLC)：使用高效液相色谱仪进行分离和测定。
通过采用特定的色谱柱和流动相，分离出总黄酮，并通过检测器测定其峰面积或峰高值，并与已知标准品进行比较，计算样品中总黄酮的含量。
3. 薄层色谱法：将总黄酮的样品与色谱载体共同涂布在薄层板上，通过色谱柱法进行有效分离。
然后，利用染色剂，如硼酸或铝酸盐等，在紫外或可见光下观察或测定样品斑点的强度，从而计算总黄酮的含量。
4. 毛细管电泳法：通过毛细管电泳仪将总黄酮进行分离，并通过测定峰面积或峰高值，配合已知标准曲线，计算总黄酮的含量。
需要注意的是，不同样品中总黄酮的化学结构和含量可能存在差异，因此在选择测定方法时应根据具体的样品特性和仪器设备的可用性做出选择。
总黄酮测定方法
总黄酮测定（紫外分光光度法，以柚皮苷计）[26]
1）标准曲线
精密称取柚皮苷对照品10mg ，以无水乙醇溶解并定容至50mL ，得0.2mg/mL 柚皮苷溶液。
分别取此浓度0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL ，以无水乙醇定容至5mL ，在284nm 处测定吸光度。
从图1-2中，得回归方程：A=0.0067c-0.0033，R 2=0.9993（n=3）。
式中：c —测定用样品液中的总黄酮含量，μg
A —吸光度
图1-2 总黄酮标准曲线
Fig.1-2 The calibrate curve of flavonoids
2） 样品中总黄酮含量的测定
准确称取试样，以乙醇溶解定容，按标准曲线方法测定[26]。
样品中总黄酮提取率计算公式为：
10010
V m K V c %)P(621⨯⨯⨯⨯⨯= 式中：p: 样品中总黄酮提取率，%;
c ：从标准回归曲线中计算得到的样液的总黄酮含量，μg;
V 1：样品提取液总体积，mL ；
V 2: 测定用体积，mL ；
K ：稀释倍数;
m: 样品的投料量，g。
紫外可见分光光度法测定总黄酮含量的方法学考察要点
紫外可见分光光度法测定总黄酮含量的方法学考察要点一、本文概述紫外可见分光光度法是一种基于物质对紫外和可见光的吸收特性进行定量分析的方法。
在生物化学和药物分析中，这种方法被广泛应用于测定各类化合物的含量，其中包括黄酮类化合物。
黄酮类化合物，也称为黄酮或黄碱素，是一类具有广泛生物活性的天然产物，它们广泛存在于植物中，并具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种生物活性。
因此，对黄酮类化合物进行准确、快速的定量分析具有重要意义。
本文旨在探讨紫外可见分光光度法在测定总黄酮含量中的应用，并对其方法学进行考察。
我们将详细介绍紫外可见分光光度法的基本原理、实验操作步骤，以及影响测定结果的各种因素。
我们还将讨论该方法的优点和局限性，以及在实际应用中可能遇到的问题和解决方案。
通过对这些内容的全面探讨，我们希望能够为相关领域的研究人员和技术人员提供有益的参考和指导，推动紫外可见分光光度法在黄酮类化合物分析中的应用和发展。
二、紫外可见分光光度法的基本原理紫外可见分光光度法（UV-Vis spectrophotometry）是一种基于物质对紫外和可见光区域内特定波长光的吸收特性进行定量分析的方法。
该方法基于朗伯-比尔定律（Lambert-Beer Law），即溶液对光的吸收与溶液的浓度成正比，与光通过溶液的路径长度也成正比。
在紫外可见分光光度法中，当一束单色光通过被测溶液时，部分光能会被溶液中的吸光物质吸收，导致光强减弱。
吸光度（A）与吸光物质的浓度（c）和光程长度（l）之间的关系可以表示为 A = εlc，其中ε为摩尔吸光系数，它表示单位浓度、单位光程长度下的吸光度。
对于总黄酮含量的测定，黄酮类化合物在紫外可见光区域内有特定的吸收峰，通过测量这些吸收峰处的吸光度，并结合标准品的工作曲线，可以实现对总黄酮含量的定量分析。
紫外可见分光光度法还具有操作简便、灵敏度高、重现性好等优点，因此在黄酮类化合物含量测定中得到了广泛应用。
需要注意的是，紫外可见分光光度法只能测定那些具有吸光特性的物质，且受到溶液的颜色、浊度以及其它共存物质的影响。
总黄酮含量测定
附录A（标准的附录）总黄酮含量的测定（分光光度比色法）1 试剂所用试剂均为分析纯，水为去离子水或蒸馏水。
1.1无水乙醇；1.2硝酸铝溶液（100g/L)：称取AL(NO3)3•9H2O 17.6g，加水溶解，定容于100mL容量瓶中，摇匀备用。
1.3 醋酸钾溶液（9.8g/L)：称取KCOOH 9.814g，加水溶解，定容于100mL容量瓶中，摇匀备用。
1.4 芦丁标准溶液：1.4.1芦丁对照品储备液（1.0g/L)：精密称取芦丁标准物质50.000mg，置于50mL容量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释定容至50mL。
1.4.2 芦丁对照品工作溶液（0.2g/L)：精密吸取芦丁对照品储备液（1.4.1）10mL,置于50mL容量瓶中，加无水乙醇（1.1）至刻度，摇匀备用。
2 仪器全波长光度计；分析天平（0.000g）；容量瓶等玻璃仪器。
3 分析步骤3.1 标准曲线3.1.1精密吸取芦丁对照品工作液（1.4.2）1mL，2 mL，3mL,4mL，5mL，6mL分别置于50mL容量瓶中。
3.1.2加无水乙醇（1.1）至15mL，然后依次加入硝酸铝溶液（1.2）1.0mL，醋酸钾溶液（1.3）1.0mL，摇匀，加水至刻度，摇匀，静止1hr。
3.1.3 用1cm比色杯于415nm处，以30%乙醇（V/V）溶液为空白，测定吸光度。
3.1.4 以50mL溶液中芦丁质量（mg）为横坐标，吸光度为纵坐标，用线性回归法做标准曲线，（线性范围0.0mg ~1.2mg（以50mL计）。
3.2 空白对照精密吸取待测试样4.0mL，置于50mL容量瓶中，加无水乙醇14mL,加水稀释至刻度，摇匀。
静止1hr，用ø=0.22μ的过滤膜过滤，滤液作为样品的空白对照。
3.3样品测定3.3.1精密吸取待测样液4.0mL，置于50mL容量瓶中，按3.1.2进行操作。
静止1hr，用ø=0.22μ的过滤膜过滤，滤液作为测定液。
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目录
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仪器与试光光度仪，水浴锅，索氏提取器 槐米，芦丁对照品 甲醇，亚硝酸钠溶液，硝酸铝溶液，氢 氧化钠试液，乙醚，试剂均为分析纯
2.溶液的制备
（1）对照品溶液的制备
取芦丁对照品50mg，精密称定，置25ml量瓶中，加 甲醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度， 摇匀。精密量取 10ml ，置100ml 量瓶中，加水至刻度， 摇匀，即得(每1ml中含芦丁0.2mg)
（3）测定法
取本品粗粉约1g，精密称定，置索氏提取器中，加乙醚 适量，加热回流至提取液无色，放冷，弃去乙醚液。再加甲 醇90ml，加热回流至提取液无色，移置100ml量瓶中，用甲 醇少量洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇 匀。精密量取10ml，置100ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀 。精密量取 3ml ，置 25ml 量瓶中，加 5% 亚硝酸钠溶液 1ml ，混匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6 分钟，加氢氧化钠试液 10ml ，再加水至刻度，摇匀，放置 15分钟，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中 芦丁的重量(μ g)，计算，即得。
（2）标准曲线的制备
精密量取对照品溶液 1ml 、 2ml 、 3ml 、 4ml 、 5ml与6ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6.0ml， 加 5% 亚硝酸钠溶液 1ml ，混匀，放置 6 分钟，加 10%硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化 钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟， 以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在 500nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓 度为横坐标，绘制标准曲线。
采用紫外分光光度法测定槐米总黄酮的含量 , 比通过显色反应测定总黄酮含量简便 , 提高了实 验的效率。本法简便、 快速、 选择性好、 线性 范围宽、 重现性好、 能全面反映样品中槐米总 黄酮的含量, 适用于槐米的质量检测和总黄酮测 定, 尤其是生产过程的质量控制。
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