总黄酮的测定方法
总黄酮测定
目录
1 2
仪器与试光光度仪，水浴锅，索氏提取器 槐米，芦丁对照品 甲醇，亚硝酸钠溶液，硝酸铝溶液，氢 氧化钠试液，乙醚，试剂均为分析纯
2.溶液的制备
（1）对照品溶液的制备
取芦丁对照品50mg，精密称定，置25ml量瓶中，加 甲醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度， 摇匀。精密量取 10ml ，置100ml 量瓶中，加水至刻度， 摇匀，即得(每1ml中含芦丁0.2mg)
（3）测定法
取本品粗粉约1g，精密称定，置索氏提取器中，加乙醚 适量，加热回流至提取液无色，放冷，弃去乙醚液。再加甲 醇90ml，加热回流至提取液无色，移置100ml量瓶中，用甲 醇少量洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇 匀。精密量取10ml，置100ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀 。精密量取 3ml ，置 25ml 量瓶中，加 5% 亚硝酸钠溶液 1ml ，混匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6 分钟，加氢氧化钠试液 10ml ，再加水至刻度，摇匀，放置 15分钟，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中 芦丁的重量(μ g)，计算，即得。
（2）标准曲线的制备
精密量取对照品溶液 1ml 、 2ml 、 3ml 、 4ml 、 5ml与6ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6.0ml， 加 5% 亚硝酸钠溶液 1ml ，混匀，放置 6 分钟，加 10%硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化 钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟， 以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在 500nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓 度为横坐标，绘制标准曲线。
采用紫外分光光度法测定槐米总黄酮的含量 , 比通过显色反应测定总黄酮含量简便 , 提高了实 验的效率。本法简便、 快速、 选择性好、 线性 范围宽、 重现性好、 能全面反映样品中槐米总 黄酮的含量, 适用于槐米的质量检测和总黄酮测 定, 尤其是生产过程的质量控制。
保健食品中总黄酮的测定
1 总黄酮的测定（来源于《保健食品检验与评价技术规范》（2003年版））1.1 试剂
1.1.1 聚酰胺粉
1.1.2 芦丁标准溶液：称取5.0mg芦丁，加甲醉溶解并定容至100mL，即得
50μg/mL。
1.1.3 乙醇：分析纯。
1.1.4 甲醇：分析纯。
1.2 分析步驟
1.2.1 试样处理：称取一定量的试祥，加乙醇定容至25mL，摇匀后，超声提取20min，放置.吸取上清液1.0 mL，于蒸发皿中，加lg聚酰胺粉吸附，于水浴上挥去乙醇，然后转入层析柱。
先用20 mL苯洗，苯液弃去，然后用甲醇洗脱黄酮，定容至25mL。
此液于波长360nm测定吸收值。
同时以芦丁为标准品，测定标准曲线，求回归方程，计算试样中总黄酮含量。
1.2.2 芦丁标准曲线：吸取芦丁标准溶液：0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL 比色管中，加甲醇至刻度，摇匀，于波长360nm比色。
求回归方程，计算试样中总黄酮含量。
1.3计算和结果表示：
A × V2 × 100
X = -------------------------
V1 × M ×1000
式中：
X---试样中总黄酮的含量，mg/100g；
A---由标准曲线算得被测液中总黄酮量，μg；
M---试样质量，g；
V1---测定用试样体枳，mL；
V2---试样定容总体枳，mL。
计算结果保留二位有效数字。
总黄酮含量测定-比色法
总黄酮（Flavonoid）含量(铝盐显色法酶标仪96样)（一）检测原理：总黄酮，即黄酮类化合物，包括黄酮，黄酮醇，黄烷酮，橙酮，异黄酮，黄烷醇，花青素等，是植物重要的一类次生代谢产物，具有有较强的抗氧化活性，可捕捉活性氧自由基，降低氧化伤害，在果实中影响其色泽和风味；对植物的抗逆性（比如抗紫外）和抗病虫害方面有重要作用。
实验采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显色法测定黄酮总含量，即在碱性亚硝酸盐溶液中，黄酮类化合物与铝离子形成在510nm处有特征吸收峰的红色络合物，测定反应产物在510nm处的吸光值，即可计算样品中总黄酮含量。
（二）试剂组分与配制：试剂名称规格保存要求备注试剂一液体1.6m L×1支4℃保存试剂二液体3m L×1瓶4℃保存试剂三液体12m L×1瓶4℃保存标准品粉剂mg×1支4℃保存做标曲，则用到该试剂（三）所需的仪器和用品：酶标仪、96孔板、粉碎仪、筛子、60%乙醇、离心机、蒸馏水。
（四）总黄酮测定：建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！1、样本制备：①组织样本：称取约0.1g新鲜样本(若水分充足，可增加样本取样质量)；或者称取约0.03g烘干样本（将样本在105℃下杀青3min，然后60℃烘干至恒重，粉碎，过40-60目筛，得到烘干样本），加入1.5mL的60%乙醇（若鲜样需研磨均质），60℃振荡提取2h（若蒸发用60%乙醇定容至1.5mL），25℃×12000rpm，离心10min，取上清待测。
【注】：若样本量较少，可同比例缩减样本量，如取0.02g干样，加入1mL60%乙醇，60℃振荡提取2h。
25℃×12000rpm，离心10min，取上清，用60%乙醇定容至1mL待测。
②液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：①酶标仪预热30min，调节波长至510nm。
保健食品 总黄酮测定方法
保健食品总黄酮测定方法
保健食品是指具有保健功能的食品，其中总黄酮是一种常见的保健成分。
总黄酮是指一类具有黄酮骨架结构的化合物，包括黄酮类、异黄酮类、花青素类等多种物质。
总黄酮具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种保健作用，因此被广泛应用于保健食品中。
为了保证保健食品中总黄酮的含量符合标准，需要进行总黄酮测定。
总黄酮测定方法主要有两种：分光光度法和高效液相色谱法。
其中，分光光度法是一种简单、快速、经济的测定方法，适用于大批量样品的测定。
该方法的原理是利用总黄酮与铝离子形成络合物，使样品溶液的吸光度增加，从而测定总黄酮的含量。
该方法的操作简单，但对样品的前处理要求较高，需要去除干扰物质，否则会影响测定结果的准确性。
高效液相色谱法是一种准确、灵敏、选择性好的测定方法，适用于复杂样品的测定。
该方法的原理是利用高效液相色谱仪对样品中的总黄酮进行分离和检测。
该方法的优点是测定结果准确可靠，但需要较长的分析时间和较高的仪器成本。
总黄酮测定方法的选择应根据实际情况进行，以保证测定结果的准确性和可靠性。
同时，保健食品生产企业应严格按照国家标准进行总黄酮含量的测定，确保产品质量符合标准，保障消费者的健康。
总黄酮测定含量
1 各批次药材含量测定使用已经确定的总黄酮含量检测方法分别进行5个批次原料含量的测定总黄酮含量测定：分别精密称取药材粗粉0.5g，置100ml锥形瓶中，加70%乙醇50ml，称定重量，超声60分钟，放冷，称定，加入70%乙醇补足减失重量，摇匀，过滤，弃去粗滤液，精密量取续滤液10.0ml上聚酰胺树脂，待充分吸附后，用乙醇进行洗脱，至流出液基本无色，以洗脱液定容至25ml量瓶中，备用。
精密量取供试品溶液5ml，置10ml比色管中，加 5％亚硝酸钠溶液0.4ml，使混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液0.4ml，摇匀，放置6 分钟，加2mol/L氢氧化钠溶液3ml，再加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15分钟，照分光光度法（《中国药典》2010版一部附录Ⅴ B），在504nm 的波长处测定吸收度。
表1 不同批次药材总黄酮含量测定结果批号含量（%）1 2 3 X±S20140516 0.16350.16480.17010.1661±0.003520140516紫外扫描色谱图2 药材总黄酮转移率研究2.1 单个药材转移率研究2.1.1 单个药材的转移率测定同一批次的各药材，分别按照产品生产工艺提取得单个药材的总黄酮浓缩液样品，进行总黄酮含量检测，与“1”项下同批药材的总黄酮含量相比得出单个药材的转移率（如下式），分别进行5批次药材测定。
黄芪、桑叶、黄精、山茱萸：分别取黄芪、桑叶、黄精、山茱萸各100g，加水煎煮两次（回流），第一次加水12倍量，煎煮2.0h，过滤；第二次加水10倍量，煎煮1.0h，过滤，合并滤液浓缩至100ml，备用。
黄芪不同浓缩程度的考查：取黄芪100g，加水煎煮两次（回流），第一次加水20倍量，煎煮2.5h，过滤；第二次加水20倍量，煎煮2.0h，过滤，合并滤液，重复试验三次，分别浓缩至50ml、100ml、200ml，备用。
精密量取上述溶液5ml，加乙醇15ml，摇匀，过滤，弃去粗滤液，精密量取续滤液10.0ml上聚酰胺树脂，待充分吸附后，用乙醇进行洗脱，至流出液基本无色，以洗脱液定容至25ml量瓶中，备用。
总黄酮的含量测定方法
总黄酮的含量测定方法
总黄酮的含量测定方法主要包括以下几种：
1. 酸性条件下的比色法：将样品与酸反应生成有色化合物，测定其吸光度。
如盐酸或硫酸与总黄酮反应生成有色化合物，可通过紫外可见光谱测定吸光度，进而计算总黄酮的含量。
2. 高效液相色谱法(HPLC)：使用高效液相色谱仪进行分离和测定。
通过采用特定的色谱柱和流动相，分离出总黄酮，并通过检测器测定其峰面积或峰高值，并与已知标准品进行比较，计算样品中总黄酮的含量。
3. 薄层色谱法：将总黄酮的样品与色谱载体共同涂布在薄层板上，通过色谱柱法进行有效分离。
然后，利用染色剂，如硼酸或铝酸盐等，在紫外或可见光下观察或测定样品斑点的强度，从而计算总黄酮的含量。
4. 毛细管电泳法：通过毛细管电泳仪将总黄酮进行分离，并通过测定峰面积或峰高值，配合已知标准曲线，计算总黄酮的含量。
需要注意的是，不同样品中总黄酮的化学结构和含量可能存在差异，因此在选择测定方法时应根据具体的样品特性和仪器设备的可用性做出选择。
总黄酮含量测定
1 总黄酮含量测定1．1 紫外可见分光光度法严赞开［1］综述了紫外分光光度法测定植物中黄酮含量的方法．重点介绍了单波长法、差示法、双波长法、三波长法、导数法等紫外分光光度法测定黄酮类化合物含量的原理及分析特性。
1．1．1 紫外可见分光光度法: 是以分子吸收光谱为基础的紫外－可见分光光度法，利用某些物质的分子在峰带I( 300 ～400 nm) 和峰带Ⅱ( 220 ～280 nm) 光谱区的吸光度来进行分析测定的方法。
具有简便、适用性广、准确度、精密度和重现性较好等特点，在总黄酮含量分析中发挥着重要作用。
1．1．2 比色法: 是一些药典最常用的总黄酮含量检测方法，它主要以Al( NO3 ) 3 为显色剂，在碱性条件下，利用其与总黄酮形成红色螯合物为特征。
常用于总黄酮类化合物含量测定的金属盐试剂有Al( NO3 ) 3、AlCl3 等。
1．1．3 差示分光光度法简称ΔA 法: 使用稍高于样品或稍低于样品的标准作参比，测量样品和参比间的相对吸光度。
而此相对吸光度又与样品和参比间的浓度差成比例关系，借差示工作曲线而求出样品的含量。
1．1．4 双波长和导数分光光度法: 用于测定吸收光谱曲线重达的混合物的含量而不须用解联立方程，还可分析高浓度及混浊样品，其灵敏度和准确度比普通分光光度法好。
在选择波长时，原则上除了要干扰物有相等吸光度外，还要求两波长比较接近，被测组分在该两波长处的摩尔吸收系数相差大些，这样方法的灵敏度会更高。
如果将上述双波长分光光度计上两个波长尽可能指近，使只相差1 ～2 nm，并且同时进行扫瞄，能得到试样一阶导数吸收光谱-吸光度对波长的变化率曲线，即导数分光光度法。
2 药理作用2．1 镇痛作用赵铁华等［4］研究结果显示灌胃、腹腔注射、皮下注射适宜剂量的黄芩茎叶总黄酮，对实验动物经化学和热刺激导致的疼痛反应皆有一定的抑制作用，其镇痛作用机制与中枢作用相关。
银杏总黄酮( TFG) 腹腔内注射可显著抑制甲醛致小鼠疼痛反应，延长小鼠舔足潜伏期并减少小鼠扭体反应数。
总黄酮测定方法
总黄酮测定（紫外分光光度法，以柚皮苷计）[26]
1）标准曲线
精密称取柚皮苷对照品10mg ，以无水乙醇溶解并定容至50mL ，得0.2mg/mL 柚皮苷溶液。
分别取此浓度0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL ，以无水乙醇定容至5mL ，在284nm 处测定吸光度。
从图1-2中，得回归方程：A=0.0067c-0.0033，R 2=0.9993（n=3）。
式中：c —测定用样品液中的总黄酮含量，μg
A —吸光度
图1-2 总黄酮标准曲线
Fig.1-2 The calibrate curve of flavonoids
2） 样品中总黄酮含量的测定
准确称取试样，以乙醇溶解定容，按标准曲线方法测定[26]。
样品中总黄酮提取率计算公式为：
10010
V m K V c %)P(621⨯⨯⨯⨯⨯= 式中：p: 样品中总黄酮提取率，%;
c ：从标准回归曲线中计算得到的样液的总黄酮含量，μg;
V 1：样品提取液总体积，mL ；
V 2: 测定用体积，mL ；
K ：稀释倍数;
m: 样品的投料量，g。
总黄酮的测定方法
总黄酮的测定方法黄酮类化合物是广泛存在于植物界的一大类天然产物,种类繁多, 大多数黄酮类化合物与葡萄糖或鼠李糖结合成苷,部分为游离态或与鞣质结合存在。
黄酮化合物系色原烷或色原酮的2-或3-苯基衍生物, 一般具有C6-C3-C6的基本骨架结构。
近年来, 黄酮类化合物以其广谱的药理作用倍受青睐, 人们对含有黄酮的化合物进行大量研究, 以期获得黄酮含量较高的中草药。
因此黄酮的含量测定成为研究的关键步骤。
一、方法（一）高效液相色谱法1. 原理植物类样品用石油醚脱脂后，经甲醇加热回流提取，以高效液相色谱法分离，在紫外检测器360nm条件下，以保留时间定性、峰面积定量。
2．仪器和试剂（1）高效液相色谱仪（2）紫外检测器（3）层析柱（4）超声波清洗仪（5）索氏提取器（6）微孔过滤器（滤膜0.45um）（7）甲醇（色谱纯）（8）芦丁标准品（9）石油醚，盐酸，磷酸（分析纯）。
（10）去离子水（11）芦丁标准溶液：精确称取经105℃干燥恒重的芦丁标谁品15.0mg，加甲醇溶解并定容至100ml，配成150ug／ml的芦丁标准溶液3. 操作步骤（1）样品处理1）固体样品：称取2.0g干燥的固体样品，研细，置于索氏提取器中，用石油醚（60～90℃）提取脂肪等脂溶性成分，弃去石油醚提取液，剩余物挥去石油醚，加人甲醇50ml和25％HC1 5ml，80℃水浴回流水解1h，取出后快速冷却至室温，转移至50ml容量瓶中，甲醇定容，经0.45um滤膜过滤，供分析用。
2）液体样品：准确吸取样品2.0ml，直接以石油醚萃取脱脂，挥去石油醚后，以甲醇溶解并定容，经微孔滤膜（0.45um）滤过后供测定用。
（2）色谱分离条件色谱柱：CLC－ODS，6mm×150mm，5um;流动相：0.3％磷酸水溶液：甲醇（V:V）＝40:80，临用前用超声波脱气；流速：lml／min；柱温：40℃；检测波长：360nm；灵敏度：0.02AUFS；进样量：20ul。
食品中总黄酮的测定
实验九食品中总黄酮的测定（－）目的意义黄酮类化合物（flavonoids）是广泛存在于植物界的一大类多酚化合物，多以苷类形式存在。
其分析方法有多种，对于黄酮类化合物的相互分离以及单一成分的定量分析，常采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）；而对于总黄酮含量的测定，则主要采用分光光度法。
通过本方法的学习，可以掌握食物中总黄酮的测定方法。
（二）高效液相色谱法1. 原理植物类样品用石油醚脱脂后，经甲醇加热回流提取，以高效液相色谱法分离，在紫外检测器360nm条件下，以保留时间定性、峰面积定量。
2．仪器和试剂（1）高效液相色谱仪（2）紫外检测器（3）层析柱（4）超声波清洗仪（5）索氏提取器（6）微孔过滤器（滤膜0.45um）（7）甲醇（色谱纯）（8）芦丁标准品（9）石油醚，盐酸，磷酸（分析纯）。
（10）去离子水（11）芦丁标准溶液：精确称取经105℃干燥恒重的芦丁标谁品15.0mg，加甲醇溶解并定容至100ml，配成150ug／ml的芦丁标准溶液。
3. 操作步骤（1）样品处理1）固体样品：称取2.0g干燥的固体样品，研细，置于索氏提取器中，用石油醚（60～90℃）提取脂肪等脂溶性成分，弃去石油醚提取液，剩余物挥去石油醚，加人甲醇50ml和25％HC1 5ml，80℃水浴回流水解1h，取出后快速冷却至室温，转移至50ml容量瓶中，甲醇定容，经0.45um滤膜过滤，供分析用。
2）液体样品：准确吸取样品2.0ml，直接以石油醚萃取脱脂，挥去石油醚后，以甲醇溶解并定容，经微孔滤膜（0.45um）滤过后供测定用。
（2）色谱分离条件色谱柱：CLC－ODS，6mm×150mm，5um;流动相：0.3％磷酸水溶液：甲醇（V:V）＝40:80，临用前用超声波脱气；流速：lml／min；柱温：40℃；检测波长：360nm；灵敏度：0.02AUFS；进样量：20ul。
总黄酮化学成分测定
总黄酮化学成分测定
《总黄酮化学成分测定》
总黄酮化学成分测定是一项用于分析植物抽提物中总黄酮含量的方法。
总黄酮是一类具有丰富的生物活性的化合物，广泛存在于植物中，具有多种生理活性和药理学特性，如抗氧化、抗肿瘤、抗炎等。
总黄酮包括类黄酮、异黄酮和花色素等多种类别，每个类别都包含了众多的化合物。
因此，为了准确评估总黄酮的含量，需要使用一种更加全面的测定方法，能够同时分析多种不同类型的黄酮成分。
目前，常用的总黄酮化学成分测定方法主要有色谱法、光谱法和化学试剂法等。
其中，色谱法是较为常见和可靠的分析方法之一。
通过高效液相色谱 (HPLC) 技术，可以对植物样品中的黄酮化合物进行分离和定量。
该方法可以根据黄酮成分在特定条件下的保留时间和峰面积，计算出各黄酮成分的含量。
另一种常用的方法是光谱法。
它使用紫外可见分光光度计根据各类黄酮化合物在特定波长下的吸收特性，定量测定其含量。
光谱法具有操作简单、成本低廉的优点，但相对于色谱法来说，对于多种不同类型的黄酮成分的分析能力较弱。
此外，化学试剂法也被广泛应用于总黄酮化学成分测定中。
这种方法利用化学试剂与黄酮成分之间的反应产生颜色或荧光，通过测定颜色或荧光的强度来定量黄酮含量。
化学试剂法具有简单快速的特点，但其准确性和选择性较色谱法和光谱法稍逊。
总的来说，总黄酮化学成分测定是一项重要的分析方法，可以用于评估植物样品中总黄酮的含量。
通过色谱法、光谱法和化学试剂法等方法，我们可以得到不同类型黄酮成分的含量数据，从而更好地了解植物的药理学和生物活性特性。
这为药物开发和植物资源利用提供了科学依据和理论基础。
总黄酮测定
1.总黄酮含量测定（回流）对照品溶液的制备精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品25mg，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加乙醇至刻度，摇匀。
精密量取20ml，置50ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得(每1ml中含无水芦丁0.2mg)。
标准曲线的制备精密量取对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5%亚硝酸钠溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加10%硝酸铝溶液Iml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应试剂为空白，立即照紫外一可见分光光度法，在500nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
测定法取样品细粉约1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流提取至提取液无色，弃去三氯甲烷液，药渣挥去三氯甲烷，加甲醇继续提取至无色（约4小时），提取液蒸干，残渣加稀乙醇溶解，转移至50ml量瓶中，加稀乙醇至刻度，摇匀，作为供试品贮备液。
取供试品贮备液，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
精密量取2ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6ml”起依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的重量，计算，即得。
本品按干燥品计算，含总黄酮以无水芦丁(C27H3006)计，不得少于7.0%。
2.总黄酮含量测定（天南星）对照品溶液的制备取芹菜素对照品适量，精密称定，加60%乙醇制成每1ml含12ug的溶液，即得。
标准曲线的制备精密量取对照品溶液Iml、2ml、3ml、4ml、5ml，分别置10ml量瓶中，各加60%乙醇至5ml，加1%三乙胺溶液至刻度，摇匀，以相应的试剂为空白，照紫外一可见分光光度法，在400nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
测定法取本品粉末（过四号筛）约0.6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60%乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)45分钟，放冷，再称定重量，用60%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。
总黄酮操作规程
总黄酮检验规程1 目的规范检验标准，确保检测结果的准确性。
2 适用范围本标准适用于酒液的总黄酮测定。
3 责任者化验员。
4 内容4.1试剂4.1.1 聚酰胺粉（100目-200目）:过药典筛4号筛，留存在5号筛上的聚酰胺粉4.1.2芦丁标准溶液：称取5.0mg芦丁，加甲醇溶解并定容至100mL，即得50μg/mL。
4.1.3 乙醇（分析纯）4.1.4 甲醇（分析纯）4.1.5 苯（分析纯）4.2 分析步骤4.2.1 试样处理：用蒸发皿称取1g聚酰胺粉，精密加入1～5ml(以酒液的颜色深浅来定)酒液，搅匀后水浴上挥去乙醇，然后用小漏斗转入层析柱（柱内塞上3毫米厚的棉花）。
先用20mL苯洗，流速为2秒1滴，苯液弃去，然后用25mL 甲醇洗脱黄酮，洗脱流速为2秒1滴，然后用甲醇定容至25mL。
此液以甲醇为空白于波长360nm测定吸收值。
同时以芦丁为标准品，测定标准曲线，求回归方程，计算试样中总黄酮含量。
4.2.2 芦丁标准曲线：吸取芦丁标准溶液： 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，于波长360nm处测定吸光度值。
测定标准曲线，求回归方程，计算试样中总黄酮含量。
4.3 计算和结果表示：X ＝ 100010012⨯⨯⨯V V c 式中：X —— 试样中总黄酮的含量，mg/100mL ；c —— 由标准曲线算得被测液中总黄酮浓度，μg/mL ；V 1——测定用试样体积，mL ；V 2——试样定容总体积，mL ；计算结果保留两位有效数字。
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。
5 注意事项5.1 防止聚酰胺粉泄露，实验前在柱子内填充若干脱脂棉，约2mm ，紧贴白色隔膜跺实；5.2 根据仪器精密度要求，样品最后测得的吸光度应在0.3-0.6之间为宜；5.3装填聚酰胺粉后要反复轻击柱壁，务必使粉末填充均匀；5.4 加入苯后，注意排除柱内气泡；5.5 加甲醇时，注意柱内聚酰胺粉不能流空；5.6 收集洗脱液时，甲醇与苯交界处出现明显浑浊现象，从有流出液呈黄色或浅黄色起开始收集，等待洗脱液自然流尽，不再有液体流出后，可用洗耳球于柱顶部开口处加压吹扫柱内，使脱脂棉吸附的少量液体流出；5.7 实验中控制洗脱速度在2秒1滴左右。
总黄酮的提取和测定
总黄酮的提取和测定实验原理黄酮类化合物是植物的重要次生代谢产物，也是一些保健品和中药材的有效成分之一。
黄酮类化合物的定量方法常用的有 HPLC法和分光光度法，在实际生产和科研过程中，对于黄酮单体的定量常采用HPLC法，而对总黄酮的测定，考虑到方法的简便、快捷以及可行性，多采用在碱性介质中加铝盐显色的分光光度法。
在碱性条件下黄酮类化合物与铝盐形成络合物、在500nm波长处有最大吸收峰。
标准品选用芦丁。
试剂和器材一、试剂芦丁标准品。
5％NaNO2；10%A1(NO3)3；5％NaOH；70％乙醇。
二、材料新鲜银杏叶。
三、器材容量瓶10ml（×7），25ml（×1），100ml（×2）；吸管 0.5ml（×2），1ml（×2），2ml（×1），5ml（×1）；分光光度计。
操作方法一、制作标准曲线精密称取芦丁标准品5mg，用70％乙醇溶解，定容于25mL容量瓶中，摇匀，得0．2mg／mL的标准溶液。
精确吸取标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL，分别置于10mL容量瓶中，加入 5％NaNO2 0.4mL，摇匀，放置6min；加入10%A1 (NO3)3 0.4mL，摇匀，放置6min；加入5％NaOH 4.0mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min。
以试剂空白作为参比溶液。
用1cm比色皿，在500nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线。
二、总黄酮的提取把新鲜的银杏叶低温烘干，使水分小于8％，制成干粉。
精确称取干粉1．0g，置于 100mL容量瓶中，加入70％乙醇30mL，浸泡24h。
超声波提取30min，过滤，滤液用70％乙醇定容于100mL容量瓶中，得到黄酮提取液，待用。
三、测定吸取黄酮提取液1.00mL, 置于10mL容量瓶中，加入5％NaNO3 0.4mL，摇匀，放置6min；加入10%A1(NO3)3 0.4mL，摇匀，放置6min；加入5％NaOH 4.0mL，再加水至刻度，摇匀，放置15min。
药典中总黄酮测定方法
药典中总黄酮测定方法
总黄酮是一类具有类黄酮结构和作用的化合物，广泛存在于植物中。
药典中常用的总黄酮测定方法包括以下几种：
1. 显色法：将含总黄酮样品与乙醇-水混合溶液及磷酸钠溶液混合后，加入硼酸试液，产生紫色或蓝色显色反应，通过比色法测定总黄酮含量。
2. 二苯基丙烯酸法：将含总黄酮样品与二苯基丙烯酸溶液混合后，利用紫外可见光谱法测定吸光度，通过标准曲线计算总黄酮含量。
3. 铝试剂法：将含总黄酮样品与铝试剂溶液混合后，加入氢氧化钠溶液，经酸化处理后用紫外可见光谱法测定吸光度，计算总黄酮含量。
4. 比色法：将含总黄酮样品与乙醇-氢氧化钾溶液混合后加入稀硫酸溶液，以黄烷酮为对照品，经比色法测定吸光度，计算总黄酮含量。
以上是比较常用的药典中总黄酮测定方法，选择不同的方法需考虑到样品类型、检测精度等实际问题。
总黄酮含量测定方法
总黄酮含量测定方法
总黄酮含量测定呀，有几种常见方法呢。
紫外- 可见分光光度法。
先得把样品处理好，就像给食材做前期准备一样。
把含有总黄酮的样品进行提取，提取液要纯净呀，不能有太多杂质干扰，杂质多了就像炒菜的时候锅没洗干净，那肯定做不出好菜。
然后在特定波长下测定吸光度，这个波长就像一把专门开总黄酮这把锁的钥匙，得找对喽。
这方法安全性挺高的，只要按照正常操作流程，不会有啥危险情况，稳定性也不错呢，只要仪器正常工作，数据偏差不会太大。
在食品、药品检测领域应用可广泛了，能快速知道产品里总黄酮的大概含量。
我知道一家小型制药厂，想检测新研发的药品里总黄酮含量，就用这个方法，快速得到结果，他们高兴得不得了，就像挖到宝藏一样。
还有高效液相色谱法。
这得把样品制成合适的溶液，溶液就像一支整齐有序的队伍，不能乱哄哄的。
然后注入色谱仪，色谱仪就像一个超级严格的裁判，把不同成分分得清清楚楚。
测定过程中要保证仪器的清洁和稳定，这可不能马虎呀，不然数据就乱套了。
这个方法安全性也还好，就是操作要细心些。
在科研中用得很多，能精确测定总黄酮含量，优势就是精准度高呀。
有个科研团队研究植物中的总黄酮含量，用这个方法得到准确数据，他们兴奋地说这简直是找到了解开谜团的密码。
我觉得这些总黄酮含量测定方法各有各的好，在合适的场景下都能发挥大作用，就像不同的工具在不同的工作里都能大显身手。
比色法测定总黄酮含量-操作流程图-简易图解-李熙灿-Xican Li
比色法测定总黄酮含量：操作流程图2017.11【检测方法与实验流程图】图1实验流程图【溶液配制】1.5%亚硝酸钠溶液配制：称取0.5g亚硝酸钠（NaNO2）固体，加蒸馏水至10mL，即得。
2. 10%硝酸铝溶液配制：称取1g硝酸铝固体，加蒸馏水至9mL，即得。
3. 4% 氢氧化钠溶液配制：称取2g氢氧化钠固体，加蒸馏水至48mL，即得。
4. 芦丁标准液配制：精密称取芦丁10.4 mg置25mL容量瓶中，加80%乙醇溶液溶解、定容。
5. 样品液配制：视样品的溶解性，可选用甲醇、乙醇、95乙醇、水作溶液。
浓度尽量高，但要有精确的数值。
【文献依据】Xican Li, Dongfeng Chen, Ying Mai, Bi Wen, Xiaozhen Wang. Concordance between antioxidant activities in vitro and chemical components of Radix Astragali. Natural Product Research.2012;26:1050-1053.【简介】黄酮包括黄酮、异黄酮、黄酮醇、二氢黄酮醇、双黄酮等，他们大多同时存在于某一种中药及其他植物中。
为了测定这些黄酮的总含量，便建立了总黄酮的检测方法。
其原理是：黄酮中的处于相邻羰基、羟基可以共同络合金属而显色。
根据显色之深浅（即吸光度A值之大小），判断的总黄酮含量之高低。
常用的显色剂是亚硝酸钠-硝酸铝，检测波长是508nm。
采用分光光度计，并以某种标准品绘制工作曲线，依该曲线所建立的回归方程，计算其含量。
【标准曲线绘制】（芦丁）精密量取0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 芦丁标准液，代替上图中的 “样品液0.5mL ”，依“实验流程图”，测A 508nm值：绘制标准曲线如下：A 508n m Concentration (mg/ml)总黄酮测定的标准曲线（芦丁）y = -0.00339 + 11.92871 x r=0.99926。
实验——总黄酮含量的测定
《有机分析实验讲义》植物中总黄酮的提取与测定黄酮类化合物主要指以2—苯基色原酮为基核的化合物，主要有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、花色素、查尔酮等以及它们的衍生物。
其主要结构式如图。
图黄酮类化合物分子结构式黄酮类化合物主要结构类型见表。
表黄酮类化合物主要结构类型原理黄酮母核中含有碱性氧原子,一般又多带酚羟基，能和铝离子产生黄色络合物,又加入亚硝酸钠和氢氧化钠,使在碱性溶液中呈红色，溶液在510 nm 处有最大吸收，显色反应在60 min 内稳定。
用芦丁作为对照品，用硝酸铝作为黄酮类比色测定的显色剂，吸光度与芦丁的浓度呈线形关系，采用分光光度法对总黄酮进行了含量测定。
仪器与试剂新锐T6型紫外可见分光光度计；Explrer型电子天平（0.1mg）。
60%的乙醇溶液；5%亚硝酸钠溶液；10%硝酸铝溶液。
芦丁标准溶液的配制称量13.2mg 芦丁，用60%乙醇定容到25ml 容量瓶作为标准溶液。
标准曲线的制作准确吸取0， 0.4， 0.8， 1.2， 1.6，2.0 ml 芦丁标准溶液，放入10毫升容量瓶内（写明标记），分别加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0 ml 的60%乙醇溶液；再加入5%亚硝酸钠溶液0.5ml 摇匀，放置6min ；加入10%硝酸铝溶液0.5ml ，放置6min 后；加入4%氢氧化钠溶液4.0ml ，加60%乙醇定容，摇匀后，放置15min ；（扫描找到最大吸收）在510nm 处测定吸光度。
用0.0ml 作为空白，用芦丁含量的浓度作为横坐标，纵坐标作为一定浓度下所对应的吸光度，作标准曲线。
3.6.4 总黄酮提取与测定和计算称取0.6—0.8g 样品粉末，加入60ml60%乙醇放于100ml 圆底烧瓶内，置于水浴锅上，70℃条件下回流提取60min 。
过滤、定容于100ml.吸取样品量（根据样品的吸光度调整）1.0ml ，放入10毫升容量瓶内（写明标记），用60%乙醇加到2.0ml ；加入5%亚硝酸钠溶液0.5ml 摇匀，放置6min ；加入10%硝酸铝，溶液0.5ml ，放置6min 后；加入4%氢氧化钠溶液4.0ml ，摇匀后，加60%乙醇定容，放置15min ；在510nm 处测定吸光度。
总黄酮含量测定方法
总黄酮含量测定方法总黄酮是指一类在植物中广泛存在的天然化合物，具有多种生物活性，包括抗氧化、抗菌、抗炎等作用。
因此，总黄酮含量的测定方法对于评估植物中潜在的药用价值具有重要意义。
以下是一种常用的总黄酮含量测定方法。
一、试剂与设备准备：1. 酸性乙醇溶液：加入浓盐酸（HCl）和乙醇（C2H5OH）（体积比为1:95）。
2. 铝试管。
3. DNA分光光度计或分光光度计。
4. 普鲁士蓝试液。
二、样品处理：1. 将待测样品（如草药材）洗净并晾干。
2. 将样品研磨成细粉末，通过筛网过筛以去除杂质。
3. 取一定质量的样品，加入酸性乙醇溶液中，浸泡4-6小时，以增加黄酮化合物的浸提效果。
4. 使用离心机离心加速提取，收取上清液并保存备用。
三、测定操作：1. 取适量的上清液，放入铝试管中。
2. 加入1 mL的酸性乙醇溶液，并摇匀，待样品溶解。
3. 将铝试管放入水浴中加热，加热温度为80C，保持10分钟。
4. 待样品冷却后，加入3 mL的普鲁士蓝试液，摇匀。
5. 使用DNA分光光度计或普通分光光度计，设置波长为595 nm，测定吸光度值。
四、数据处理与计算：1. 使用酸性乙醇溶液作为空白试剂进行校正。
2. 通过空白试剂的吸光度值，减去样品吸光度值，获得净吸光度值。
3. 根据普鲁士蓝的吸光度与黄酮的浓度之间的线性关系，计算样品中黄酮的含量。
以上就是一种常用的总黄酮含量测定方法，通过酸性乙醇提取样品中的黄酮化合物，并使用普鲁士蓝试液测定吸光度值，可以获得样品中总黄酮的含量。
为了提高测定结果的准确性，可以多次重复实验，并计算平均值。
此外，还可以使用其他方法进行总黄酮的测定，如高效液相色谱（HPLC）法和分光光度法等，根据实际需求选择合适的方法进行测定。
总黄酮含量的测定原理
总黄酮含量的测定原理
总黄酮含量的测定原理是通过化学分析方法，利用黄酮类物质与特定试剂发生化学反应产生显色或荧光物质，并据此测定总黄酮含量的多少。
常用的测定方法包括铝盐显色法、氧化还原法和高效液相色谱法。
其中，铝盐显色法是最常用的一种方法。
铝盐显色法基于黄酮类物质与铝离子（如铝酸盐）形成的稳定络合物可以表现出明显的颜色。
具体操作时，首先将样品提取物与铝试剂混合，在适当的条件下（如合适的温度、酸碱度等），黄酮类物质与铝离子发生络合反应，生成显色物质。
然后，使用分光光度计等仪器测定样品的吸光度或荧光强度，通过与标准曲线比对，计算出样品中总黄酮含量的浓度。
铝盐显色法测定总黄酮含量的原理基于黄酮类物质的结构特点，常规黄酮类物质中含有酚羟基（-OH）和芳香环。
铝离子与酚
羟基结合形成络合物，可以通过吸收特定波长的光线而显色。
反应的稳定性取决于黄酮对铝离子的亲合性，不同黄酮类物质的亲合性不同，因此测定不同种类黄酮的总含量时，可能需要根据不同物质的特性进行修正。
总之，总黄酮含量的测定原理是基于黄酮类物质与铝离子的化学反应，并据此测定样品中总黄酮含量的浓度。
不同的测定方法略有差异，但原理基本相同。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
总黄酮的测定方法
黄酮类化合物是广泛存在于植物界的一大类天然产物,种类繁多, 大多数黄酮类化合物与葡萄糖或鼠李糖结合成苷,部分为游离态或与鞣质结合存在。
黄酮化合物系色原烷或色原酮的2-或3-苯基衍生物, 一般具有C6-C3-C6的基本骨架结构。
近年来, 黄酮类化合物以其广谱的药理作用倍受青睐, 人们对含有黄酮的化合物进行大量研究, 以期获得黄酮含量较高的中草药。
因此黄酮的含量测定成为研究的关键步骤。
一、方法
（一）高效液相色谱法
1. 原理植物类样品用石油醚脱脂后，经甲醇加热回流提取，以高效液相色谱法分离，在紫外检测器360nm条件下，以保留时间定性、峰面积定量。
2．仪器和试剂（1）高效液相色谱仪（2）紫外检测器（3）层析柱（4）超声波清洗仪（5）索氏提取器
（6）微孔过滤器（滤膜0.45um）（7）甲醇（色谱纯）（8）芦丁标准品
（9）石油醚，盐酸，磷酸（分析纯）。
（10）去离子水
（11）芦丁标准溶液：精确称取经105℃干燥恒重的芦丁标谁品15.0mg，加甲醇溶解并定容至100ml，配成150ug／ml的芦丁标准溶液
3. 操作步骤
（1）样品处理
1）固体样品：称取2.0g干燥的固体样品，研细，置于索氏提取器中，用石油醚（60～90℃）提取脂肪等脂溶性成分，弃去石油醚提取液，剩余物挥去石油醚，加人甲醇50ml和25％HC1 5ml，80℃水浴回流水解1h，取出后快速冷却至室温，转移至50ml容量瓶中，甲醇定容，经0.45um滤膜过滤，供分析用。
2）液体样品：准确吸取样品2.0ml，直接以石油醚萃取脱脂，挥去石油醚后，
以甲醇溶解并定容，经微孔滤膜（0.45um）滤过后供测定用。
（2）色谱分离条件
色谱柱：CLC－ODS，6mm×150mm，5um;
流动相：0.3％磷酸水溶液：甲醇（V:V）＝40:80，临用前用超声波脱气；流速：lml／min；柱温：40℃；检测波长：360nm；灵敏度：0.02AUFS；进样量：20ul。
（3）样品测定：准确吸取样品处理液和标准液各10ul，注入高液相色谱仪进行分离，以其标准溶液峰的保留时间定性，以其峰面积计算出样品中总黄酮的含量。
4、结果计算
（二）分光光度法
1．原理黄酮类化合物是具有苯并吡喃环结构的一类天然化合物的总称，一般都具有4位羰基，且呈现黄色。
黄酮类化合物的3—羟基、4—羟基或5—羟基、4－羰基或邻二位酚羟基，与铝盐进行络合反应，在碱性条件下生成红色的络合物。
本方法对样品中黄酮类化合物进行提取纯化后，用分光光度法于510nm波长下测定其吸光度，与芦丁标准品比较，进行待测物中总黄酮的定量测定。
2．仪器和试剂（1）722分光光度计（2）索氏提取器
（3）真空泵，盐基交换管等。
（4）恒温水浴，分液漏斗。
（5）芦丁标准品
（6）亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠（分析纯）。
（7）氯仿，无水乙醇，甲醇（分析纯）。
（8）5％香草醛溶液：称取5g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至100ml。
（9）聚酰胺树脂（10）去离子水。
3．操作步骤（1）样品处理
1）固体样品：称取1～2g干燥的固体样品，用滤纸包紧，置于索氏提取器中，加入50～100ml 70％乙醇溶液浸润后，在80℃水浴下回流3h，至提取液无色为止。
粗提液冷却后，减压抽滤，并用少量25％乙醇溶液洗涤滤渣，合并滤液。
在50℃下减压蒸馏，除去其中的乙醇，直至索氏提取器内溶液呈无醇味。
倒出容器内溶液，用30ml热水分3次洗涤，抽滤后，将滤液倒入分液漏斗中，以75ml 氯仿分3次萃取脱脂，待完全分层后，收集各次下层水溶液并定容至50ml。
称取1～2g经预处理的聚酰胺树脂粉末，湿法装柱，用水饱和。
吸取上述脱脂后的水溶液1～2ml，沿层析柱漫漫滴人柱内，放置一定时间，待测液被充分吸附后，用70％乙醇或甲醇洗脱，流速为1.0ml／min，至流出液基本无色，一般收集10ml即可。
上述洗出液用洗脱剂定容后即可用于测定。
2）液体样品：准确吸取1.0ml样品，定容至50ml后，直接以75ml 氯仿分3次萃取脱脂，其余步骤同上。
（2）标准曲线的绘制：准确吸取芦丁标准溶液0、0.50、1.00、2.00、3.00、⒋00ml（相当于芦丁0、75、150、300、450、600ug），移入10ml刻度比色管中，加入30％乙醇溶液至5ml，各加5％亚硝酸钠溶液0.3ml，振摇后放置5min，加入10％硝酸铝溶液0.3ml摇匀后放置6min，加1.0mol／L氢氧化钠溶液2ml，用30％乙醇定容至刻度。
摇匀，放置15min，于510nm波长处测定吸光度，以零管为空白，以芦丁含量（ug）为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算相关系数（r）。
（3）样品测定：根据样品中总黄酮含量高低，取适宜体积待测液，按标准曲线制备操作步骤于510nm处进行吸光度的测定（样液如有沉淀，应过滤后测定）。
4.结果计算根据标准工作曲线，求出相当于样品吸光度的芦丁含量，按下式求出总黄酮含量
（三）毛细管电泳法
毛细管电泳法是离子或荷电粒子以电场为驱动力, 在毛细管中按其淌度或分配系数不同进行高效、快速的电泳分离新技术。
常用的方法主要有毛细管区带电泳( CZE )、胶束电动力
学毛细管色谱(MEKC) 、毛细管凝胶电泳( CGE) 、毛细管等速电泳( CITP) 等。
它的各种操作模式特别是CZE 和MEKC 都能很好的用于中药成分含量分析。
（四）其他
共振散射光谱法、单扫示波极谱法、近红外漫反射光谱法（对已知总黄酮含量的样品在1100 ~2500 nm 处扫描建立样本数据库, 对预测集样品进行分析, 结
果预测值与H PLC 真值的相关系数( r )为0. 973, 结果准确且提高了检测效率）、流动注射法-化学发光, 电化学法, 免疫化学发光, 这些检测灵敏度高的分析方法也将逐步应用于总黄酮的含量测定。
二、总黄酮的作用
1、对造血系统的保护作用
2、对免疫系统的保护作用
3、清除自由基、抗氧化作用
4、保护DNA
三、为什么测植物中总黄酮的含量多用芦丁做对照品？
1 芦丁有典型的黄酮类结构和紫外特征，在总黄酮家族中是比较典型的代表物质。
2 芦丁在很多含有黄酮类物质的植物中广泛存在，而且含量比较高。
3 芦丁比较容易分离得到纯体，作为对照品比较易得。
四、芦丁标准溶液的配制
称量13.2mg芦丁，用60%乙醇定容到25ml容量瓶作为标准溶液。
备注：如有不恰当的地方，请老师尽管指点。