细菌接种技术
细菌分离培养、接种技术及培养方法-精品医学课件
革兰染色法
Gram staining
临床微生物与免疫学检验教研室
一、实验目的
1.掌握细菌涂片制作方法； 2.掌握革兰染色法和细菌的基本形态； 3.了解革兰染色法的临床意义。
二、革兰染色原理
原理
细胞壁学说 等电点学说 化学学说
革兰阳性菌 细胞壁肽聚糖形成网状 结构，乙醇处理时，脱水 引起网状结构孔径变小， 通透性降低，结晶紫-碘 复合物不易脱去
实验步骤和方法
1)连续划线分离法：①将接种环火焰灭菌，待冷后取标 本少许；②左手持平板，五指固定平皿盖边缘，向外反 转手掌，装有培养基的平板于手掌内用拇指、小指和 无名指固定，并将平板边缘稍微提高呈现30～45度角， 置酒精灯前上方5～6cm；③右手持已取材的接种环， 先在平板一端涂布，然后快速大幅度左右来回以密而 不重的曲线形式作连续划线接种，使整个平板布满曲 线④划线完毕，将平板作好标记，置35℃孵育18-
革兰阴性菌
细胞壁肽聚糖含量低， 脂类物质含量高，乙醇处 理时，脂类物质溶解，细 胞壁的通透性增加，结晶 紫-碘复合物易脱去
三、实验器材和试剂
1.标本 ：金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的培养物。 2.试剂 ：革兰染液。 3.其他 ：载玻片、生理盐水、接种环、酒精灯、显微镜。
四、操作步骤
1. 细菌涂片制备 ⑴涂片：取洁净载玻片一张，按无菌的方法取1~2环生 理盐水于载玻片上，按无菌的方法各取葡萄球菌和大肠埃 菌 培养物少许，在生理盐水中均匀研磨，涂好的菌膜直径 1cm左右。 ⑵干燥：室温下自然干燥或于酒精火焰半尺高处烘干。 ⑶固定：火焰加热法。目的是杀死细菌，并使菌体与载 玻片粘附牢固，染色时不致于被染液和水冲掉。
培养方法
2 二氧化碳培养法 (1)二氧化碳孵箱：能自动调节二氧化碳的含量和温度， 使用较为方便。 (2)烛缸法：取有盖磨口标本缸或玻璃干燥器，在盖及磨 口处涂以凡士林。将接种细菌的培养基放入缸中，点燃 缸内蜡烛，加盖密封。当蜡烛燃烧时会消耗缸内氧气并 产生CO2，随着缸内氧气的逐渐减少，蜡烛会自行熄 灭，此时缸内CO2浓度约为5％左右。 (3)化学法(重碳酸钠一盐酸法)：（自学）
微生物接种技术-PPT
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
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（1）斜面接平板 a.划线法：见平板划线分离法。 b.点种法：一般用于观察霉菌和酵母细 胞，轻轻点在平板的表面即可。
（2）平板接斜面：一般是将经 平板分散培养得到的单菌落接 种到斜面，以便作鉴定或扩大 培养、保存之用。
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（3）平板涂布法
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1.斜面接种：
从已长好微生物移接到另一斜面管的 方法。此法用于好气性微生物的接种。
左手持菌种管和斜面管，使斜面向上， 并尽量放平。用右手先将塞拧转松动， 再拿接种环，用右手的小指、无名指和 手掌拨下塞并夹紧，同时将管口在火焰 上燃烧一圈，接种环灼烧灭菌后插入管 内，冷却、挑菌，立即转入斜面管底部， 沿斜面划曲线或直线。
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试管斜面接种
1.两支试管呈“V”字形 3.火焰上微烧一周 5.接种、划线
2.拔下试管塞 4.接种环灼烧、冷却 6.塞上塞子，灼烧接种环 6
2.液体接种：
将菌接种到液体培养基（试管、三角瓶等）中的 方法。
操作与上法基本一致，只是在将接种 环送入液体培养基中时使环在液体与 管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分 散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀， 即可培养。 如果菌种是培养在液体培 养基中时，一般用移液管或接种环接 种。
• 倒培养基，制成平板。 • 凝固后，另取一支吸管吸取相应的菌液0.2mL放
至平板上。 •用无菌三角玻棒将稀释液在平板表面涂 抹均匀。倒置于37℃条件下培养1～2d， 观察菌落形态及计数菌落。
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凝 固 后
37℃ 培养
涂布法流程图
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思考题 （1）用接种环接种时有哪些注意事项 （2）涂布棒消毒方法有哪些？各应注意什 么？
细菌接种培养方法
细菌接种培养方法
细菌接种的技术过程主要包括消毒准备、转接细菌、接种培养基、观察结果和清理工作。
具体内容如下：
- 消毒准备：在进行细菌接种前，要确保实验台面、操作者双手、接种环、接种针等工具的清洁、无菌。
- 转接细菌：将携带细菌的接种环或接种针在新的无菌培养基上接种，可以采用直线涂布、环形涂布、刻线等方法。
- 接种培养基：将接种好的培养基放入恒温培养箱培养。
通常需要培养18-24小时，以观察细菌的生长情况。
观察时应记录菌落数量、形态、颜色等特征。
- 清理工作：实验结束后，需要对实验台面和使用的器具进行清洁、消毒。
将已使用的培养基放入高压灭菌锅进行灭菌，待完全冷却后再处理。
在操作过程中要保持良好的实验习惯，避免污染和交叉感染。
细菌的接种方法和有何用途
细菌的接种方法和有何用途细菌的接种方法和用途是微生物学和生物工程领域非常重要的研究内容之一。
有许多不同的接种方法可以用来培养细菌，并且这些方法对于特定的研究目的和应用也存在差异。
下面将介绍一些常见的细菌接种方法以及它们的应用。
1. 微量接种法（streak plate method）：这是最常用的细菌接种方法之一。
首先，将待接种的细菌用聚合物环形均匀涂布在固体培养基表面上。
然后，用环形接种棒连续划线穿过之前的细菌，以使细菌被逐渐稀释并分离成单个菌落。
这种方法适用于分离和纯化微生物种群，以便进一步研究它们的特性和功能。
2. 液体培养基接种法（broth inoculation）：该方法常用于需要大量细菌培养的实验，以及一些需要收集细菌液体培养物的实验。
首先，需要准备含有适当营养物的液体培养基。
然后，将细菌接种至培养基中，通过旋转摇床或培养瓶静置培养来增殖细菌。
利用该方法可以大量生产细菌以备进一步实验分析。
3. 深层接种法（stab inoculation）：这一方法常用于某些需要测试细菌产生气体的实验中。
细菌培养基放置在立体感应槽中，而不是平面表面。
然后使用无菌的未经破裂的商用棉签，将细菌直接从试管或培养瓶中沿着培养基表面扎人培养基内。
这使得细菌在培养基的底部生长，并产生气体，形成透明或气泡区域。
4. 器械接种法（loop inoculation）：该方法通常用于细菌的定量接种和血清抗体试验中。
通过利用加热的弯曲线圈接种棒，将细菌移入培养基中。
细菌的数量可以根据环形接种棒的大小和细菌悬浮液的稀释倍数来控制。
这种方法可以很好地控制细菌接种的数量和均匀性。
细菌的应用十分广泛，以下是一些常见的用途：1. 医学：细菌在医学领域的应用非常重要。
医疗细菌学通过研究细菌在人体中的作用和感染机制，为疾病的治疗和防控提供基础数据。
例如，培养菌株可以用于检测细菌感染，治疗原理的研究，以及抗生素敏感性测试。
2. 环境：细菌在环境中起着重要的生态角色。
简述细菌的接种方法及其应用
简述细菌的接种方法及其应用
细菌接种是一种细生物免疫技术，它可以帮助人们预防和治疗疾病，并在一定程度上提高人们的免疫力。
细菌接种可以分为重组菌接种和细菌，它们都是以细菌为基础，能够有效控制病毒、细菌和寄生虫的活动，也可以阻止和抑制肿瘤的发展。
重组细菌接种是将经过处理的耐药性或具有特殊抗原性的细菌接种给患者，以预防疾病或控制细菌种群传播毒素或病原物。
它以直接或间接形式发挥作用，可能是抗原或抗病原体抗体，还可以使病原物或病毒受抑制，从而减少患者的发病率。
这个技术可以用来处理特殊的疾病，比如动脉粥样硬化，糖尿病，乳腺癌等。
细菌接种另一种形式就是灭活菌接种，它把细菌免疫剂杀死后接种到人体内，以预防和治疗疾病。
这种方式可以在没有症状出现时就给予预防性接种，以避免患者发生病原体感染或致病菌激活，从而阻断对病原体感染的进一步传播。
细菌接种已被用于多种疾病的治疗，它主要应用在预防和治疗细菌性疾病，如白喉、炭疽病、结核病、腮腺炎、腹泻等。
细菌接种对接种者来说是安全的，因为细菌已失去其病原性，不会对人体产生毒素或病原性物质的危害，也不会对患者的免疫系统产生影响。
它可以有效减少传统抗生素治疗的副作用，有利于解决耐药性细菌的问题，并有助于减少致病菌的循环。
因此，细菌接种是一种有效的治疗手段，它可以安全有效地预防疾病，减少对抗生素的使用，改善人们的免疫力，减少病原体的传播。
由于细菌接种的技术性，它已经被用于人类疾病的治疗，被广泛使用，有很大的市场前景。
实验三：细菌分离接种技术和培养
实验三 细菌分离、接种技术和培养法
目的要求：
1、掌握细菌分离培养的基本要领和方法。
2、掌握平板划线、斜面培养基等接种方法。
3、熟悉细菌分离培养的环境和条件。
实验内容：
1、 细菌划线分离培养：连续划线分离培养法 分区划线分离培养法
2、 纯培养获得与移植：试管间的斜面移植； 可疑菌落纯培养移植
Staphylococcus epidermidis on blood agar With on hemolysis
细菌纯培养
细菌斜面 纯培养法
细菌纯培养
液体培养基
半固体培养基穿刺培养
实验报告：
1、细菌分离培养和纯培养的实验过程。 2、本次细菌分离培养的结果。
细菌划线分离培养
Streptococcus pyogenes on blood agar, illustration b-hemolysis.
Streptococcus pneumoniae on blood agar, illustration a-hemolysis.
Staphylococcus aureus on blood agar, illustration b-hemolysis.
3、 液体培养基增菌和培养（示教）
4、 半固体培养基穿刺培养（示教）
说明：
病原菌的人工培养一般采用35～37℃，培养时间多数为18～24 h，但有 时需根据菌种及培养目的作最佳选择，如细菌的药物敏感试验则应选用对数 期的培养物。将标本或培养物划线接种在固体培养基的表面，因划线的分散 作用，使许多原混杂的细菌在固体培养基表面上散开，称为分离培养。一般 经过18～24 h培养后，单个细菌分裂繁殖成一堆肉眼可见的细菌集团，称为 菌落（colony）。挑取一个菌落，移种到另一培养基中，生长出来的细菌均 为纯种，称为纯培养（pure culture）。从混杂的微生物群体中获得只含有 某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。微生物在固体培养 基生长形成的单个菌落一般是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取 单菌落而获得一种纯培养。
细菌的接种与培养方法操作规程
细菌的接种与培养方法操作规程一、细菌的接种根据待检标本的来源、培养目的及所用培养基的性状，采用不同的接种方法。
l、平板画线分离法（1）、连续画线分离法此法主要用于杂菌不多的标本。
用接种环取标本少许，于平板l/5处密集涂布，然后回来作曲线连续划线接种，线与线间有一定距离，划满平板为止。
（2）、分区画线分离法此法适用于杂菌较多的标本。
先将标本均匀涂布于平板边缘一小区(约占平板1/5)，再在二、三区依次连续画线，每画线一区均将接种针灭菌一次。
每一区的划线均接触上一区的接种线1～2次。
以获得单个菌落。
2、斜面接种法该法主要用于单个菌落的纯培养。
用灭菌接种针取菌少许，从培养基斜面底部向上划一直线，然后从底部向上作连续曲线画线。
一直画到斜面顶端。
3、液体接种法多用于一些液体生化试验管的接种。
用灭菌接种环取菌少许，在试管内壁与液面交接处的管壁上轻轻研磨，使细菌混合于液体中。
4、穿刺接种法主要用于半固体培养基、明胶及双糖铁的接种。
用接种针取菌少许，从半固体培养基中央，平行于管壁垂直刺入，接近管底但不可接触管底，然后接种针原路退出。
5、倾注平板法临床上主要用于尿液等标本的细菌计数。
将标本经适当稀释后，取一定量加入已灭菌的平皿内，倾入已经溶化并冷却至45℃左右的定量培养基，混匀，待凝固后倒置、培养。
6、涂布接种法常用于纸片药物敏感性测定，也可用于被检标本的细菌计数。
加定量的被检菌液于琼脂平板表面，然后用灭菌的棉签反复涂布几次，使被检菌均匀分布在琼脂平板表面。
然后贴上药敏纸片培养，或直接培养观察结果。
二、细菌培养方法根据临床初步诊断及待检细菌的种类，可选用不同的环境进行培养。
常用的有需氧培养法、二氧化碳培养法和厌氧培养法。
1、需氧培养法本法是临床细菌室常用的培养方法，即将已经接种好的平板、斜面和液体培养基等。
置于35℃温箱中孵育18～24小时。
2、二氧化碳培养法本室用CO2孵箱将已接种好的培养基置于CO2孵箱内培养。
微生物检验细菌的接种方法
微生物检验细菌的接种方法
常用的细菌接种方法有平板划线分离法、斜面接种法、穿刺接种法、液体和半固体接种法、涂布接种法等。
下面是yjbys小编为大家带来的关于微生物检验细菌的接种方法的知识，欢迎阅读。
一、平板划线分离法
平板划线分离法:是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面，通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。
有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。
其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作由点到线稀释而达到分离目的的。
为方便划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20ml培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。
划线分离主要有分区划线法和连续划线法两种(如图1，A、B)。
分区划线法是将平板分四区，故又称四分区划线法。
划线时每次将平板转动60~70°划线，每换一次角度，应将接种环上的菌烧死后，再通过上次划线处划线;
另一种连续划线法是从平板边缘一点开始，连续作波浪式划线直到平板的另一端为止，当中不需灼烧接种环上的菌。
1)连续划线法
将琼脂平皿半开盖倒置于培养箱内至无冷凝水，接种环于酒精灯外焰烧至红透，接种棒也要充分灼烧，最后再集中烧接种环至红。
轻轻摇匀待接种试管，左手手心托待接种试管底侧部，右手执接种环，右手小指拔下试管塞，于酒精灯附近将接种环伸进试管，稍候，再插入待接接种液中，蘸一下，取满一环，抽出、烧塞、盖盖、放回试。
微生物常用的接种方法
微生物常用的接种方法
微生物的接种是微生物学实验中非常重要的一环，它直接关系到实验结果的准确性和可重复性。
在微生物学实验中，常用的接种方法有涂布法、点接法和扩散法。
首先，涂布法是微生物学实验中最常用的接种方法之一。
使用涂布法进行接种时，首先需要将待接种的微生物悬液均匀涂布在富营养培养基的表面上，然后利用消毒的玻璃棒或铲子将微生物均匀地涂布在培养基表面上。
这种接种方法适用于对微生物数量进行定量分析的实验，如菌落计数等。
其次，点接法是另一种常用的微生物接种方法。
使用点接法进行接种时，需要利用消毒的吸管或者铲子，将微生物悬液均匀地滴在富营养培养基的表面上，形成一个个小圆点。
这种接种方法适用于对微生物的单菌种分离和纯化，以及进行微生物的生长曲线实验等。
最后，扩散法是微生物学实验中常用的接种方法之一。
使用扩散法进行接种时，需要将待接种的微生物悬液均匀地涂布在富营养培养基的表面上，然后利用消毒的玻璃棒或者铲子在培养基表面上
进行扩散，使得微生物悬液均匀地分布在培养基表面上。
这种接种方法适用于对微生物的抗生素敏感性实验和微生物的产酶产毒实验等。
总之，微生物学实验中常用的接种方法有涂布法、点接法和扩散法。
不同的接种方法适用于不同类型的微生物学实验，选择合适的接种方法能够提高实验的准确性和可重复性，从而得到更加可靠的实验结果。
希望本文所述的接种方法能够对微生物学实验的进行有所帮助。
实验四 细菌接种培养法与生长现象观察
实验四细菌的接种培养法与生长现象的观察【目的和要求】1．掌握无菌技术，建立无菌观念；明确无菌操作时注意要点。
2．掌握细菌的接种、分离培养方法和接种环的制作方法。
3．熟悉细菌生长现象的观察方法。
【试剂与器材】1．菌种：葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌等。
2．培养基：固体、半固体、液体培养基。
3．其他：温箱、酒精灯、接种环、接种针、L形玻棒、打火机、记号笔等。
【实验内容】一、细菌的接种工具1．接种环和接种针：其结构包括环（针）、金属柄、绝缘柄三部分（见图4-1）。
其中环（针）部分最佳材料为白金丝，因其受热和散热速度快，硬度适宜，不易生锈且经久耐用，但因为价格昂贵而限制了其应用。
目前实验室常用的是经济实用的300~500W电热镍鉻丝。
一般要求接种环长5~8cm，直径为2~4mm，定量接种环的容量为0.001ml。
图4-1 接种环和接种针接种环（针）在使用之前需检查镍鉻丝是否呈直线，若有弯曲，需用吸管或接种环的另一端将其压直；若环不圆，可将镍鉻丝前端放在吸管尖部缠绕一圈，再将镍鉻丝突出的部分朝内压紧。
接种环用于固体、液体培养基的接种，接种针用于半固体培养基的接种。
2．L形玻棒：由直径2~3mm的玻璃棒弯曲成L形制成。
在使用之前用厚纸包扎后置高压蒸汽灭菌，或沾取无水乙醇后在火焰上烧灼灭菌。
主要用于液体标本涂布接种。
二、细菌的接种方法1．液体培养基的接种该法主要用于细菌的增菌培养或进行细菌的生化反应。
方法：（图4-2）（1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许细菌。
（2）左手拿试管，右手持接种环，用右手其余手指将试管塞打开，试管口通过火焰烧灼灭菌。
（3）将接种环在贴近液面的管壁上上下碾磨数次，使细菌均匀分布于培养基中。
（4）将试管口灭菌后加塞，接种环烧灼灭菌后放回原处。
（5）在试管上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。
图4-2 液体培养基接种法2．半固体培养基的接种该法可用于保存菌种、观察细菌的动力或进行细菌的生化反应。
实验5细菌的接种及分离培养
观察记录菌落形态和特征
01
菌落形态
观察并记录不同细菌在培养基上 形成的菌落形态，如圆形、椭圆 形、不规则形等。
菌落特征
02
03
菌落大小和颜色
记录菌落的色素、透明度、边缘 形状、表面特征（光滑或粗糙） 等。
观察并记录菌落的大小和颜色， 这些特征有助于鉴别不同种类的 细菌。
测定细菌的生长曲线
1 2
生长曲线绘制
观察与记录
定时观察细菌的生长情况，记 录菌落形态、颜色、大小等信 息，以便后续分析。
分离纯化
对于需要分离纯化的细菌，可 采用划线法、稀释涂布法等方 法进行分离纯化，获得单一菌 落。
保存菌种
将分离纯化后的菌种进行保存 ，以便后续实验使用。可以采 用甘油管藏、冷冻干燥等方法
进行保存。
04 实验结果分析
实验结果：通过实验，我们 成功地分离培养出了纯种的 细菌，并观察到了其在不同 培养条件下的生长情况。具
体数据如下表所示
| 培养条件 | 菌落数 | 生长情 况|
实验总结
| --- | --- | --- |
| 温度37℃、湿度适宜 | 120 | 良好 |
| 温度4℃、湿度适宜 | 0 | 无生 长|
结果分析
分析实验结果，比较不同细菌之间的差异，探究其原 因。
结论总结
根据分析结果，得出关于细菌接种及分离培养的结论， 并指出实验中可能存在的误差和不足之处。
05 注意事项与实验总结
注意事项
安全注意事项 实验应在无菌环境下进行，避免外界细菌污染。
使用后的器材和培养基应进行正确的消毒处理，避免交叉污染。
实验目的
本实验旨在学习细菌的接种及分离培养技术，掌握无菌操作技术和显微观察技 术，了解细菌的生长特性和培养条件。
若何选择细菌接种方法[整理版]
![若何选择细菌接种方法[整理版]](https://img.taocdn.com/s3/m/8b1c262a30126edb6f1aff00bed5b9f3f90f727d.png)
如何选择细菌接种方法？细菌的接种方法有很多种，如划线法、涂布法、倾注法、斜面接种法、液体培养基接种法、螺旋接种法等，其方法和应用各有不同，下面进行解释以帮助实验人员选择操作。
划线法：此法主要用于菌种分纯，获得单菌落由接种环沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。
优点：可以观察菌落特征，对混合菌进行分离。
缺点：不能用于菌落计数。
涂布法：此法主要用于菌落总数计数先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，然后用无菌吸管吸取0.1ml菌液接种在已凝固的琼脂平板上。
再用无菌L型玻璃棒将菌液在平板上涂抹均匀，将涂抹好的平板平放于桌上20~30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至长出菌落后即可计数。
优点：可以计数，可以观察菌落特征。
缺点：接种前需梯度稀释，吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。
倾倒法：此法主要用于菌落总数的计数吸取1ml菌液加入平板中，倒入已融化并冷却至45~50℃的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。
至长出菌落后即可计数。
优点：可以计数，较方便。
缺点：接种前需梯度稀释，不能观察菌落特征，不适用于严格好氧菌和热敏感菌。
斜面接种法：此法主要用于保存菌种，或观察细菌的某些生化特性和动力用接种环或接种针伸入菌种管内，挑取用来移种的菌落。
伸入斜面培养管内，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上蜿蜒划线，或直接自下而上地蜿蜒划线。
接种完成之后，用火焰灭菌培养管口，并塞上棉塞，置于37℃培养。
液体培养基接种法：此法主要用于菌液比浊实验用灭菌接种环挑取菌落或标本，在试管内壁与液面交界处轻轻研磨，使细菌均匀得散落在液体培养基中。
螺旋接种法：此法主要用于菌落总数计数Spiral plater 可以在无任何全部或中间稀释的情况下快速细菌接种。
细菌的接种
细菌的接种1、要保证接种成功，必须具备两个前提条件。
一是要使接种能在无菌的环境中进行，即须在灭过菌的无菌室或接种箱中进行，而且操作者必须用肥皂洗手，须穿着干净整洁的衣服，最好配戴口罩，接种用的各种用具也应经过灭菌。
二是要使被接种的培养基完全无菌，即必须将培养基灭菌后方能用于接种。
2、接种方法：首先，点燃酒精灯。
将菌种和斜面培养基的两只试管平行放在左手上，用拇指与其它四指夹住，并使中指位于两试管之间，两试管的管口齐平。
(图①)其次、用右手先将棉塞拧转松动，并稍拉出一些，以利接种时拔出。
(图②)第三、右手持接种针，在酒精灯将针头部分烧红灭。
针头以上凡是接种时可能进入试管的部分。
均应用火灼烧(图③)。
以下操作都要使试管口靠近火旁。
第四，用右手的小指与掌间拔掉左手上两只试管上的棉塞，同时迅速将试管口在酒精灯上烧灼3秒钟左右，使管口上可能沾染的少量杂菌得以烧死(图④)。
笫五，将烧过的接种针伸入菌种管内，先将针头接触培养基上没有菌的部位(如斜面的顶端)，使其冷却，以免烫死被接种的菌体。
然后轻轻接触菌体，取出少许，慢慢将接种针抽出试管，接种针抽出时不要使针头部分碰到管壁和管口，取出后，不可使针头通过火焰，更不可触及其它无关物品或桌面(图⑤)。
第六，迅速将接种针伸进另一试管，在培养基上轻轻划线，接种菌体于其上，划线时，要由底部起划较密的平行线；一直划到顶部，以充分利用斜面面积，但不要将培养基划破(图⑥)。
第七，烧灼试管口，将棉塞塞上。
塞棉塞时，不要移动试管迎接棉塞，以免试管在移动中纳入可能含菌的空气(图⑦)。
第八，将针头在火焰上烧灼灭菌。
放回原处后，腾出手将棉塞塞紧(图⑧)。
细菌的接种方法
细菌的接种方法
细菌的接种方法有：曲线划线法、分区划线法、棋盘格划线法、倾注平板法、斜面接种法、穿刺培养法、液体培养基接种法、菌落分纯法。
本实验室常用的有斜面接种法、液体培养基接种法、菌落分纯法。
一、斜面接种法
此法主要用于鉴定或保存菌种，或观察细菌的某些生化特性和动力（如图1）
（1）用左手握住菌种管和斜面培养基底部，右手持接种环（针）。
（2）用右手小指与手掌、小指与无名指分别拔出两管的棉塞，将管口通过火焰灭菌。
（3）用接种环（针）伸入菌种管内挑取移种之菌落。
（4）伸入斜面培养管内，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上蜿蜒划线，或直接自下而上地蜿蜒划线。
（5）接种完，火焰灭菌管口，塞上棉塞，置于37℃培养。
二、液体培养基接种法（在比浊实验时可用到）
（1）用灭菌接种环挑取菌落或标本。
（2）在试管内壁与液面交界处轻轻研磨，使细菌混匀在液体培养基中。
（如图2）
图1 斜面接种图2 液体培养基接种法
三、菌落分纯法
主要用于分离琼脂平板上的混合菌（如图3）。
（1）用接种针（环）垂直挑取所需分纯细菌的单个菌落，点在另一个固体琼脂平板上的一区，用接种环划线、涂布。
（2）第一区接种后烧红接种环，再划第二区，依次接种至第四区。
图3菌落分纯接种法。
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（一）平板划线接种法（又称分离培养法）平板划线接种法为最常用的分离培养细菌的方法，通过平板划线后，可使细菌分散生长，形成单个菌落，有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌。
平板分离划线的方法较多，其中以分区划线法与曲线划线法较为常用。
其目的都要使细菌呈现单个菌落生长，便于同杂菌菌落鉴别。
现只介绍分区划线法。
1、右手持接种环，经火焰灭菌，待凉后，挑取大肠杆菌（或葡萄球菌）培养物少许。
2、左手斜持琼脂平板，皿盖留在桌上，于火焰近处将菌涂于琼脂平板上端，来回划线，涂成薄膜（约占平板总表面积的1/10），划线时接种环与平板表面成30~40º角，轻轻接触，以腕力在平板表面行轻快地滑移动作，接种环不应划破培养基表面。
3、烧灼接种环，杀灭环上残留细菌，待冷（是否冷却，可先在培养基边缘处试触，若琼脂溶化，表示未凉，稍等再试），从薄膜处取菌作连续平行划线，约占平板表面1/5左右，再次烧灼接种环，等三次平行划线……以同样方法作第四次，第五次划线，将平板表面划完。
4、划线完毕，盖上平皿盖，底面向上，用标签或腊笔注明菌名检验号码，接种者信息等，置37℃孵育培养24小时后观察结果。
（二）纯培养细菌接种法（斜面培养基接种法：用于培养，保存菌种及其它实验用）
1、取一支斜面培养基及一支纯菌种管，并排倾斜放在左手四指中拇指压住并以手掌支住两试管底部。
右手将白金环于火焰上灭菌、冷却。
并拔起两试管的棉塞。
（勿放置桌上，如棉塞太紧时应预先松动）。
2、试管口部于火焰上往返通过2~3次灭菌，将灭菌白金环伸入有菌试管中，取少量细菌（一般应从斜面底部沾取），然后小心移至准备接种的试管中。
3、接种方法是自管底向上连续平划线，若以保存菌为目的时可自管底上划一粗直线即可。
4、取出接种环，将试管上部再经火焰灭菌，塞好棉塞，接种环灭菌后放回原处。
5、若自平皿培养物中取菌时，只应沾取一个单个菌落。
6、接种菌应作好标记，标明菌种名称，日期等，置37℃温箱中培养，次日观察结果。
液体培养基接种法：用于增菌及鉴定细菌生长特点，如表面生长，沉淀生长，均匀混浊生长等。
操作技术基本与上法相同，只是接种时应将沾菌之接种环沿接近液体表面之管内壁轻轻摩擦（勿用力振荡）使细菌混入培养基内，置37℃温箱中培养，次日观察结果。
（三）半固体培养基穿刺培养法用于保存菌种及间接观察细菌之动力（无动力之细菌仅沿穿刺线生长，清晰可见；有动力的细菌使培养基呈现混浊样，穿刺线甚至难以看出）。
用无菌操作技术，灭菌穿刺针沾取细菌后，垂直刺入半固体培养基中央直达近管底处，再沿原穿刺线抽出即可，置37℃温箱培养，次日观察结果。