仪器分析第9讲_分子发光-荧光(第12章 )
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一. 主要组成及部件的功能
荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图
光源 氙 灯 激发单色器
样品池
光电倍增管
数据处理 仪器控制
发射单色器
Modern Instrument Analytical Method
仪器结构流程
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波 长的第一单色器和选择 发射光 ( 测量 ) 波长的第 二单色器； 光源：灯和高压汞灯， 染料激光器(可见与紫 外区) 检测器：光电倍增管。
（3）荧光发射 处于第一激发 的最低振动能 级的分子，跃 迁回基态的各 振动能级，这 一过程称为荧 光发射。
Modern Instrument Analytical Method
（4）系间窜越 分子从激发单重态转至能量较低的激发三 重态的过程，称系间窜越跃迁。 （5）外转换 溶液中的激发态分子与溶剂分子或其他溶 质分子之间相互碰撞而失去能量，并以热能 的方式释放。
Modern Instrument Analytical Method
荧光的产生
Modern Instrument Analytical Method
二、荧光发生机理
当一些物质被光照 射后，物质的分子吸 收光以后，便以基态 跃迁到激发态， 当 电子由激发态的最低 振动能级 S1 跃迁回基 态 S0 的不同振动能级 时，则以荧光的形态 发出能量。
Modern Instrument Analytical Method
《仪器分析》课程
第十二章
Chapter Twelve
分子荧光: Fluorescence
Modern Instrument Analytical Method
Modern Instrument Analytical Method
碰撞猝灭； 配合物或电子转移猝灭等。
Modern Instrument Analytical Method
6.荧光定性分析
任何荧光都有两种特征光谱：激发（吸收）光 谱和发射（荧光）光谱。 比较法：根据波长的特征性进行鉴别。
Modern Instrument Analytical Method
§12.3 荧光(磷光)分光光度计
Modern Instrument Analytical Method
夜明珠发光成因
1、矿物的发光性
矿物在外来的能量激发下，产生可见光的性质称为矿物的发光性。 外来的能量有日光、紫外线、X射线、阴极射线、加热、加压、摩擦等。 根据其发光的性质不同，分为荧光和磷光二类。
2、矿物的发光机理
矿物的发光是矿物能量的一种转换过程，物体受激发吸收能量而跃迁至激发态 （非稳定态）在反回到基态的过程中，以光的形式放出能量。
F
cc 一般当εb c 0.05 时, F 与c呈线性关系
Modern Instrument Analytical Method
（2）环境对荧光强度的影响
relation between fluorescence and molecular structure
影响荧光强度的外部因素
1.溶剂的影响
（3）取代基效应 给电子基增强荧光（－OH, －NH2,－NHR,－NR2,－C≡N）； 吸电子基减弱荧光（－Br , －Cl , － NO2, －N＝N, －COOH）
5、荧光定量分析的原理
在稀溶液中：
F＝2.3Kφεb cI0
φ —荧光物质的荧光效率(量子产率)：
Modern Instrument Analytical Method
溶剂产生的散射光，因为荧光发射波长 跟激发光波长无关，可通过改变后者来 避免散射光的干扰。
5. 激发光照射的影响
能使荧光强度降低。最好采用强度低的 激发光，缩短测定时间，减小荧光物质 分解引起的测量误差。
Modern Instrument Analytical Method
6. 溶液荧光的猝灭（quenching）
荧光激发光谱与 紫外-可见吸收光 谱类似
Modern Instrument Analytical Method
B. 发射光谱(荧光光谱)
固定激发波长 扫描发射波长
C. 激发光谱与发射 光谱的镜像关系
4 3 2 1
S1
4 3 2 1
S0
Modern Instrument Analytical Method
4 3 2 1
S1
荧光寿命: 10－9～10－7 s
4 3 2 1
S0
Modern Instrument Analytical Method
三. 分子荧光(磷光)光谱
1. 荧光(磷光)激发光谱与发射光谱
荧光(磷光)均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出 不同波长的荧光。
IF4800
固定em=620nm(MAX)
Modern Instrument Analytical Method
3）取代基的位置 空间位阻对荧光发射的影响
H3C -O3S N CH3
H3C SO3N CH3
立体异构体对荧光发射的影响
H C H C
C H
C
H
F=0.75
F=0.03
反式二苯乙烯 强荧光物质
顺式二苯乙烯 非荧光物质
电离效应对荧光发射的影响
§12.1 概
述
什么是荧光呢？当某些物质被光照射后，它会吸收一 定频率的光，而发射出 波长更长 的光，当光停止时，发射光 也随即消失，这就是荧光现象，它发出的光就叫荧光。
分子发光分析法是基于被测物质的基态原子吸收 能量被激发到较高电子能态后。返回到基态过程中， 以发射辐射的方式释放能量，通过测量辐射光的强 度对被测物质进行能量测定的一类分析方法。
Biblioteka Baidu偶氮菲
酚酞 产生荧光 不产生荧光
萘
H3C CH3
VA
CH2OH
F(萘)= 5F(VA)
Modern Instrument Analytical Method
取代基效应
1）给电子取代剂加强荧光 —HN2， — NHR ， —NR2， — OH， — OR ， — CN 产生 p →π共轭 化合物
（1）荧光强度(F )与物质浓度(c)的关系
c--荧光物质浓度
ε—摩尔吸光系数
b—液层厚度 I0—入射光强度
当b，I0一定时： F＝ Kc
K—检测效率（由仪器决定） 发射荧光的量子数 吸收激发光的量子数
Modern Instrument Analytical Method
高浓度时，荧光物质发生自熄灭和 自吸收现象，使F与c不呈线性关系
四. 荧光(磷光)的量子产率
荧光量子产率的定义：
F
发射荧光的分子数 激发分子总数
F
kF k F ki
i 1 n
kF主要取决与荧光物质的分子结构； ki主要取决化学环境， 同时也与荧光物质的分子结构有关。 大多数的荧光物质的量子产率在0.1~1之间； 例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，F=0.55； 荧光素 F=1 化合物
波长范围：200~1000nm 工作压力：5~20 atm 启动电压：20~40KV 使用寿命：1000~2000h
最广泛应用的连续光源： 发射波长范围宽 发射光强度大
Modern Instrument Analytical Method
紫外-可见分光光度计:
光源 激发 单色器 样品池 发射 单色器 检测器
数据处理 仪器控制
Modern Instrument Analytical Method
二. 光源 1. 光源的要求： 发射强度足够且稳定的连续光谱 光辐射强度随波长的变化小 有足够长的使用寿命
常用气体放电灯类型： 氙灯光源 高压汞光源 2.氙灯光源
一. 分子荧光与磷光的产生
Modern Instrument Analytical Method
1.激 发
通常在室温下物质分子大 部分处于基态的最低振动 能级。当电子吸收一定频 率的电磁辐射发生能级跃 迁时，可上升至不同激发 态的各振动能级，其中大 部分分子上升至第一激发 单重态（ S1 ），这一过 程称为激发。
荧光的发现
Modern Instrument Analytical Method
1575：N.Monardes
Lignum Nephriticum
1852：Stokes
植物抽提液、矿物、夜明珠、叶绿素、奎宁
借用萤石的（Fluospar）发光现象而推演，荧光 Fluorescence
1867年：Goppelsroder
Modern Instrument Analytical Method
2.去活化过程
处于激发态的分子是不稳定，它可以通过 不同的途径回到基态，这一过程称为去活化。 去活化过程有以下几种： （1）振动驰豫 溶液中分子间碰撞机会很 多，通过碰撞溶质分子将过剩的能量转移给溶 剂分子，通过非辐射跃迁而降至同一能态的最 低振动能级，这一过程称为振动驰豫。
三、荧光光谱的特性
1.任何荧光化合物都有两个特征性光谱：激发光谱和发射光谱 2.斯托克斯位移：与激发光谱相比，荧光光谱的波谱总是出现在 更长的波长处 3.荧光光谱形状与激发波长无关 4.镜像规则： 激发光谱和发射光谱 — 激发光谱 有很好的镜像关系
— 发射光谱
Modern Instrument Analytical Method
OH O-
OH
O-
OHH+
OH-
H+
pH=1, 有荧光
pH=13, 无荧光
无荧光
有荧光
Modern Instrument Analytical Method
荧光与分子结构的关系小结
（1）发光分子中要具有共轭π键体系 共轭的程度越大，π电子越容易激发，分子荧光越容易产生。 （2）具有刚性平面结构 分子有利于荧光发射
Modern Instrument Analytical Method
（2）内转换
同一多重态的不同电子 能级间可能发生内部转换。 S2 S1 条件：当S2较低振动 能级与S1较高振动能级的 能量相当，且发生重叠时 分子才有可能S2 S1
Modern Instrument Analytical Method
1880：Liebeman
进行了历史上首次的荧光分析工作 应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定
提出“荧光与化学结构关系”的经验法则 为荧光技术的开发应用拉开了序幕
19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年， 才由Jette和West提出了第一台荧光计。
§12.2 分子发光的基本原理
A. 激发光谱
固定发射波长 扫描激发波长
4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400 0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
ex =290nm (MAX)
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
2.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几
率增加。
3. 溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。
Modern Instrument Analytical Method
4. 各种散射光的影响
F
λexmax(nm) λemmax (nm)
刚性平面结构
荧光物质的刚性和平面 性增加，有利于荧光发射。
芴 联苯
F=1
F=0.2
Modern Instrument Analytical Method
-O
O C
O
N N
荧光黄 不产生荧光
产生荧光
偶氮苯
COO-
F=0.92
-O C COOO
N N
F
0.11
0.29
0.46
0.60
0.52
Modern Instrument Analytical Method 五、荧光与分子结构的关系
共轭效应 产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越 大，离域大π键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。
化合物 苯 0.11 205 278 萘 0.29 286 321 蒽 0.46 365 400 0.60 390 480 0.52 580 640
相对荧光强度
苯 10
苯酚 18
苯胺 20
苯基氰 20
苯甲醚 20
λ emmax (nm) 278~310 285~365 310~405 280~390 285~345
2）得电子取代基减弱荧光、加强磷光 —C=0， — COOH ， —NO2
不产生 p →π共轭
O
NO2
硝基苯：不产生荧光、弱磷光
二苯甲酮：弱荧光、强磷光 S1 →T1的系间窜跃产率接近1
荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图
光源 氙 灯 激发单色器
样品池
光电倍增管
数据处理 仪器控制
发射单色器
Modern Instrument Analytical Method
仪器结构流程
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波 长的第一单色器和选择 发射光 ( 测量 ) 波长的第 二单色器； 光源：灯和高压汞灯， 染料激光器(可见与紫 外区) 检测器：光电倍增管。
（3）荧光发射 处于第一激发 的最低振动能 级的分子，跃 迁回基态的各 振动能级，这 一过程称为荧 光发射。
Modern Instrument Analytical Method
（4）系间窜越 分子从激发单重态转至能量较低的激发三 重态的过程，称系间窜越跃迁。 （5）外转换 溶液中的激发态分子与溶剂分子或其他溶 质分子之间相互碰撞而失去能量，并以热能 的方式释放。
Modern Instrument Analytical Method
荧光的产生
Modern Instrument Analytical Method
二、荧光发生机理
当一些物质被光照 射后，物质的分子吸 收光以后，便以基态 跃迁到激发态， 当 电子由激发态的最低 振动能级 S1 跃迁回基 态 S0 的不同振动能级 时，则以荧光的形态 发出能量。
Modern Instrument Analytical Method
《仪器分析》课程
第十二章
Chapter Twelve
分子荧光: Fluorescence
Modern Instrument Analytical Method
Modern Instrument Analytical Method
碰撞猝灭； 配合物或电子转移猝灭等。
Modern Instrument Analytical Method
6.荧光定性分析
任何荧光都有两种特征光谱：激发（吸收）光 谱和发射（荧光）光谱。 比较法：根据波长的特征性进行鉴别。
Modern Instrument Analytical Method
§12.3 荧光(磷光)分光光度计
Modern Instrument Analytical Method
夜明珠发光成因
1、矿物的发光性
矿物在外来的能量激发下，产生可见光的性质称为矿物的发光性。 外来的能量有日光、紫外线、X射线、阴极射线、加热、加压、摩擦等。 根据其发光的性质不同，分为荧光和磷光二类。
2、矿物的发光机理
矿物的发光是矿物能量的一种转换过程，物体受激发吸收能量而跃迁至激发态 （非稳定态）在反回到基态的过程中，以光的形式放出能量。
F
cc 一般当εb c 0.05 时, F 与c呈线性关系
Modern Instrument Analytical Method
（2）环境对荧光强度的影响
relation between fluorescence and molecular structure
影响荧光强度的外部因素
1.溶剂的影响
（3）取代基效应 给电子基增强荧光（－OH, －NH2,－NHR,－NR2,－C≡N）； 吸电子基减弱荧光（－Br , －Cl , － NO2, －N＝N, －COOH）
5、荧光定量分析的原理
在稀溶液中：
F＝2.3Kφεb cI0
φ —荧光物质的荧光效率(量子产率)：
Modern Instrument Analytical Method
溶剂产生的散射光，因为荧光发射波长 跟激发光波长无关，可通过改变后者来 避免散射光的干扰。
5. 激发光照射的影响
能使荧光强度降低。最好采用强度低的 激发光，缩短测定时间，减小荧光物质 分解引起的测量误差。
Modern Instrument Analytical Method
6. 溶液荧光的猝灭（quenching）
荧光激发光谱与 紫外-可见吸收光 谱类似
Modern Instrument Analytical Method
B. 发射光谱(荧光光谱)
固定激发波长 扫描发射波长
C. 激发光谱与发射 光谱的镜像关系
4 3 2 1
S1
4 3 2 1
S0
Modern Instrument Analytical Method
4 3 2 1
S1
荧光寿命: 10－9～10－7 s
4 3 2 1
S0
Modern Instrument Analytical Method
三. 分子荧光(磷光)光谱
1. 荧光(磷光)激发光谱与发射光谱
荧光(磷光)均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出 不同波长的荧光。
IF4800
固定em=620nm(MAX)
Modern Instrument Analytical Method
3）取代基的位置 空间位阻对荧光发射的影响
H3C -O3S N CH3
H3C SO3N CH3
立体异构体对荧光发射的影响
H C H C
C H
C
H
F=0.75
F=0.03
反式二苯乙烯 强荧光物质
顺式二苯乙烯 非荧光物质
电离效应对荧光发射的影响
§12.1 概
述
什么是荧光呢？当某些物质被光照射后，它会吸收一 定频率的光，而发射出 波长更长 的光，当光停止时，发射光 也随即消失，这就是荧光现象，它发出的光就叫荧光。
分子发光分析法是基于被测物质的基态原子吸收 能量被激发到较高电子能态后。返回到基态过程中， 以发射辐射的方式释放能量，通过测量辐射光的强 度对被测物质进行能量测定的一类分析方法。
Biblioteka Baidu偶氮菲
酚酞 产生荧光 不产生荧光
萘
H3C CH3
VA
CH2OH
F(萘)= 5F(VA)
Modern Instrument Analytical Method
取代基效应
1）给电子取代剂加强荧光 —HN2， — NHR ， —NR2， — OH， — OR ， — CN 产生 p →π共轭 化合物
（1）荧光强度(F )与物质浓度(c)的关系
c--荧光物质浓度
ε—摩尔吸光系数
b—液层厚度 I0—入射光强度
当b，I0一定时： F＝ Kc
K—检测效率（由仪器决定） 发射荧光的量子数 吸收激发光的量子数
Modern Instrument Analytical Method
高浓度时，荧光物质发生自熄灭和 自吸收现象，使F与c不呈线性关系
四. 荧光(磷光)的量子产率
荧光量子产率的定义：
F
发射荧光的分子数 激发分子总数
F
kF k F ki
i 1 n
kF主要取决与荧光物质的分子结构； ki主要取决化学环境， 同时也与荧光物质的分子结构有关。 大多数的荧光物质的量子产率在0.1~1之间； 例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，F=0.55； 荧光素 F=1 化合物
波长范围：200~1000nm 工作压力：5~20 atm 启动电压：20~40KV 使用寿命：1000~2000h
最广泛应用的连续光源： 发射波长范围宽 发射光强度大
Modern Instrument Analytical Method
紫外-可见分光光度计:
光源 激发 单色器 样品池 发射 单色器 检测器
数据处理 仪器控制
Modern Instrument Analytical Method
二. 光源 1. 光源的要求： 发射强度足够且稳定的连续光谱 光辐射强度随波长的变化小 有足够长的使用寿命
常用气体放电灯类型： 氙灯光源 高压汞光源 2.氙灯光源
一. 分子荧光与磷光的产生
Modern Instrument Analytical Method
1.激 发
通常在室温下物质分子大 部分处于基态的最低振动 能级。当电子吸收一定频 率的电磁辐射发生能级跃 迁时，可上升至不同激发 态的各振动能级，其中大 部分分子上升至第一激发 单重态（ S1 ），这一过 程称为激发。
荧光的发现
Modern Instrument Analytical Method
1575：N.Monardes
Lignum Nephriticum
1852：Stokes
植物抽提液、矿物、夜明珠、叶绿素、奎宁
借用萤石的（Fluospar）发光现象而推演，荧光 Fluorescence
1867年：Goppelsroder
Modern Instrument Analytical Method
2.去活化过程
处于激发态的分子是不稳定，它可以通过 不同的途径回到基态，这一过程称为去活化。 去活化过程有以下几种： （1）振动驰豫 溶液中分子间碰撞机会很 多，通过碰撞溶质分子将过剩的能量转移给溶 剂分子，通过非辐射跃迁而降至同一能态的最 低振动能级，这一过程称为振动驰豫。
三、荧光光谱的特性
1.任何荧光化合物都有两个特征性光谱：激发光谱和发射光谱 2.斯托克斯位移：与激发光谱相比，荧光光谱的波谱总是出现在 更长的波长处 3.荧光光谱形状与激发波长无关 4.镜像规则： 激发光谱和发射光谱 — 激发光谱 有很好的镜像关系
— 发射光谱
Modern Instrument Analytical Method
OH O-
OH
O-
OHH+
OH-
H+
pH=1, 有荧光
pH=13, 无荧光
无荧光
有荧光
Modern Instrument Analytical Method
荧光与分子结构的关系小结
（1）发光分子中要具有共轭π键体系 共轭的程度越大，π电子越容易激发，分子荧光越容易产生。 （2）具有刚性平面结构 分子有利于荧光发射
Modern Instrument Analytical Method
（2）内转换
同一多重态的不同电子 能级间可能发生内部转换。 S2 S1 条件：当S2较低振动 能级与S1较高振动能级的 能量相当，且发生重叠时 分子才有可能S2 S1
Modern Instrument Analytical Method
1880：Liebeman
进行了历史上首次的荧光分析工作 应用铝—桑色素配合物的荧光进行铝的测定
提出“荧光与化学结构关系”的经验法则 为荧光技术的开发应用拉开了序幕
19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年， 才由Jette和West提出了第一台荧光计。
§12.2 分子发光的基本原理
A. 激发光谱
固定发射波长 扫描激发波长
4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400 0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
ex =290nm (MAX)
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
2.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几
率增加。
3. 溶液pH
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制。
Modern Instrument Analytical Method
4. 各种散射光的影响
F
λexmax(nm) λemmax (nm)
刚性平面结构
荧光物质的刚性和平面 性增加，有利于荧光发射。
芴 联苯
F=1
F=0.2
Modern Instrument Analytical Method
-O
O C
O
N N
荧光黄 不产生荧光
产生荧光
偶氮苯
COO-
F=0.92
-O C COOO
N N
F
0.11
0.29
0.46
0.60
0.52
Modern Instrument Analytical Method 五、荧光与分子结构的关系
共轭效应 产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越 大，离域大π键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。
化合物 苯 0.11 205 278 萘 0.29 286 321 蒽 0.46 365 400 0.60 390 480 0.52 580 640
相对荧光强度
苯 10
苯酚 18
苯胺 20
苯基氰 20
苯甲醚 20
λ emmax (nm) 278~310 285~365 310~405 280~390 285~345
2）得电子取代基减弱荧光、加强磷光 —C=0， — COOH ， —NO2
不产生 p →π共轭
O
NO2
硝基苯：不产生荧光、弱磷光
二苯甲酮：弱荧光、强磷光 S1 →T1的系间窜跃产率接近1