原位杂交
原位杂交名词解释
原位杂交名词解释
原位杂交（in situ hybridization）是一种分子生物学技术，用
于检测和定位特定的核酸序列在细胞或组织中的分布情况。
该技术利用一段含有探针的核酸序列与待检测样品中的相应核酸序列进行互补杂交，通过标记的探针的位置和数量来确定目标序列的位置。
原位杂交的操作一般分为以下几个步骤：
1.固定样本：首先需要将待检测的细胞或组织样本固定在载玻
片或载体上，使其不被破坏。
2.脱氧核酸的解性处理：将样本中的DNA或RNA进行解性处理，使其成为单链的状态，以利于与探针的杂交。
3.制备探针：设计和合成一段与目标核酸片段互补的核酸探针，并进行标记。
标记可以使用荧光标记剂、酶标记剂等。
4.杂交：将制备好的探针加到固定的样品上，在合适的温度和
离子平衡条件下，使探针与待检测的样品中的目标序列发生互补杂交。
5.洗涤：通过一系列洗涤步骤，去除未与目标序列相互补的探针。
6.检测和成像：利用显微镜或其他成像设备观察和记录探针的
标记位置和数量，以确定目标序列在样品中的分布情况。
原位杂交技术可以用于很多领域，如遗传学、细胞生物学和病理学等。
它可以用来研究基因表达、染色体异常、病原体感染等问题，帮助科学家更好地了解细胞和组织的结构和功能。
此外，原位杂交还可以用来诊断疾病，如肿瘤、遗传病等，通过监测特定基因的表达情况，帮助医生做出正确的诊断和治疗方案。
总的来说，原位杂交是一种研究和定位目标核酸序列在细胞或组织中分布情况的技术，具有高灵敏度和高特异性的优点，可以广泛应用于生命科学的各个领域。
原位杂交技术原理及其应用
• 早期应用的主要是DNA探针 • Temin在70年代研究致癌RNA病毒时制备了 cDNA探针（complementary DNA），其基 本原理是以RNA为模板，经逆转录酶 （reverse transcriptase）又称为RNA指 导的DNA聚合酶催化产生的。该酶以RNA为 模板，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA，这 一途径与一般遗传信息流的方向相反，故 称逆转录。cDNA是指互补于mRNA的DNA分 子。
• 由于同位素标记探针具有放射性既污染环境， 又对人体有害，且受半衰期限制等缺点，科学 工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核 酸探针进行原位杂交。 • Bauman（1981）等首先应用荧光素标记cRNA探 针做原位杂交，然后用荧光显微镜观察获得成 功。 • Shroyer（1982）报道用2，4二硝基苯甲醛 （DNP）标记DNA探针，使该DNA探针具有抗原 性，然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探 针，最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交 探针。 • 这两种方法至今仍有采用，但因敏感度不够高， 应用不够普遍。
• 多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（acetic anhydride）和三乙醇胺（tri－ ethanolamine）中以减低静电效应，减少 探针对组织的非特异性背景染色。 • 有的作者除在室温下浸于上述溶液10min外， 还在预热37℃的50%甲酰胺/2×SSC液中预 杂交15min，然后用2×SSC，0.30mol/l NaAc/0.030mol/L枸橼酸钠液中浸15min。 • 但也有报道乙酸酐和三乙醇胺液的处理并 不能起到减低背景的目的，不能改善ISHH 的信/噪比例。
• Pezzella（1987）创建了用磺DNA探 针的胞嘧啶碱基磺基化，利用单克隆抗体识别磺 基化探针，再通过免疫组化方法显示结合的单克 隆抗体，从而对杂交结合的探针进行定位。 • 本法的优点是磺基化DAN探针标记简便，不需作缺 口平移标记，敏感度也较高。 • 生物素标记探针技术是Brigat（1983）首先建立 的，它利用生物素标记的探针在组织切片上检测 了病毒DNA，通过生物素与抗生物素结合，过氧化 物酶-抗过氧化物酶显示系统显示病毒DNA在细胞 中的定位。 • 生物素标记探针技术目前已被广泛应用，特别是 在病毒学和病理学的临床诊断中。
原位杂交
原位分子杂交原位杂交核酸分子杂交技术与组织化学技术相结合的一项技术。
它以带标记物的核酸作为探针，在一定条件下，在组织细胞原位与待测核酸序列（如DNA，RNA）进行杂交形成杂交体，然后通过与标记物相应的检测系统，从而在原位对组织细胞中待测的核酸序列进行定性、定位和相对定量的研究。
分子生物学技术中的杂交液相杂交: 参加反应的二条核酸都游离在溶液中固相杂交: 将一条核酸链固定(点样或吸印转移)到固体的支持物上, 再与溶液中的核酸探针杂交菌落原位杂交Colony in situ hybridization斑点杂交Dot blotSouthern 印迹杂交Northern 印迹杂交原位杂交又称原位杂交组织化学依照细胞化学的原则, 在保持组织、细胞或染色体结构的条件下，在原位检测特异的核酸分子原位杂交原理变性(denaturation)---双螺旋DNA分子在某些因素作用下, 双链间的氢键解开或断裂, 解离成二条单链的过程复性(renaturation)---变性的二条DNA单链在合适的条件下, 又可按原来碱基互补配对, 再结合在一起形成双螺旋结构退火◆杂交(hybridization)---不同来源但具有同源性的二条DNA或RNA单链, 按碱基配对原则结合在一起⏹探针(probe)---一段已知序列的DNA、RNA或寡核苷酸片段◆靶核酸分子---所要检测的核酸分子或核苷酸序列，可以是DNA或RNA原位杂交基本原理利用标记的核酸探针与组织细胞中的待测核酸进行杂交，然后用放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行检测，从而在组织细胞原位显示某种特定基因、或mRNA分【原位杂交优点】☞既有分子杂交技术特异性强、灵敏度高的特点，又具有组织细胞化学染色的可见性☞既可用新鲜组织做，又可用石蜡包埋组织作回顾性研究☞所用标本量少，可用活体穿刺和细胞涂片标本☞应用范围广探针及其制备探针的长度：以选择50～300bp最为适宜（一）探针的种类与制备根据标记方法不同，分为放射性探针和非放射性探针原位杂交的探针分子：cDNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针cDNA探针（complementary DNA）双链cDNA探针是最常用的核酸探针通常容易得到的cDNA探针是克隆于质粒载体中的特异cDNA分子【制备方法】用生物工程技术获取特异的cDNA片段从mRNA逆转录生成cDNA→构建cDNA 文库→筛选和克隆特异cDNA 分子特异cDNA 分子与载体（质粒）DNA在体外重组•质粒转化•质粒扩增•质粒抽提、酶切、纯化→得到特异的cDNA探针【优点】1. cDNA探针不含内含子序列, 特别适用于基因表达的研究2. DNA探针一般较RNA探针敏感3. 克隆于质粒载体中, 使用方便, 不需再次克隆4. 多种标记方法, 可靠易行5. 杂交适宜温度范围较宽, 较稳定, 不易降解【缺点】1. 要用凝胶电泳移除载体序列2. 探针需变性3. 杂交反应中可能存在自身复性RNA探针---体外转录技术制得◆一类新型的载体: 噬菌体pSP和pGEM这类载体在多克隆位点的二侧分别带有SP6启动子和T7启动子, 在SP6 RNA聚合酶和T7 RNA聚合酶作用下, 可以进行RNA转录◆将外源特异cDNA片段插入多克隆位点接头处→DNA重组体→转化细菌→质粒扩增→质粒抽提→体外转录合成RNA探针【优点】☞单链分子, 在组织内通透性好, 杂交效率比DNA探针高☞RNA-mRNA杂交体比DNA-mRNA杂交体稳定☞通过改变外源DNA插入方向, 或选用不同的RNA聚合酶, 可转录出正义RNA链和反义RNA链反义RNA链---又称cRNA链, 用作杂交的探针正义RNA链---用于杂交的阴性对照☞杂交体所需解链温度高, 能耐受杂交过程中的较高温度及杂交后的洗涤【缺点】1. 容易受RNA酶污染2. 制备过程复杂3. 杂交适宜的温度范围较宽寡核苷酸探针根据靶核酸序列而设计, 在DNA合成仪上用化学方法合成的短链探针【优点】1.10~50bp, 在组织内通透性好2. 单链DNA寡核苷酸, 杂交时无需变性, 无自身杂交3. 一次合成, 可使用多时, 价格低廉4. 对RNase不敏感, 比RNA探针更稳定, 便于操作【缺点】1.与mRNA形成的杂交体不如RNA-RNA稳定2. 探针较短, 所携带的标记物较少, 特异性、敏感性都低3.标记方法受限制, 只能采用末端标记法探针的标记1. 标记物理想的标记物应具备的条件:☞标记后探针的分子结构尽可能与原来的分子结构相同☞标记后探针的检测方法要简便, 准确, 可靠, 重复性好☞安全无害目前常用标记物有同位素和非同位素二大类⏹同位素标记探针: 35S, 32P, 33P 和3H◆非同位素标记探针⏹生物素:生物素广泛的存在于动物体内内源性生物素对杂交信号的干扰地高辛:半抗原, 从洋地黄植物的花和叶中提取杂交信/噪比高, 敏感性高非同位素标记物中的最佳选择2.标记方法⏹(1) 双链cDNA探针的标记随机引物法(random primed DNA labelling)⏹(2) RNA探针标记---在体外转录技术中与探针制备同时完成(3) 寡核苷酸探针标记---主要是末端标记法(end-labelling )标记探针的纯化与检验纯化: 将标记反应中未被结合的,即游离的标记dNTP,与掺入cDNA或cRNA的标记核苷酸分开,并将游离的部分去除纯化的方法:普通凝胶柱层析, 离心凝胶层析, 乙醇沉淀法检验:斑点印迹法，液闪法原位杂交方法(一) 探针及其标记(二) 组织样品制备1. 去除或抑制RNA酶物理方法: 1. 对耐高温的实验器具高温烘烤180℃3小时以上2. 实验用试剂, 耐热塑料器具120℃30min化学方法: 杂交用试剂均应用DEPC水配制对不耐热的器具可浸于DEPC水中, 室温处理2~3h实验中注意戴口罩和手套操作DEPC---焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)通过与组氨酸结合而使蛋白质变性配制: 0.1%DEPC水37℃水浴恒温振荡过夜2.取材及固定◆取材：组织要求新鲜如有可能尽量使用灌流固定手术材料最好在组织离体后30min内取材并立即进行固定取材过程中防止RNA酶的污染固定1. 目的：避免组织细胞中核酸的降解，保存组织细胞形态结构的完整2. 固定方法: 灌流法, 浸泡法浸泡法: 一般将组织块切成0.5~1.0cm3大小, 浸泡于15倍左右体积的固定液中, 固定24hr冰冻切片或细胞培养标本, 固定20~30min3.固定时间4.常用固定剂: 4%多聚甲醛, 10%甲醛包埋和切片石蜡包埋和切片方法同常规操作过程中防止RNA酶污染戴手套操作切片刀用DEPC水擦拭，镊子消毒后使用切片时，用0.1%DEPC水展片新鲜切片60℃烘烤16~24hr玻片的处理❑玻片上涂上粘附剂❑常用粘附剂: APES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)多聚赖氨酸明胶❑防脱处理后高温消毒原位杂交实验1.杂交前处理目的:提高组织的通透性，增加靶核酸分子的可及性常用方法:脱蜡，去污剂，表面活性剂：Triton X-100，SDS，Tween蛋白酶：蛋白酶K，胃蛋白酶2.预杂交: 将不含探针和葡聚糖的杂交液与组织孵育3. 探针和靶核酸的变性杂交滴加含有探针的杂交液(20μl/片), 盖上盖玻片或无菌的石蜡膜, 置于湿盒内, 在合适温度的烘箱内杂交❑杂交液钠盐: 5 X SSC (标准柠檬酸钠-氯化钠溶液)50%去离子甲酰胺硫酸葡聚糖牛血清白蛋白, 鲑鱼精DNA等❑探针浓度放射性标记探针---0.5ng/μl非放射性标记探针---2ng/μl⏹PH值: 通常使用缓冲液PH7.2~7.4❑杂交温度: 一般低于相应杂交体的Tm值25℃❑杂交时间❑杂交环境: 湿盒内加少量与杂交液相同渗透压的SSC (5X SSC)杂交后漂洗在高严格度条件下，漂洗除去未参与杂交体形成的过剩探针，消除探针与组织细胞的非特异结合高严格度条件：指高的温度，低的钠离子浓度一般用浓度递减的SSC溶液在一定温度和振荡下漂洗切片：2X SSC→1X SSC→0.5X SSC杂交后信号检测❑同位素标记探针: 放射自显影❑DIG标记探针:AKP或HRP标记的抗DIG抗体显示系统DIG-AKP检测系统: 以NBT/BCIP为底物显色, 结果为紫蓝色沉淀DIG-HRP检测系统: 以DAB/H2O2为底物, 结果为棕阴性对照试验方法作用●杂交前用核酸酶处理如果杂交信号明显降低或消失, 说明探针是与组织细胞中●的核酸杂交●杂交液中省去探针如果出现阳性反应, 说明这些信号是与杂交反应无关的●用正义核酸探针如果无杂交信号, 表明探针的特异性●加过量未标记探针杂交后阻断标记探针与待测核酸的结合, 如杂交再加标记探针杂交信号消失或下降, 表明探针杂交的特异性5. Northern或Southern分析如果在待测核酸的分子量大小处显示一条杂交信号带, 表明探针的特异性6. 将标记探针与未标记探针按如果杂交信号随标记探针量的增加而增一定比例混合, 然后杂交加, 说明探针是特异的实验中可能出现的问题原位杂交实验失败1. 探针探针的敏感性;保存的好坏, 保存时间探针浓度; 探针长度2.组织材料的保存3. 实验过程中防止RNase污染, 做到严格的无RNase操4. 杂交前处理:蛋白酶消化的浓度, 时间PK在冰冻切片浓度为0.5~2μg/ml石蜡切片浓度10~20μg/ml5. 杂交条件: 温度时间6. 杂交体检测脱片☞玻片的防脱处理☞杂交前预处理时蛋白酶的浓度，消化时间☞杂交后漂洗过度非特异性染色☞探针特异性不高☞组织细胞内内源性酶染色内源性过氧化物酶0.5%~5%H2O2内源性碱性磷酸酶1mmol/L左旋咪唑内源性生物素☞杂交后的漂洗2X SSC→1X SSC→0.5X SSC37℃振荡漂洗⏹ 概念：⏹ 原位杂交 ，变性，复性（退火），探针，靶核酸分子 ⏹ 原位杂交基本原理，优点⏹ 探针的种类及优缺点⏹ 探针的标记方法及原理⏹ 组织样品制备时的注意事项⏹原位杂交中可能会出现哪些问题，应怎样避免这些问题⏹原位杂交特性以及与免疫组化比较⏹。
原位杂交
原位杂交原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。
其英文名为in situ hybridization,其中in situ为拉丁文，原义是"in its natural position". 字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。
原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。
这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。
该技术最早应用于6 0年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已被广泛应用，例如与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平。
原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA杂交。
但不论哪种杂交都必须经过组织细胞的固定，预杂交，杂交，冲等一系列洗步骤及放射自显影或免疫酶法显色以显示杂交结果。
我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。
整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。
原位杂交原理及具体操作
原位杂交原理及具体操作原位杂交的具体操作包括以下几个步骤：1.样本准备：收集需要研究的细胞或组织样品，并进行固定和处理。
具体处理方法根据研究对象的特点和需求而定，可以涉及蛋白酶消化、脱脂、固定等步骤。
2.产生标记探针：首先要选择合适的探针来检测目标序列。
探针可以是DNA或RNA序列，根据研究对象选择相应的方法进行标记，常见的标记方法有荧光标记、放射性标记和酶标记等。
标记后的探针需要经过纯化和检测，确保标记效果良好。
3.杂交反应：将标记的探针与样本中的DNA或RNA进行杂交反应。
首先需要将样本脱水，并在适当温度下使用探针溶液进行孵育反应，使探针与目标序列发生特异性结合。
杂交温度根据探针和目标序列的互补性来确定，一般在适当的温度下进行持续反应。
4.洗涤：杂交反应结束后，需要进行严格的洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异性结合。
洗涤的条件也根据研究需要而定，可以使用高盐溶液、低盐溶液或有机溶剂等来去除非特异性结合。
5.信号检测：根据具体标记方法的不同，可以使用荧光显微镜、射线计数器或底物染色等方法来检测标记的探针。
通过观察探针的位置和强度，可以得到目标序列在细胞或组织中的分布和表达情况。
6.分析与图像处理：根据实验结果，可以对图像进行定量分析和处理。
现代技术已经能够通过图像软件进行分析和定量，得到原位杂交的定量数据。
原位杂交技术的优点在于可以在细胞或组织水平上观察和定位目标序列的存在和表达情况，为研究基因表达、基因功能以及病理学等提供了强有力的工具。
但是在操作过程中需要注意探针的选择和合成、杂交条件的优化以及样品处理的标准化等问题，以确保实验结果的准确性和可重复性。
原位杂交操作流程
原位杂交操作流程1、使用地高辛标记的核酸探针进行石蜡切片的RNA原位杂交第一天1)二甲苯于37°C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次3分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次3分钟；4)PBS清洗3分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗10分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml,37°C孵育15分钟；8)PBS清洗2次，每次3分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次3分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12)PBS清洗2次，每次5分钟；13)预杂交缓冲液孵育30分钟；14)准备核酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针，85°C加热5分钟，置于冰块中10分钟；15)杂交；第二天16)将玻片置于SSC中2次，每次5分钟以去除封片；17)PBS清洗3分钟；18)RNA酶A溶液中(或0.1-1ng/mlPBS中)，37°C孵育30分钟；19)PBS清洗5分钟；20)室温，2XSSC清洗10分钟；21)37°C，1XSSC清洗10分钟；22)37°C，0.5XSSC清洗10分钟；23)缓冲液A孵育10分钟；24)缓冲液A(1%正常绵羊血清和0.03%三重氢核X-100)孵育30分钟；25)加入抗地高辛抗体(1/200的上述缓冲液，来自BoehringerMannheim)，37°C孵育3小时；26)缓冲液A清洗2次，每次10分钟；27)缓冲液B清洗2次，每次5分钟；28)制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可延长到16小时;29)停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；30)固红，脱水以及封片进行核的复染。
2、使用地高辛标记的寡核苷酸探针进行石蜡切片的原位DNA杂交第一天1)二甲苯于37C脱蜡2次，每次15分钟；2)无水乙醇浸泡2次，每次5分钟；3)95%乙醇浸泡2次，每次5分钟；4)PBS清洗5分钟；5)2%焦碳酸二乙酯室温下浸泡10分钟；6)PBS清洗5分钟；7)加入胃蛋白酶25ul/ml，37C孵育10分钟；8)PBS清洗2次，每次5分钟；9)0.2N的HCl孵育30分钟；10)PBS清洗2次，每次5分钟；11)0.25%无水乙酸和0.1M三乙醇胺孵育10分钟；12）PBS清洗5分钟；13）预杂交缓冲液孵育30分钟；14）准备寡核苷酸探针混合物：使用预杂交缓冲液稀释探针；15）杂交；第二天16）将玻片置于SSC中以去除封片；17）室温，2XSSC清洗10分钟；18）37°C,1XSSC清洗10分钟；19）37°C,0.5XSSC清洗10分钟；20）缓冲液A孵育10分钟；21）缓冲液A孵育30分钟；22）加入抗地高辛抗体37C孵育3小时；23）缓冲液A清洗2次，每次5分钟；24）缓冲液B清洗2次，每次5分钟；25）制成NBT/BCIP暗处保存30-60分钟，显微镜下进行观察，如果背景尚佳，显色时间可长到16小时；26）停止缓冲液B的反应，用水进行简单的清洗；27）固红，脱水以及封片进行核的复染。
原位杂交技术的具体步骤
原位杂交（In situ hybridization）是一种用于检测核酸序列在细胞或组织中的位置和表
达水平的技术。
下面是原位杂交技术的一般步骤：
1.样品固定：首先，准备需要检测的细胞或组织样品，并将其进行固定。
常用的固定方法包括使用乙醛、乙酸、甲醛等。
2.使DNA或RNA标记：选择适当的探针，它可以是DNA或RNA序列，用于与目标
核酸序列杂交。
标记的方法通常使用荧光染料、酶或同位素等。
3.制备与标记探针配对的杂交缓冲溶液：制备含有探针的杂交缓冲溶液，其中包含适当的盐和添加剂，以提供最佳的杂交条件。
4.杂交：将标记的探针加入样品中，让其与目标序列进行杂交。
这一步可以在高温条件下进行，以增加探针与目标序列的特异性结合。
5.洗涤：进行一系列洗涤步骤，以去除未结合的探针和非特异结合物，提高信号的特异性。
6.反应可视化：根据所使用的标记方式，进行合适的染色或检测步骤，以显示杂交信号。
这可以是荧光显微镜观察、酶反应染色或同位素探测等。
7.结果分析：通过显微镜观察或其他适当的图像分析方法来解读和分析杂交结果。
评估信号的位置、强度和特异性。
这些步骤仅为一般原位杂交的基本流程，具体的实验条件和步骤可能会根据研究目的
和样本类型的不同而有所调整。
原位杂交技术在生物医学研究等领域广泛应用，可以
帮助研究者了解基因表达和变化的空间定位和时序关系。
核酸原位杂交的影响因素
核酸原位杂交的影响因素
以核酸原位杂交的影响因素为题，我们需要了解什么是核酸原位杂交。
核酸原位杂交是一种分子生物学技术，用于检测细胞或组织中的特定核酸序列。
它可以用来确定基因的位置、表达和拷贝数目，以及检测病毒和细菌等微生物的存在。
1. 样本制备：样本制备是核酸原位杂交的关键步骤之一。
样本的处理和固定方法会影响到杂交的结果。
如果样本处理不当，可能会导致核酸的降解或失去活性，从而影响杂交的准确性。
2. 杂交条件：杂交条件包括温度、盐浓度、pH值等。
这些条件会影响到探针与目标核酸的结合情况。
如果杂交条件不合适，可能会导致探针与目标核酸结合不紧密，从而影响杂交的准确性。
3. 探针的选择：探针的选择是核酸原位杂交的另一个关键因素。
探针的长度、序列和标记方式都会影响到杂交的结果。
如果探针的序列与目标核酸不匹配，或者探针的标记方式不合适，可能会导致杂交的准确性下降。
4. 信号检测：信号检测是核酸原位杂交的最后一步。
信号的检测方法包括荧光显微镜、放射性计数等。
如果信号检测方法不合适，可能会导致信号的检测灵敏度不足，从而影响杂交的准确性。
核酸原位杂交的影响因素包括样本制备、杂交条件、探针的选择和
信号检测等。
在进行核酸原位杂交实验时，需要注意这些因素，以保证实验结果的准确性和可靠性。
基因组原位杂交名词解释_解释说明以及概述
基因组原位杂交名词解释解释说明以及概述1. 引言1.1 概述在遗传学和分子生物学领域，基因组原位杂交是一种常用的实验技术。
通过此技术，我们可以将标记有荧光物质或其他探针的DNA序列与目标细胞或组织中的特定基因进行配对，从而确定该基因在细胞核中的位置和数量。
基因组原位杂交广泛应用于细胞遗传学、肿瘤研究、发育生物学和进化研究等领域。
1.2 文章结构本文将首先解释并概述基因组原位杂交的定义以及其应用场景。
然后详细说明基因组原位杂交的原理和步骤，包括过程概述、探针设计与合成以及样本处理与标记。
接下来，将介绍一些典型的应用案例，并总结当前的研究进展。
最后，文章将给出一个结论部分，总结文章要点，并提出未来发展方向或建议。
1.3 目的本文旨在向读者提供关于基因组原位杂交的名词解释和解释说明。
通过阅读本文，读者将了解到基因组原位杂交在遗传学和分子生物学领域的重要性和应用场景。
同时，读者将深入了解基因组原位杂交的原理、步骤以及样本处理技术。
通过学习应用案例和研究进展，读者可以了解到该技术在不同领域的应用前景，并为未来的研究和发展提供建议。
2. 基因组原位杂交名词解释2.1 基因组原位杂交概述基因组原位杂交是一种使用特定的DNA探针与目标样本中的互补序列结合的技术。
该技术可以用于检测和研究细胞或组织中的特定DNA序列的位置和数量。
2.2 基因组原位杂交定义解释基因组原位杂交是一种利用DNA探针与靶标DNA进行配对结合，并通过适当的标记物（如荧光染料）来可视化或检测目标DNA在细胞核或染色体上的分布情况。
2.3 基因组原位杂交应用场景基因组原位杂交可广泛应用于遗传学、生物医学研究以及临床诊断等领域。
它常被用来检测异常基因重排、染色体缺失或增加以及指导癌症治疗等，具有非常重要的意义。
通过基因组原位杂交，科学家们可以确定某个特定DNA序列在细胞中的存在与否，甚至可以研究不同条件下DNA分子之间的相互作用。
这项技术对于理解基因组中的基因调控、染色体结构和功能等方面的研究具有重要意义。
原位杂交 DIG
原位核酸分子杂交技术原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。
这一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，使从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具。
可视为组织化学或免疫细胞化学中革命性的突破。
原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(Gene mapping),转基因检测,基因表达定位(localization of gene expression),核DNA和RNA的mRNA的排列和运输(arrangement and transport of mNA),复制(replication)和细胞的分类(Sorting of cells)。
临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics),产前诊断(Prenatal diagnosis),肿瘤和传染性疾病的诊断,生物学剂量测定(biological dosimetry)和病毒学的病原学诊断等。
随着核酸探针的制备,标记方法和基本操作方法的不断改进,新的技术不断涌现,相信在不久的将来,原位杂交技术将会更广泛的被应用于各个学科,并不断为生命科学提供新的资料,开拓新的领域。
原位核酸分子杂交技术的发展第一节原位杂交1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其BuongiornoNardelli卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。
与此同时，和Amaldi,John及其同事等相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位。
Orth(1970)3H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交，首次用原位杂交技术检出了病毒DNA性既污染环境，又对人体有害，且受半衰期限制等特点，因此研究用非放射性的标记物标记核酸探针进行原位杂交，引起了许多学者的重视和探索。
原位杂交
原位杂交原位准备工作：1、不锈钢与玻璃器皿180度烘12小时以上2、需DEPC处理的三蒸水约8升（听说可以用灭菌三蒸水代替）3、双蒸水可以用一馏水（即蒸馏水）代替4、所用枪头可以灭一个小时烘干用（也可用烘好的移液管）5、所用蜡片温度不能过高，防止材料变形6、切片一定要尽量吸干，并且烘12小时以上（但不能过长），以防脱落7、实验所需试剂的量要略作变动，大缸约600ml，小缸约500ml8、所有试剂除储备液外，最好都现配现用，请备好足够的烘好的量筒及容器最后强调杂交之前配试剂、融蜡与加蜡所用一切器皿器具都要180度处理，请戴乳胶手套（尽量避免接触其它地方）以防组织RNA降解下次做需买的东西：1、t RNA（一个100u的加50ul水，较粘稠吸取时应慢些，并看一下是否吸到）2、BSA（一次约需15克）3、多聚甲醛（一次约需20克）4、非去离子甲酰胺（一次约需200多ml）5、RNAse（实验室可能有）6、最好领2个2L的三角瓶7、乳胶手套8、无水乙醇（一次约需12瓶，有些地方应该可以95%的代替）做之前请认真检查所需一切用品是否到位I．组织固定和包埋在本实验室条件下推荐使用FAA（50% ethanol, 5% acetic acid, 3.7% 甲醛）固定材料，似乎比4%多聚甲醛固定时抽气更彻底。
FAA固定液（400ml），室温保存：无水乙醇 200ml冰醋酸 20ml37%甲醛 40ml水（DEPC） 140ml1L水加1mlDEPC，37℃过夜（最好一直慢摇或剧烈摇晃后再放入），灭菌第一天：组织固定（下午4、5点取材）将装有2/3体积固定液的青霉素小瓶（小瓶预先在180℃烘过）置于冰上，取新鲜材料投入，冰上真空抽气。
缓慢抽气冒气泡后保持真空15分钟后缓慢放气，如此数次至材料沉底即可，以达到快速彻底固定。
换新鲜固定液，4℃过夜（12～16小时）。
（用DEPC-H2O配酒精）第二天：脱水以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待，并不时轻摇。
原位杂交技术
生物素：在动物细胞中是羧化酶的辅酶，在肝、肾、心、
肺等组织中丰富，主要集中在线粒体中。 地高辛：从洋地黄植物的花和叶中提取。
（动物细胞中不存在）
组织样品制备
（一）.去除或抑制RNA酶
方法有两类：
物理方法： 对耐高温的器具如玻璃器皿，不锈钢器具进行高
温烘烤（180-200℃干烤4-6小时）。
原理：碱基互补配对原则
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原位分子杂交
杂交体
杂交条件
严格度概念
DNA-DNA
杂交体
DNA-RNA RNA-RNA
稳定性：
DNA-DNA﹥DNA-RNA ﹥RNA-RNA
稳定性受以下因素影响：甲酰胺浓度 盐浓度等 温度等
原位杂交技术的条件
杂交液 探针浓度 温度 PH 时间
杂交液
对溶液和耐高温塑料器具作高温蒸汽消毒 化学方法：
焦磷酸二乙酯（DEPC） 作用机制：通过与组氨酸结合使蛋白质变性
（二）取材
组织要求新鲜，迅速投入到固定液中 标本置于低温环境下可抑制RNA酶作用
（三）固定
4％多聚甲醛培养2-6小时（培养细胞30分钟）
（四）包埋和切片
常规方法
（五）电镜杂交技术
（六）冷冻切片
冷冻切片保存靶细胞较多，较易获得杂交 信号
原位杂交
（一）杂交前处理
1.灭活内源性酶 在用酶作为报告分子时
（过氧化物酶 碱性磷酸酶）
2.RNA酶处理 3.盐酸和乙酸酐处理 提高杂交效率并降低背景 4.通透处理 消化去除细胞表面和内部特别是靶细胞
周围的蛋白质，增加探针等反应分子对 靶核酸分子的接触机会
温度
杂交时温度一般低于相对杂交体Tm值25℃
原位杂交技术
高严格度条件下 低严格度条件下
碱基完全互补的双链可形成杂交体 碱基对不完全互补的双链也能形成杂交体
二、杂交体的探测
使标记的杂交体在光镜或电镜下可见 （一） 放射自显影方法 （二） 免疫细胞化学方
（一）放射自显影方法 用同位素标记探针来显示杂交反应的方法
去除或抑制RNA酶方法：
去除或抑制RNA酶的方法有两类
物理方法： 对耐高温的器具如玻璃器皿、不锈钢器 具作高温烘烤（180-200℃干烤4-6小时） 对溶液和耐热塑料器具作高压蒸气消毒
化学方法： 焦碳酸二乙酯( DEPC ) 作用机制是通过与组氨酸结合而使蛋白 质变性
组织样品制备
(二) 取材 (三) 固定
胶体金联结 的抗小鼠抗体
电镜非放射性原位杂交： 地高辛标记探针－间接胶体金检测
第二节 原位杂交方法
一、探针 二、组织样品制备 三、原位杂交 四、杂交体的探测 五、基本实验过程 六、一些关键问题
一、探针
（一）探针的选择 （二）探针标记物的选择
（一）探针的选择
cDNA和RNA ：适宜于检测mRNA分子
பைடு நூலகம்
（六）冷冻切片 冷冻切片保存靶核酸较多 较易获得杂交信号
三、原位杂交 （一） 杂交前处理
1.灭活内源性酶 在用酶作为报告分子时
（过氧化物酶 碱性磷酸酶）
2.RNA酶处理
3.盐酸和乙酸酐处理 提高杂交效率并降低背景
4. 通透处理 消化去除细胞表面和内部特别是靶核
酸周围的蛋白质，增加探针等反应分 子对靶核酸分子的接触机会
DNA —— 可以是中期染色体上的或是间期细 胞核内的，也可以是线粒体DNA或 病毒DNA
原位杂交实验注意事项
原位杂交实验注意事项原位杂交是一种常用的分子生物学实验技术，可以用于检测DNA序列在细胞或组织中的位置和数量。
在进行原位杂交实验时，需要注意以下事项：1. 实验前准备在进行原位杂交实验前，需要准备好所需的试剂和设备。
首先要制备探针，探针可以是DNA或RNA序列，必须与待检测序列有特异性结合。
同时还需要制备标记探针的荧光素或辐射性同位素等标记物质。
此外还需要准备组织切片、蛋白酶、去离子水等试剂。
2. 样品处理在进行原位杂交实验前，需要对样品进行处理。
对于组织切片样品，需要将其固定在载玻片上，并进行脱水和脱脂等处理步骤；对于细胞样品，需要将其接种到载玻片上并进行固定和透明化等处理步骤。
3. 探针标记探针标记是原位杂交实验中非常重要的一步。
标记探针可以使用荧光素或辐射性同位素等方法。
荧光素标记通常使用荧光素同工异构体，而辐射性同位素标记则需要使用放射性同位素。
在进行探针标记时，需要注意避免污染和误差。
4. 杂交反应在进行原位杂交实验时，需要进行杂交反应。
杂交反应通常在高温下进行，可以通过热板或烤箱等设备来实现。
在进行杂交反应时，需要注意控制温度和时间，并保持样品湿润。
5. 洗涤和检测完成杂交反应后，需要对样品进行洗涤和检测。
洗涤可以使用盐水、缓冲液等溶液来去除非特异性结合的探针。
检测则可以使用荧光显微镜或放射计等设备来观察样品中标记的探针。
6. 实验安全在进行原位杂交实验时，需要注意实验安全。
荧光素标记的探针具有一定的毒性，需要避免接触皮肤和吸入气溶胶；辐射性同位素标记的探针则需遵守相关放射防护规定，并严格控制实验室内辐射水平。
综上所述，在进行原位杂交实验时，需要注意以上事项，并严格按照实验步骤进行操作，以获得准确的实验结果。
原位杂交
原位杂交原位杂交组织(或细胞)化学 (In situ Hybridization Histochemistry, ISHH) 简称原位杂交(In Situ Hybridization)，属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。
根据所用探针和靶核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。
根据探针的标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法和间接法两类。
直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交，杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。
间接法一般用半抗原标记探针，最后通过免疫组织化学法对半抗原定位，间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。
原位杂交最初是以同位素标记探针进行的。
尽管同位素标记(如35S，3H，32P等)仍然广泛使用，但非同位素标记探针的迅速发展(尤其是生物素标记探针和地高辛标记探针)，更引起科技工作者的极大兴趣。
一、基本要求组织取材：组织取材应尽可能新鲜。
由于组织RNA降解较快，所以新鲜组织和培养细胞最好在30min内固定。
固定：目的是(1)保持细胞结构；(2)最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平；(3)使探针易于进入细胞或组织。
最常用的固定剂是多聚甲醛，与其它醛类固定剂(如戊二醛)不同，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。
增强组织的通透性和核酸探针的穿透性：(1)稀酸处理和酸酐处理：为防止探针与组织中碱性蛋白之间的静电结合，以降低背景，杂交前标本可用0.25%乙酸酐处理10min，经乙酸酐处理后，组织蛋白中的碱性基团通过乙酰化而被阻断。
组织和细胞标本亦可用0.2M HCl 处理10min，稀酸能使碱性蛋白变性，结合蛋白酶消化，容易将碱性蛋白移除。
(2)去污剂处理：去污剂处理的目的是增加组织的通透性，利于杂交探针进入组织细胞，最常应用的去污剂是Triton X-100。
原位杂交
DNA链。
3.寡核苷酸探针：10-50bp，测序、点突变。 4.RNA探针：以DNA两条链中的任意一条为模板转录 生成RNA。稳定性高、特异性强。
各种探针比较种类 来源 基因组某 一基因的全部 或编码序列 以mRNA为模板 反转录cDNA mRNA 优点 制备简单 不易降解 标记方法成熟 无内含子 缺点 非特异性杂 交 不易获得
证明，病毒的存在。 EB HBV HPV
３ 神经内分泌学：检查编码调节肽的mRNA,
确定激素的合成部位。
４ 病理学：癌基因表达。
５ 免疫学： Ag基因定位 ６ 发育生物学：基因的选择表达 原位杂交：mRNA （转录） 免疫组化：蛋白（翻译） ７ 其他：细胞外基质蛋白的来源。 胶原基因表达，Ig起源细胞
原位杂交
In situ hybridization
于 丽
一、概 述
Gall和Pardue于1969年建立。
应用于组织学、病理学、遗传学、微生物 学等多种生命学科。
检测组织细胞本身的或外源的DNA或RNA 序列。从基因水平认识疾病的本质，且在组 织细胞原位显示，有助于诊断或研究信息。
临床应用于病毒性疾病、遗传性疾病等。
A
C
B
D
原位杂交
(In situ hybridization ）
应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针
与组织、细胞中待测的核酸按碱基配对的原则
进行特异性结合，形成杂交体，然后再应用与
标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫
组织化学方法在核酸原有位置进行细胞内定位。
1.核酸分子杂交技术
单链的核酸分子在合适的温度和离
双链DNA
原位杂交实验流程
原位杂交实验流程
原位杂交实验是一种将核酸探针与细胞或组织切片上的DNA或RNA进行杂交，从而对特定核酸进行定位和定量分析的方法。
以下是原位杂交实验的一般流程：
1. 样品制备：获得待检测的样品，可以是细胞、组织、细胞核或染色体等。
样品需要进行处理，包括固定、脱水和烘干等步骤，以便于后续的处理。
2. 探针制备：探针是一段具有特定序列的DNA或RNA，用于检测样品中的特定序列。
可以通过化学合成或PCR扩增等方法制备探针。
探针需要标记一定的标记物，如荧光素或辐射性核素等，以便于检测。
3. 杂交反应：将制备好的探针与处理好的样品进行杂交反应。
反应条件包括温度、盐浓度、pH值等，需要根据探针和样品的特性进行调整。
杂交后，探针会与样品中的特定DNA序列结合，并形成探针-目标DNA复合物。
4. 洗涤：杂交后，需要用洗涤液将未结合的探针洗去，以减少背景信号。
洗涤条件需要根据探针和样品的特性进行选择。
5. 检测：在洗涤后，通过特定的检测方法对探针-目标DNA复合物进行检测。
常用的检测方法包括荧光显微镜观察、放射自显影、免疫组织化学染色等。
6. 结果分析：根据检测结果，对杂交信号进行分析和解释。
通常需要比较杂交信号与已知标准品的信号，以确定样品中是否存在目标核酸序列。
7. 实验重复：为了确保结果的可靠性和准确性，通常需要进行重复实验，并对不同实验条件下的结果进行比较和分析。
总之，原位杂交实验需要精心设计和严格控制实验条件，以确保结果的准确性和可靠性。
染色体原位杂交名词解释
染色体原位杂交名词解释
嘿，你知道啥是染色体原位杂交不？这可真是个超级有趣的玩意儿！
染色体原位杂交呀，就好像是在细胞这个大舞台上，给特定的染色
体贴上独特的标签。
比如说，想象一下细胞就像是一个巨大的拼图游戏，而染色体就是那些拼图块。
原位杂交呢，就是我们手里拿着特定
的标记，去精准地找到我们想要的那块拼图，然后给它做个特别的记号。
咱来具体说说哈，它其实就是利用标记的核酸探针与细胞或组织切
片中的核酸进行杂交。
这就好比是一场精心安排的约会，核酸探针就
是那个满怀期待去找心仪对象的人，而细胞或组织中的核酸就是等待
的另一方。
它们相遇了，结合在一起，就产生了奇妙的反应。
“哎呀，这有啥用呀？”你可能会这么问。
嘿，用处可大了去了！它
能帮助我们检测特定基因的位置呀，就像是在茫茫人海中一下子找到
那个特别的人。
还能研究染色体的结构和变化呢，就像侦探一样，去
探寻细胞里的秘密。
在医学领域，它可是大显身手哦！可以帮助诊断疾病，比如某些遗
传性疾病，那不就像是给疾病这个小坏蛋贴上了显眼的标签，让医生
们能快速发现它嘛！
在科研中，染色体原位杂交更是不可或缺的好帮手。
科学家们用它
来解开一个又一个的谜团，探索生命的奥秘。
总之，染色体原位杂交就像是一把神奇的钥匙，能打开细胞世界里
无数的秘密大门。
你说，它是不是超级厉害？是不是让你特别感兴趣，想要更深入地了解它呀？
我的观点就是：染色体原位杂交是一项非常重要且极具价值的技术，对我们理解生命现象和解决实际问题都有着不可替代的作用。
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杂交技术的原理
杂交：核苷酸序列通过Watson-Crick碱基配对 原则形成稳定的杂合双链核酸分子的过程，称 为杂交。
杂 交 的 三 种 形 式 ： DNA-DNA,DNA-RNA 和 RNA-RNA，其稳定性依次增大。
检测对象：提纯的核酸和细胞内的原位的核酸。
核酸分子杂交具有很高的灵敏度和高度的特异 性。主要应用有：克隆基因的筛选、酶切图谱 的制作、基因组中特定基因序列的定位、定性、 定量检测、特定基因的时空表达模式和疾病的 诊断等方面。
体外转录法合成RNA探针
A、质粒提取（彻底抽提蛋白，避免有机溶剂残留）
B、酶切（酶切位点的选择原则）： 使合成的探针长度在200bp-1000bp； 切勿形成 3’overhang；尽量选常见的酶；分清编码链和模板链。
C、酶切产物的回收 胶回收或沉降回收（回溶或洗脱时要用DEPC处理的水，切勿 混入超过0.1M的EDTA）。
TAA
ATT
5’
3’ 5’ Sp6
如果插入方向如图A，则反义探针的合 成，应用限制性内切酶在靠近T7启动子 的位置将质粒线性化，然后用SP6 RNA 聚合酶来合成探针
TAC
ATG
5’
5’
TTA
3’
AAT
3’
3’
CAT
3’
GTA
5’
5’
T7
B
Sp6
如果插入方向如图B，则反义探针的合成， 应用限制性内切酶在靠近SP6 启动子的位 置将质粒线性化，然后用 T7 RNA聚合酶 来合成探针
Whole mount in situ hybridization
实验方法
3、杂交 杂交液：50%甲酰胺，0.1mg/ml肝素，
1×SSC，1×Denhart’s，0.1% Tween， 5mM EDTA，0.25mg/ml 酵母tRNA。 杂交条件：50-60度，12－20hr。
Whole mount in situ hybridization
Whole mount in situ hybridization
Trouble shooting
无信号： 1、胚胎固定不好，RNA降解； 2、渗透处理不够，探针没能充分进入胚
胎； 3、杂交温度过高； 4、洗脱条件过于苛刻
Whole mount in situ hybridization
体外转录法合成RNA探针
3、探针纯化
A、用0.1倍体积4M LiCl，2.5倍体积无水乙醇 沉淀RNA，再经75％乙醇清洗RNA沉淀，回溶 在DEPC处理的水中，加入RNA酶抑制剂，保 存于-70度
B、用mini quick spin RNA columns（Roche） 直接纯化。
体外转录法合成RNA探针
实验方法
4、杂交后洗脱（温度和盐浓度）
杂交液
60°C 15 min
Wash1 5×SSC 50% 甲酰胺 0.5%SDS 0.05%Tween-20 60°C 20 min×2
Wash2 2×SSC 50% 甲酰胺 0.4%SDS 0.05%Tween-20 37°C 15 min×2
Wash3 2×SSC
探针的分类： 核酸的性质: DNA探针
RNA探针 是否使用放射性标记物:放射性标记探针
非放射性标记探针 (DIG、荧光素和生物素) 是否存在互补链:单链探针
双链探针。
特点：单链探针较双链探针杂交时效率更高； RNA探针一般为单链, 具有单链DNA探针的优 点, 另外RNA:DNA杂交体比DNA:DNA杂交体 有更高的稳定性,所以在杂交反应中RNA探针 比相同比活性的DNA探针所产生信号要强。
体外转录法合成RNA探针
DIG标记的RNA探针。 许多载体如pBluescript, pGEM等均带有
来自噬菌体的SP6、T7或T3的启动子,它 们能特异性地被各自噬菌体编码的依赖 于DNA的RNA聚合酶所识别，合成特异 性的RNA。在反应体系中若加入经DIG 标记的NTP，则可合成RNA探针。
37°C 20 min 60°C 5 min×3 37°C 20 min×2 37°C 20 min×2
Whole mount in situ hybridization
实验方法
5、抗DIG抗体孵育
Blocking buffer 1hr； Antibody solution 1hr （1：2000稀释）。
探针制备
选择探针的原则
探针应对应着mRNA的特异区域 • 长度（200-1000 bp） • 3‘-UTR? • 与其它序列的同源性有较低或无同源性
1、模板的制备
方法一、制备质粒模板 方法二、PCR法： 在引物中引入启动子序列，聚合酶选用高 保真、末端不加A的酶。
体外转录法合成RNA探针
目的片段克隆到载体(pGEM-T Easy) 将PCR产物与T Easy连接，连接是非定向 的，需要测序确定连接的方式。
体外转录法合成RN2A、探针体外转录
试剂及材料 溶于DEPC处理水中的线性化质粒 含DIG标记的NTP Mix 转录缓冲液（5×） RNA聚合酶（SP6、T7或T3） DTT RNA酶抑制剂
体积（20ul） >1ug in 10ul 水中 2ul 4ul 2ul 2ul 0.5ul
混匀后37度2小时 加2ul DNase 1 (RNase-free)，37度15分钟，消化DNA模板 加入2ul EDTA（pH8.0）终止反应。
HCl, pH 9.5） NBT/BCIP显色液(硝基四氮唑蓝/5-溴-4-氯-3-
吲 哚 氧 磷 酸 盐 ): NBT 0.33mg/ml; BCIP 0.16mg/ml; 1mM 左旋咪唑, 暗处显色
Whole mount in situ hybridization
实验方法
照相记录结果
Whole mount in situ hybridization
体外转录法合成RNA探针
体外转录法合成RNA探针
探针制备中的关键问题
1、RNase free 2、酶切位点的选择 3、质粒模板的质量
体外转录法合成RNA探针
Trouble shooting
1、无探针合成可能原因 A RNase 污染 B 酶切位点选择错误 C 质粒质量不好 D 模板中混有过多EDTA
Trouble shooting
阴性对照有信号： 1、探针的特异性差； 2、杂交条件不够严谨； 3、洗脱条件不严谨。
实验操作
PBST（PBS+0.1%Tween）洗 15min×5次。 Coloration buffer 洗5min×2 次 Detection buffer 洗5 min NBT/BCIP stock solution 20 ul稀释到1ml
冲击胚胎。
杂交中的关键问题
对照的设定 A、为了说明组织RNA的完整性，用管
家基因探针或Poly d（T）探针做阳性对 照。 B、为了说明探针和目的基因的结合是特 异的，用正义探针做阴性对照。
Whole mount in situ hybridization
杂交中的关键问题
胚胎的渗透处理： 信号VS胚胎完整性 需实验来摸索
实验方法
1、胚胎的固定和水化 4%PFA固定胚胎，梯度脱水后保存于-20 度。 将保存于70%乙醇的胚胎经70%乙醇-50% 乙醇-30%乙醇-DEPC处理的水-PBST梯度 水化。
Whole mount in situ hybridization
实验方法
2、胚胎的前处理 渗透处理：
10ug/ml 蛋白酶K-TE缓冲液（pH8.0） 37度 5min-15min；经2mg/ml的甘氨酸终止反应。 后固定 4% PFA 室温固定1小时。 乙酰化处理(可选，降低静电效应，减少非特异 性染色) 在0.1mol/L三乙醇胺(pH8.0)-0.4%（v/v）乙酸 酐中孵育10min。
Double Strand DNA
5’
3’
3’
5’
5’
3’
mRNA synthesis direction
体外转录合成反义探针的模板（原位杂 交所用的探针）是DNA的编码链
体外转录合成正义探针（原位杂交中的 阴性对照）的模板是DNA的模板链
ATT
TAA
5’
5’
ATG
3’
TAC
3’
T7
A
3’
特点：优点是可以显示、比较许多特定基因的分布情 况，缺点是无法显示其相对量的情况，可能与蛋白表 达位置不符，不能鉴定选择性剪切的产物，费时、一 定的技术难度。
整体原位杂交已经成为基因表达定位和表达分布模式 研究的一种重要手段。该技术能在整体水平上精确地 研究胚胎发育过程中基因表达的三维信息。
体外转录法合成RNA探针
Whole mount in situ hybridization
实验方法
6、显色 Coloration buffer: 100mM NaCl; 50mM MgCl2;
100mM (Tris-HCl pH9.5); 0.1% Tween-20。 Detection buffer: 100mM NaCl, 100mM (Tris-
0.1%Tween-20 37°C 5 min×2
Whole mount in situ hybridization
实验方法
4、杂交后洗脱-RNase 消化
RNase 20ug/ml RNaseA+ 10U/ml RNaseT1 Wash3 2×SSC 0.1%Tween-20 Wash3 2×SSC 0.1%Tween-20 Wash4 0.2×SSC 0.1%Tween-20
体外转录法合成RNA探针
Trouble shooting
2、探针的分子量不对 原因：A 用DNA marker检测