抗狂犬病血清生产工艺及检查
人用浓缩狂犬病疫苗制造及检定规程
人用浓缩狂犬病疫苗制造及检定规程本品系用狂犬病固定毒（aG）适应株接种原代地鼠肾单层细胞，培养后收获病毒液，加入甲醛溶液灭活后浓缩，再加氢氧化铝制成。
用于预防狂犬病。
1 毒种1.1 毒种来源狂犬病固定毒aG适应株系用狂犬病固定毒北京株先在地鼠肾细胞传代适应后，再通过豚鼠脑内交替传代适应而成。
由中国药品生物制品检定所检定、保存与分发。
生产用毒种传代应不超过10aG交替代。
1.2 毒种检定无菌试验aG毒种每次传代收剖后均须做无菌试验，合格者方可使用。
病毒滴定aG毒种用体重11～13g小白鼠进行脑内病毒滴定，滴度方可用于生产。
纯毒试验生产前和生产末期用小白鼠做脑内法中和试验，以鉴定毒种的特异性。
所用特异性抗血清由中国药品生物制品检定所提供。
中和指数必须在500以上。
生产过程中如对毒种发生疑问，应及时进行鉴定。
1.3 毒种传代选择体重120～160g健康豚鼠，脑内注射，选潜伏期80～100小时具有典型狂犬病症状者放血致死，无菌取脑。
豚鼠脑连续传代不超过5代。
1.4 毒种保存供生产用aG株在-60℃以下保存，不得超过1年。
2 疫苗制造2.1 细胞制备地鼠选用12～14日龄健康地鼠，如腹腔有充血、渗出液、肾脏异常等应废弃。
解剖处死地鼠，用消毒液洗涤皮毛数次，末次浸泡一定时间，无菌取肾，置于瓶中剪碎。
细胞消化及分装将剪碎肾块洗涤数次，加入适量胰蛋白酶消化液，置2～8℃过夜（约16～20小时）或37℃水浴消化适当时间，弃去消化液，经洗液洗涤2～3次，振摇或吹打分散细胞，加入适量生长液，分装培养瓶，置3 7℃℃培养长成单层。
使用液体均不得含青霉素或其他β内酰胺类抗生素。
生长液为含不超过10%小牛血清水解乳蛋白SMI液或其他适宜培养液，可加入适量抗生素。
浸泡液为水解乳蛋白SMI液或其他适宜培养液，其中保护剂可选用0.1%以上人白蛋白，可加入适量抗生素。
维持液为199或其他适宜的溶液，其中保护剂中可选用0.4%以上人白蛋白，可加入适量抗生素。
狂犬病免疫球蛋白制造及检定规程
狂犬病免疫球蛋白制造及检定规程本品系由乙型肝炎疫苗免疫后，再经狂犬病疫苗免疫的献血员中采集狂犬病抗体效价较高的血浆，经低温乙醇法提制的特异性免疫球蛋白制剂。
本品所含丙种球蛋白占总蛋白量的90%以上，每ml含狂犬病抗体效价不低于100IU。
主要用于狂犬病的预防。
1 制造1.1 制造要求1.1.1 原料血浆应符合《原料血浆采集（单采血浆术）规程》中11项要求。
1.1.2 狂犬病疫苗免疫按卫生部批准的免疫程序进行。
所用抗原应符合《人用狂犬病浓缩疫苗制造及检定规程》要求。
免疫后血样用酶标法或蚀斑法或小鼠脑内中和试验测定抗体效价，达到10Iu /ml以上者即可采集免疫血浆作为原料。
在末次免疫后半年中，可每间隔2周采浆一次，每次400ml。
1.1.3 原料血浆应无热原污染，并保持无菌。
不能及时投料制备时，应及时置-20℃以下冻存。
冻存期最长不应超过1年。
1.1.4 制造工作室、冷库及各种生产用具等要求同《人血白蛋白（低温乙醇法）制造及检定规程》中1.1.3项。
1.1.5 生产用水应符合饮用水标准，直接用于制品的水应符合注射用水标准。
所用各种化学药品应符合《中国生物制品主要原材料试行标准》，未纳入试行标准者应不低于化学纯。
1.2 制造工艺1.2.1 采用低温乙醇法，可加适宜稳定剂。
若加防腐剂硫柳汞，其含量不得超过0.009%(g /ml)。
1.2.2 分批每批制品最少应由100名以上免疫献血员的血浆混合制成。
同一制造工艺、同一容器溶解、稀释的制品作为1批；用不同滤器除菌过滤或不同机柜冻干的制品分为亚批。
1.2.3 半成品检定除菌过滤后每批半成品应进行理化检定、抗体效价测定、无菌试验及热原质试验，其方法及要求同成品检定。
1.2.4 冻干除菌过滤的制品应及时分装，并按《人血白蛋白（低温乙醇法）制造及检定规程》中1.2.5项进行冻干。
制品温度不得超过35℃。
1.3 剂型与规格剂型：分为冻干及液体两种。
规格：狂犬病抗体效价应不低于100Iu /ml。
狂犬疫苗的生产工艺
狂犬疫苗的生产工艺狂犬疫苗是用于预防狂犬病的重要疫苗。
狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种严重传染病，患者一旦感染极易死亡。
因此，狂犬疫苗的生产工艺至关重要。
首先，狂犬疫苗的生产工艺开始于病毒分离。
研究人员通过采集狂犬病患者的体液样本，特别是唾液和脑组织样本。
然后，将这些样本接种到实验动物身上，如小白鼠或小狗，让病毒在这些动物体内复制增殖。
一旦病毒分离成功，研究人员将在实验室中对病毒进行培养。
接下来，狂犬病病毒经过培养后，会将病毒制备成病毒抗原。
这个过程包括病毒的提取和纯化。
研究人员将培养液离心分离出病毒，然后使用一系列的化学和生物技术手段，如超离心、凝胶过滤和柱层析等，将病毒纯化为高纯度的病毒抗原。
然后，研究人员将病毒抗原灭活，使其失去活性。
这样做的目的是防止病毒抗原在后续的疫苗生产过程中继续复制和感染宿主。
通常，病毒抗原会经过一定的时间和温度处理，以确保病毒完全失活。
灭活后的病毒抗原具有一定的免疫原性，可以引起人体产生免疫应答。
接着，灭活的病毒抗原会与辅助物质混合，以提高疫苗的免疫效果。
这些辅助物质包括佐剂和防腐剂等。
佐剂可以增强疫苗的免疫原性，使得疫苗具有更好的免疫效果；防腐剂则用于防止疫苗在保存和使用过程中受到污染和损坏。
最后，疫苗会进行灌装和包装。
研究人员将制备好的疫苗按照一定的剂量装入瓶子中，并进行密封。
通常狂犬疫苗以液体形式保存，因此密封瓶子的选择和密封工艺非常重要，以确保疫苗在贮存期间不受污染和破损。
总结起来，狂犬疫苗的生产工艺包括病毒分离、培养和纯化、病毒灭活、加入辅助物质、疫苗灌装和包装等步骤。
通过严格的工艺控制和质量检验，研究人员可以生产出高质量的狂犬疫苗，为狂犬病的预防提供有效的手段。
抗狂犬病血清生产简介
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(三)免疫方法
❖ 基础免疫：从马体初次接受免疫原刺激， 到产生少量特异性抗体的阶段即第一次免 疫应答阶段。 ❖ 超免疫：基础免疫以后的强化免疫。
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有了第一次免疫应答后，再次接触同一免疫原 就会迅速出现第二次免疫应答。抗血清效价将会 急剧上升。 对超免成功的马匹予以采血并开始 再次免疫注射，如此反复的每一循环通称“1 程”、“2程”……超免疫。
1．安全性
主要指制品污染的杂质引起的副作用。 例如细菌、热原质、类A血型物质以及其 它毒性物质等， 2019年版《药典》三部中 都有具体的检定方法并规定有最低要求标 准(参阅2019年版《药典》三部)。
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2．纯度及比活性
由于马匹免疫方法及抗血清精制方法的 改进，抗血清的纯度(免疫球蛋白的纯一性) 与比活性(每g蛋白所含单位数)均有显著的 提高，这些是代表精制抗毒素质量的主要 指标，2019年版《药典》三部中均有检查 方法及要求标准的规定。
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层析技术
抗血清纯度提高 从 50%--60% 提高到80%以上。
比活性 从 <4000 IU/g 提高到 > 10000 IU/g以上。
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抗狂犬病血清工艺流程
免疫血浆 ← 马匹检疫、免疫、基免、超免、 采血、血浆分离
↓ 血浆精制 ← 去除杂蛋白
↓ 胃酶消化 ← 切去Fc端
↓ 第一次沉淀 ← 硫酸铵沉淀、去除Fc端 及加热处理
↓
↓ 第二次沉淀 ← 硫酸铵沉淀 明矾沉淀
↓ 纯化
↓
浓缩
↓ 最后处理
↓
↓ 原液检定
↓ 半成品配制及除菌
↓ 半成品检定
狂犬疫苗生产工艺
狂犬疫苗生产工艺狂犬疫苗是一种用于预防狂犬病的疫苗，它是通过制备、培养和灭活狂犬病病毒并进行灭活制剂的制备来实现。
狂犬疫苗的生产工艺如下。
首先，需要准备狂犬病病毒株。
目前常用的狂犬病毒株有血清媒介的毒株和组织培养的毒株。
在生产中，选择某一株病毒，通过传代培养和扩增来获得病毒种子。
接下来，需要将病毒株接种到合适的细胞种子上。
常用的细胞种子包括鸟胚细胞、绵羊肾细胞和Vero细胞等。
将病毒株接种到细胞种子后，保持一定的温度、PH值和营养液条件下进行培养。
当病毒感染细胞后，需要经过一定的时间来扩增病毒的数量。
此时应定期检测细胞内是否存在有效的病毒感染。
当细胞内病毒感染达到一定水平后，需要对细胞进行破碎以释放病毒。
一般的方法有冻融法、超声波法和酶解法等。
破碎后，通过离心和过滤等方法来获得病毒液。
获得病毒液后，需要对病毒进行灭活。
常用的灭活剂有用酸亚硫酸、β-普萘酚和乙醚等。
灭活的时间和灭活剂的浓度等关键因素需要进行严格的控制，以确保病毒完全失活。
完成灭活后，病毒液需要进行精制和纯化。
常用的方法有沉淀法、硝酸盐法、硫酸铵法和超滤法等。
通过这些方法可以去除污染物和无效成分，从而得到纯净的病毒灭活制剂。
最后，将纯化的病毒灭活制剂进行配制和包装。
一般将其加入到适当的稳定剂中来延长疫苗的保质期，并使用适当的容器进行包装和密封。
以上就是狂犬疫苗的生产工艺概述。
狂犬疫苗生产工艺需要在严格的细胞培养和病毒操作条件下进行，以确保病毒的纯净性和有效性。
在生产过程中，需要严格控制各个环节的参数和操作，以确保疫苗的质量和安全性。
抗狂犬病血清
抗狂犬病血清Kangkuangquanbing XueqingRabies Antiserum本品系由狂犬病病毒固定毒免疫马所得的血浆，经胃酶消化后纯化制得的液体抗狂犬病球蛋白制剂。
用于配合狂犬病疫苗预防狂犬病。
1基本要求生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2制造2.1抗原与佐剂应符合“免疫血清生产用马匹检疫和免疫规程”的规定。
2.2免疫动物及血浆2.2.1免疫动物免疫用马匹必须符合“免疫血清生产用马匹检疫和免疫规程”的规定。
2.2.2免疫、采血及分离血浆与分浆按“免疫血清生产用马匹检疫和免疫规程”的规定进行。
免疫血清效价用动物法或其他适宜的方法测定，不低于100IU/ml时，即可采血。
分离之血浆可加入适宜防腐剂，并应做无菌检查（附录Ⅻ A）。
2.3胃酶进行类A血型物质含量测定，应不高于4μg/ml（附录Ⅸ I）。
2.4原液2.4.1原料血浆原料血浆的抗狂犬病效价应不低于80IU/ml(附录Ⅺ J)。
血浆在保存期间，如发现明显的溶血、染菌及其他异常现象，不得用于制备。
2.4.2制备2.4.2.1消化将免疫血浆稀释后,加入适量胃酶及甲苯，调整适宜pH值后，在适宜温度下消化一定时间。
2.4.2.2纯化采用加温、硫酸铵盐析、明矾吸附等步骤进行纯化。
2.4.2.3浓缩、澄清及除菌过滤浓缩可采用超滤或硫酸铵沉淀法进行。
澄清及除菌过滤后，制品中可加入适量硫柳汞或间甲酚或三氯甲烷作为防腐剂。
纯化后的抗血清原液应置2～8℃避光保存至少1个月作为稳定期。
2.4.3原液检定按3.1项进行。
2.5半成品2.5.1配制将检定合格的原液，按成品规格以灭菌注射用水准确稀释，调整效价、蛋白质浓度、pH值及氯化钠含量，除菌过滤。
2.5.2半成品检定按3.2项进行。
2.6成品2.6.1分批应符合“生物制品分批规程”规定。
2.6.2分装应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
2.6.3规格每瓶2.0ml，含狂犬病抗体应不低于400IU；每瓶5.0ml，含狂犬病抗体应不低于1000IU。
免疫学实验课件：狂犬病病毒(dG株)的批量生产及其检验
目的和意义
❖ 本研究阐明了该dG株灭活疫苗的批量生产及其检验 的方法步骤及结果，为今后的大规模生产制定了标 准流程，为投入社会使用提供数据总结参考。
❖ 为进一步完善该dG株灭活疫苗奠定了数据基础。
种毒的 生产
研究内容
种毒的 检验
扩大生产
质量检验
结果分析-种毒的检验
❖ 病毒滴度检测：共生产基础毒种3批，共计100ml，每批抽取 样品，检测种毒滴度，置于荧光显微镜下观察荧光斑点，用 karber方法计算结果。
结果分析-种毒的检验
❖ 种毒毒力检测：攻毒后观察记录实验小鼠的死亡率，以统计 学方法计算各稀释度死亡小鼠的百分率，按以Reed-Muench 法计算毒种的乳鼠半数致死量（LD50）。
结果分析-种毒的检验
种毒毒力检测
结果计算： 稀释因子是10，起始稀释是10-6 对数差=（66.7-50）÷(66.7-20)×lg10=16.7÷46.7×1=0.36 因为小鼠死亡率随病毒稀释度增加而下降，所以50终点稀释小
狂犬病病毒（dG株）的 批量生产及其检验
报告主要内容
❖ 立题依据
❖ 目的意义
❖ 研究内容
❖ 结果分析
❖ 全文总结
❖致
谢
立题依据
❖ 狂犬病俗称“疯狗病”，是由狂犬病病毒引起的 人兽共患中枢神经系统传染病，是迄今为止人类 唯一病死率高达100%的急性传染病。
❖ 在我国狂犬病仍然是一个严重的公共卫生问题， 疫情的防治已刻不容缓。
❖ 华南农业大学兽医学院微生物实验室已成功拯救获得狂犬病 毒Hep-Flury-dG嵌合病毒，对其进行生物学特性研究，结果 表明Hep-Flury-dG株和rHep-Flury株比较，其致病性降低、免 疫原性提高。
狂犬疫苗生产工艺设计
狂犬疫苗生产工艺设计引言狂犬疫苗是一种预防狂犬病的生物制剂。
狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的急性传染病，可通过狗类等感染动物的咬伤传播给人类，严重威胁着公众健康。
狂犬疫苗的生产工艺设计是确保疫苗质量和有效性的关键步骤。
本文将介绍狂犬疫苗生产工艺设计的一般概念和步骤。
工艺设计的目标狂犬疫苗生产工艺设计的主要目标是确保生产出的疫苗符合国家和国际质量标准，并具有一致的质量、安全性和有效性。
具体目标包括：- 确保疫苗生产过程的可控性和可重复性；- 最大程度地减少污染和交叉污染的风险； - 确保疫苗的成分和配方得到准确控制； - 确保工艺参数和操作方法得到准确记录和控制。
工艺设计的步骤狂犬疫苗生产工艺设计包括以下步骤：1. 根据疫苗类型和用途确定工艺参数工艺参数是指影响疫苗制备和质量的关键变量，如温度、pH 值、反应时间等。
在工艺设计的第一步，需要根据疫苗类型和用途确定合适的工艺参数。
2. 确定原材料和媒体配方狂犬疫苗的制备需要使用特定的原材料和媒体。
在工艺设计的第二步，需要确定原材料和媒体的配方，确保其符合质量标准和疫苗制备要求。
3. 设计疫苗制备工艺流程根据确定的工艺参数和原材料配方，需要设计疫苗制备的工艺流程。
这包括病毒培养、病毒扩增和病毒灭活等步骤。
工艺流程应具备合理的时间和操作要求，以确保疫苗生产过程的可控性和有效性。
4. 开展验证实验和优化在完成疫苗制备工艺流程设计后，需要进行验证实验和优化。
这些实验可以通过小规模试验或中试来进行，以评估工艺的可行性和效果，并进行必要的调整和优化。
5. 制定标准操作程序（SOP）标准操作程序（SOP）是确保工艺在实际生产中得到准确执行的关键文件。
在工艺设计的最后一步，需要制定相应的SOP，明确每个步骤的操作规程、工艺参数和记录要求，以便操作人员按照标准程序进行操作。
结论狂犬疫苗生产工艺设计是确保疫苗质量和有效性的关键步骤。
通过确定合适的工艺参数、原材料配方和制备工艺流程，以及进行验证实验和制定SOP，可以确保疫苗的质量和安全性，有效预防和控制狂犬病的传播。
冻干抗狂犬病血清
用法用量
用法：受伤部位应先进行处理。若伤口曾用其他化学药品处理过时，应冲洗干净。先在受伤部位进行浸润注 射，余下的血清进行肌内注射。（头部咬伤可注射于颈背部肌肉）。
用量：注射量均按体重计算，每1kg体重注射40IU（特别严重可酌情增至80～100IU），在1～2日内分次注射， 注射完毕后开始注射狂犬病疫苗。亦可同时注射狂犬病疫苗。
简介
冻干抗狂犬病血清拼音名：Donggan Kangkuangquanbing Xueqing 英文名：Lyophilized Antirabies Serum 本品系用狂犬病固定毒免疫的马血浆，经酶消化、盐析、冻干制成。
制法
照抗狂犬病血清项下的方法制备，灌装后立即冷冻干燥制成。
性状
本品为白色或乳白色的疏松体。加入规定量的灭菌注射用水，应在15分钟内溶解为无色或淡黄色的澄明液体。
3.使用抗血清须特别注意防止过敏反应。注射前必须做过敏试验并详细询问既往过敏史。凡本人及直系亲属 曾有支气管哮喘、枯草热、湿疹或血管神经性水肿等病史，或对某种物质过敏，或本人过去曾注射马血清制剂者， 均须特别提防过敏反应的发生。
（1）过敏试验：用氯化钠注射液将抗血清稀释10倍（0.1ml抗血清加0.9ml氯化钠注射液），在前掌侧皮内 注射0.05ml，观察30分钟。注射部位无明显反应者，即为阴性，可在严密观察下直接注射抗血清。如注射部位出 现皮丘增大、红肿、浸润，特别是形似伪足或有痒感者，为阳性反应，必须用脱敏进行注射。如注射局部反应特 别严重或伴有全身症状，如荨麻疹、鼻咽刺痒、喷嚏等，为强阳性反应，则应采用脱敏注射，并做好抢救准备， 一旦发生过敏休克，立即抢救。无过敏史者或过敏反应阴性者，也并非没有发生过敏休克的可能。为慎重起见， 可先注射小量于皮下进行试验，观察30分钟，无异常反应，再将全量注射于皮下或肌内。
精制抗狂犬病血清3效价IU测定方法
精制抗狂犬病血清3效价IU测定方法1 中和用病毒悬液的制备要求中和用病毒悬液经37℃水浴作用1小时的LD50在32～320之间。
1.1病毒株的选择：选用CVS毒种。
1.2 病毒株的传代：取CVS毒种（一般为冻干毒种）制成10-2悬液，脑内接种体重10～12g健康小白鼠0.03ml，待发病后取脑再制成10-2悬液，接种于小白鼠脑内进行传代，一般传至2～3代即可制成冻干中和用病毒或–70℃冻存的中和用病毒，但要选用小白鼠在第5天发病并麻痹的服制备。
1.3 冻干病毒的制备：用第5天发病并麻痹的鼠脑以脱脂牛乳研磨稀释成20%的脑悬液，按0.5ml分装安瓿冻干后真空封口，存-30℃待用。
1.4-70℃冻存病毒的制备：用第5天发病并麻痹的鼠脑用20%小牛血清磷酸盐缓冲液研磨稀释成10-1悬液，经2000r/min20分钟沉淀，取上清混匀后分装小管，存-70℃冰箱待用。
1.5 病毒悬液的预测1.5.1冻干病毒的预测：取含20%脑悬液的冻干病毒，启开后加入含2%小牛血清PBS1.0ml，吹打均匀后再用4.0ml上述稀释液与病毒液充分混匀，1500r/min沉淀10分钟，取上清与等量的稀释液混合则为10-2悬液，然后再用10-3、10-4、10-5、10-6稀释，从10-6至10-2各取0.5ml加入5个小管内，每管再加入2%小牛血清PBS0.5ml，放置37℃水浴一小时。
用体重10~12g小白鼠30只，分成5组，每组6只，经用37℃作用的10-6至10-2病毒悬液接种小白鼠，每个稀释度接种6只小白鼠，每只小白鼠脑内接种0.03ml，观察14天，每天观察小白鼠发病死亡情况，接种后4天内死亡的小白鼠按非特异性死亡计。
以接种5天后的发病死亡小白鼠统计LD50。
1.5.2-70℃冻存病毒悬液的预测：取含10%脑悬液的冰冻病毒用流水融化后即为10-1悬液，然后再做10-2至10-7稀释。
从10-7至10-3各取0.5ml加至5个小管内，每管再加入2%小牛血清PBS0.5ml，放置37℃水浴1小时，用体重10～12g小白鼠30只，分成5组，每组6只，用经37℃作用的10-7至10-3病毒悬液接种小白鼠，每个稀释度接种小白鼠6只，每只小白鼠脑内接种0.03ml，观察14天，每天观察小白鼠发病死亡情况。
狂犬病病毒抗原的浓缩及纯化工艺的研究
狂犬病病毒抗原的浓缩及纯化工艺的研究
张 宁 龚本义 刘冬禹 杨丹丹 殷玉和 吴丛梅 *
（长春工业大学 化学与生命科学学院，吉林长春 130012）
摘 要：[ 目的 ] 研究狂犬病病毒纯化抗原生产工艺。[ 方法 ] 通 40~55% 间有白色条带，用试剂盒进行检测确定此条带为纯化狂
过对聚乙二醇（PEG）沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化、Zn 犬病病毒。
（AC）2 沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化、Zn（AC）2 沉淀浓 缩及 Sepharose 4 Fast Flow 分离纯化三种方法制备狂犬病病毒纯化 抗原进行比较。[ 结果 ]Zn（AC）2 沉淀浓缩后蔗糖密度梯度离心 纯化抗原与 Sepharose 4 Fast Flow 纯化抗原收获蛋白总量无明显差 异。PEG 沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化抗原制备的检测试纸
2020 年 7 月下 实验研究
表 2 不同病毒抗原制备试纸条荧光强度
纯化方法
1
2
3
荧光强度
7869
15602
16019
注：同表 1 4 结论
通过上述 3 种纯化方法制备狂犬病病毒抗原蛋白进行病毒含
量、纯度及与活性检验，考虑成本及工艺，选择 Zn（AC）2 沉淀 法浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化法制备狂犬病病毒抗原。此方法
注：1：PEG 沉 淀 浓 缩 及 蔗 糖 密 度 梯 度 离 心 纯 化 抗 原；
Ameresco 公司；Sepharose 4 Fast Flow 凝胶购自 GE Healthcare 公司； 2：Zn（AC）2 沉淀浓缩及蔗糖密度梯度离心纯化抗原；3：Zn（AC）2 沉
辣根过氧化物酶标记的兔抗犬 IgG 购自上海远慕生物科技有限公 淀浓缩及 Sepharose 4 Fast Flow 纯化抗原。
抗狂犬病血清效价测定法
抗狂犬病血清效价测定法第一法小鼠中和试验法（仲裁法）本法系根据抗狂犬病血清能中和狂犬病病毒的作用，将供试品与标准品做系列稀释，分别与狂犬病病毒悬液结合，小鼠脑内注射，在规定时间内观察小鼠存活和死亡情况，以测定供试品效价。
试剂（1）量取0.9%磷酸二氢钾溶液75ml、2.4%磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）溶液425ml、8.5%氯化钠溶液500ml，混合后加水至5000ml，调pH值至7.2～8.0。
于磷酸盐缓冲液98ml中，加入2ml灭能小牛血清，临用前配制。
（2）20％小牛血清磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钾1.2g、磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)20.8g，加注射用水溶解并稀释至1000ml，溶解后过滤，调pH至7.6。
灭菌后pH值应为7.2～8.0。
于磷酸盐缓冲液80ml中，加入20ml灭能小牛血清，临用前配制。
中和用病毒悬液的制备（1）病毒悬液的制备取CVS毒种(一般为冻干毒种)制成10-2悬液，制法见本法（2）项，脑内接种体重10～12g小鼠每只0.03ml，待发病后取鼠脑再制成10-2悬液，接种于小鼠脑内进行传代，一般传2～3代。
选用第5天发病并麻痹的鼠脑以脱脂牛乳研磨稀释成20%的脑悬液，按0.5ml分装安瓿,冻干后真空封口，制成冻干中和用病毒，-30℃冻存待用；或用第5天发病并麻痹的鼠脑用20%小牛血清磷酸盐缓冲液研磨稀释成10-1悬液，以每分钟2000转离心20分钟，取上清液混匀后分装小管，-70℃冻存待用。
（2）病毒悬液毒力的预测①冻干病毒的预测。
取含20%脑悬液的冻干病毒，启开后加入2%小牛血清磷酸盐缓冲液1.0ml，吹打均匀后加入4.0ml 2%小牛血清磷酸盐缓冲液与病毒液充分混匀，以每分钟1500转离心10分钟，取上清液与等量的2%小牛血清磷酸盐缓冲液混合即为10-2悬液，然后再稀释至10-3、10-4、10-5、10-6，从10-6至10-2的稀释液中各取0.5ml置于5个小管内，每管再加入2%小牛血清磷酸盐缓冲液0.5ml，置37℃水浴1小时。
抗狂犬病血清生产工艺及检查
抗狂犬病毒血清：由狂犬病毒固定毒免疫马所得的血浆，经胃酶消化后纯化制得。
生产工艺流程：1.原液：从免疫马匹（单采血浆术）获得免疫血浆，分离血浆(血浆精制:去除杂蛋白)（可加入适宜防腐剂），并做无菌检查即得原料血浆（其抗狂犬病效价应不低于80IU/ml）；免疫血浆稀释，加适量胃酶（用生理氯化钠溶液将胃酶配制成1mg/ml溶液），进行类A血型物质含量测定（通则3415，血凝抑制法），必要时可加适量甲苯，调整适宜PH值后，在适宜温度下消化一定时间(胃酶消化:切去Fc端)。
加热、硫酸铵盐析、明矾吸附进行纯化；超滤法或硫酸铵沉淀法进行浓缩，加适量防腐剂硫柳汞或间甲酚，然后澄清、除菌过滤后即得到原液。
2.半成品：合格原液按成品规格以灭菌注射用水稀释，调整效价、蛋白质浓度、pH值及氯化钠含量，除菌过滤。
3.成品：分批、分装、包装。
F(ab')2 ：Fragment antigen-binding即抗原结合片段。
抗体免疫球蛋白IgG经胃酶处理,切除pFc'段,纯化获得的F(ab')2。
图1被胃蛋白酶消化的抗体产生两个片段：F（ab'）2片段和pFc'片段。
免疫双扩散法：指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线；将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。
酶联免疫吸附试验(以下简称ELISA)：是酶免疫测定技术中应用最广的技术。
其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。
常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)，N，N，N’，N’四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联形成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
狂犬病毒基础知识及疫苗生产工艺分析
主代毒种库（ 4aG2）→豚鼠脑内传1代 （ 4aG3） →建立主工作毒种库
毒种制备工艺：
地鼠→消毒、解剖、取肾、消化→细 胞制备→接种病毒→洗换→收获病毒 液→灭活病毒→超滤浓缩→纯化→半 成品配制→洗瓶、灌装、轧盖→目检 →包装→入库
狂犬病毒的特点
1、狂犬病毒形状为子弹形，一端为椭圆形，另 一端平整。
2、狂犬病毒具有嗜神经性，主要在中枢神经内 繁殖。
3、狂犬病毒最初进入伤口时，不进入血液循环， 而是在被咬伤的肌肉组织中复制，然后侵入神 经系统。
4、狂犬病毒在神经轴中的移动速度约 5~100mm/天，如一定范围内（10um-2cm） 的轴突同时受感染，病毒移行速度甚至会更快。
7-10 10-20 21-28 1-3 3-6 6-12
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人用狂犬病疫苗 发展史
国外疫苗发展史
1882年，巴斯德成功在牛脑中分离到狂犬病毒株，并在兔 脑内连续传90代，成为固定毒。 1885年，巴斯德尝试研制减毒活疫苗 1911年，Semple在巴斯德的研究基础上，研制出脑组织 灭活疫苗； 1956年，Peck研究制备鸭胚疫苗（DEV）。该疫苗在美国 和其他国家用作狂犬病暴露后处理并广泛使用了27年，很少 观察到严重的副作用，但中和性抗体水平不如脑组织疫苗。 1964年，美国研制出人二倍体细胞疫苗，并于1978年开 始商品化，目前在美国、加拿大、大多数欧洲国家和几个亚 洲国家使用。 1984年由法国Merieun研究所研制成功Vero细胞疫苗
240～280ml/分钟，280nm紫外检测,收集 第一峰。 取样检定
抗狂犬病血清过敏试验护理规范
抗狂犬病血清过敏试验一、皮试液配制及试验方法取抗狂犬病血清0.1ml（每支5ml），以等渗盐水稀释至1ml，然后取0.1ml作皮内注射，观察20分钟后判断试验结果。
二、试验结果判断阴性：皮丘无改变，周围不红肿可用全量（5ml）作肌肉注射。
阳性：皮丘红肿、硬结、直径超过1cm及伴有全身不适，甚至出现过敏性休克。
若为阳性，应作脱敏注射。
三、脱敏注射法1．取抗狂犬病血清1ml加等渗盐水至10ml，分次注射；每一次1ml第二次2ml；第三次3ml；第四次4ml。
每隔15－20分钟皮下注射一次，每次注射后均需密切观察，无反应方可继续注射。
在脱敏过程中，如果病人有全身反应；如气喘、发绀、呼吸短促及过敏性休克时，应及时处理；如症状轻微，则待症状缓解后，酌情减少剂量，增加次数，直到注完。
脱敏注射完毕，即可注射抗狂犬血清。
2．抗狂犬血清用量、用法：按每公斤体重0.5计算，成人一般注射量为25－30ml（病情特别严重者可酌情加倍剂量注射）。
在被咬伤后三天内分次肌肉注射完。
受伤部位也应进行局部浸润注射，如咬伤头部，可注射颈、背部肌肉。
四、注意事项1．凡有哮喘、枯草热或一周前曾注射马血清，如TAT, 以及直系亲属有过敏病史者，都应特别提防过敏性休克的发生。
2．如果发生休克，立即抢救，抢救法与过敏性休克的抢救相同。
3．在注射抗狂犬疫苗前必须注射抗狂犬病血清。
附一：半合成广谱抗生素过敏试验法（表11－3）表11－3半合成广谱抗生素过敏试验法附二：头孢唑啉钠皮试液的配制0．5g/瓶加等渗盐水至5ml －→0.1g/ml取0.1ml瓶加等渗盐水至5ml －→2mg/ml取0．15g/瓶加等渗盐水至5ml －→60μg/ml“ID”0.1ml(6μg)附三；半合成青霉素（氨苄、羧基苄、苯唑、氧哌嗪青霉素）皮试液的配制0．5g/瓶加等渗盐水至2ml －→250mg/ml取0．1ml加等渗盐水至1ml －→25mg/ml取0．1ml加等渗盐水至1ml －→2.5mg/ml取0．1ml加等渗盐水至1ml －→0.25gm/ml“ID”0.1ml(25μg)。
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抗狂犬病毒血清：由狂犬病毒固定毒免疫马所得的血浆，经胃酶消化后纯化制得。
生产工艺流程：
1.原液：从免疫马匹（单采血浆术）获得免疫血浆，分离血浆(血浆精制:去除杂蛋白)（可加入适宜防腐剂），并做无菌检查即得原料血浆（其抗狂犬病效价应不低于80IU/ml）；免疫血浆稀释，加适量胃酶（用生理氯化钠溶液将胃酶配制成1mg/ml溶液），进行类A血型物质含量测定（通则3415，血凝抑制法），必要时可加适量甲苯，调整适宜PH值后，在适宜温度下消化一定时间(胃酶消化:切去Fc端)。
加热、硫酸铵盐析、明矾吸附进行纯化；超滤法或硫酸铵沉淀法进行浓缩，加适量防腐剂硫柳汞或间甲酚，然后澄清、除菌过滤后即得到原液。
2.半成品：合格原液按成品规格以灭菌注射用水稀释，调整效价、蛋白质浓度、pH值及氯化钠含量，除菌过滤。
3.成品：分批、分装、包装。
F(ab')2 ：Fragment antigen-binding即抗原结合片段。
抗体免疫球蛋白IgG经胃酶处理,切除pFc'段,纯化获得的F(ab')2。
图1被胃蛋白酶消化的抗体产生两个片段：F（ab'）2片段和pFc'片段。
免疫双扩散法：指抗原和抗体在同一凝胶内都扩散，彼此相遇后形成特异性的沉淀线；将抗原与抗体分别加入同一凝胶板中两个相隔一定间距的小孔内，使两者进行相互扩散，当抗原抗体浓度之比相适宜时，彼此相遇形成一白色弧状沉淀线。
酶联免疫吸附试验(以下简称ELISA)：是酶免疫测定技术中应用最广的技术。
其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除。
常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法，前者用于检测大分子抗原，后者用于测定特异抗体。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’一亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)，N，N，N’，N’四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联形成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。
SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合
物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
因此，各种蛋白质SDS复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，只是分子量的函数。
这种电泳方法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(简称SDS—PAGE)。