20核酸序列测定

Principles of Gene Engineering
Northern 印迹杂交
Northern bloting (Northern 印迹)：将RNA片段转移支持介质上的过程。
Northern杂交 Southern杂交
有何不同
1) 转移的对象不同，Northern印迹转移的 是RNA，Southern印迹转移的是DNA。
Maxam-Gilbert 化学降解法测序
自动化DNA测序
直接测序技术
DNA 测序技术
Southern 印迹杂交
DNA fingerpri nt(DNA指 纹)：利用 DNA高变 区鉴定特 定的个体。
Principles of Gene Engineering
Minisatellite(小卫星)：一 种通常12bp或更长且串 联重复多次的短序列。
3｀
T
合成链顺序
C
T
G
G
C
Biblioteka Baidu模板链顺序
A
T
A
G T
开放可读框个数
A
5｀
Sanger双脱氧链终止法测序
Principles of Gene Engineering
自动化DNA测序
Principles of Gene Engineering
自动化DNA测序
Principles of Gene Engineering
嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱 落。
T+C反应：肼（低盐）
哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。
C反应：肼（高盐）
在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂 测定DNA长度~250b 按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。
化学裂解法测定DNA的核苷酸序列
Principles of Gene Engineering
将DNA聚合酶锚定可见光不能透过的微纳米孔底部玻璃表面，在模板DNA存在条件下，每次 添加一种荧光标记的核苷酸，通过光学方法直接记录单个聚合酶在不受干扰的情况下的连续合
直接测序技术 纳米孔测序
碱基经过纳米级 别的孔洞会使电导率 发生变化，每种碱基 的电阻率不同，由此 分辨出待测DNA分子 的碱基组成。
高通量测序
ABI公司PGM测序仪
Principles of Gene Engineering
每个碱基的聚合会产生一个质子，其改变测序池体中的pH值，用专一pH传感器装置检 测。
直接测序
Principles of Gene Engineering
SMRT ( the Single Molecule Real Time ) 测序仪
碱基特异性化学切割反应：
Principles of Gene Engineering
硫酸二甲酯（DMS ）
使DNA分子中鸟嘌呤（G）上的N7原子甲基化。
肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧
啶环断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应。
G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱
落。
G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G
Sanger双脱氧链终止法测序
(a) Primer extension reaction:
Principles of Gene Engineering
20-base primer
TACTATGCCAGA Replication with dNTP
20-base primer
TACTATGCCAGA ATGA T
Principles of Gene Engineering
图片引自：陈文辉,罗 军,赵超.固态纳米孔:下 一代 DNA 测序技术— 原理、工艺与挑战.中 国科学:生命科 学,2014,44(7):650
Principles of Gene Engineering
Sanger双脱氧 链终止法测序
高通量测序技术
2.第一代测序技术
the Single Molecule Real Time (SMRT) 测序、纳米孔测序
ABI公司的自动化DNA测序技术
Principles of Gene Engineering
Maxam-Gilbert化学降解法测序
一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别 得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱 基。因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性 标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有 长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原 DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进 行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。
Sanger双脱氧 链终止法测序
Principles of Gene Engineering
Sanger双脱氧链终止法测序
(b) Products of the four reaction:
Principles of Gene Engineering
Tube 1:Products of ddA reaction
2) 电泳前的处理不同，RNA在电泳前需要甲醛变性 处理，DNA在电泳前不必变性处理。
Tube 3:Products of ddC reaction
Tube 2:Products of ddG reaction Tube 4:Products of ddT reaction
ddA ddG ddT ddC
Principles of Gene Engineering
Sanger双脱氧链终止法测序
Principles of Gene Engineering
基因工程 基本技术原理 2.3 核酸序列测定
核酸序列测定
Principles of Gene Engineering
1.经典的手工测序
3.第二代测序技术
Sanger双脱氧链终止法测序 高通量测序技术—Roche、Illumina公司
Maxam-Gilbert化学降解法测序 4.第三代测序技术
Principles of Gene Engineering
高通量测序
454 Life Sciences
每个核苷酸的参入会释放一个焦磷酸，将焦磷酸与光的产生偶联起来。
高通量测序
Illumina
Principles of Gene Engineering
将DNA片段固定在固体表面，在固体表面斑块中扩增DNA，以荧光标记 ddNTP作为链终止剂，一次延伸一个核苷酸，用CCD检测斑块荧光标签颜色。