DNA序列测定的应用与发展
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
DNA序列测定的应用与发展
生命基地091
DNA序列测定的应用？
• 分析基因组核苷酸排列序列 • 分析基因序列 • 基因定点诱变的基础 • 基因工程载体构建中DNA序列定位和排
序的基础
• 确定DNA序列中蛋白质的编码区
测序技术的最近发展
• 1.商品化测序试剂盒 解决了质粒问题， 节约了时间，但缺乏灵活性。
O
O
O
HO P O P O P O
A,C,G or T O
OH
OH
OH
1' dNTP
γ
β
α
3'
2'
OH H
O
Owenku.baidu.com
O
HO P O P O P O
A,C,G or T O
OH
OH
OH
γ
β
α
3'
1' ddNTP 2'
H
H
• 3.化学降解法测序的基本原理是什么？ 如何提高其测序精确度？
• 基本原理：
• 用放射性核素标记待测DNA一侧末端
PCR法
• 只需少量模板即可产生清晰可辨的序列条 带；
• 测序反应可在高温下进行。
• 2.双脱氧链终止法测序的基本原理 是什么？
• 在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加 到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成 出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷 酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位 置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP 形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相 同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾 的一系列长短不一片段的混合物。采用聚 丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸 的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。
化学降解法：
• 重现性好，所用试剂简单，易于掌握； • 所测长度比Sanger法短一些，对放射性标记
末端250个核苷酸以内的DNA序列效果较好； • 序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应
所生成的拷贝； • 可对合成的寡核苷酸进行测序，用以分析
诸如甲基化等DNA修饰的情况，通过化学 保护及修饰干扰实验来研究DNA的二级结 构及蛋白质-DNA相互作用。 • 比较繁琐费时，过长序列有困难
• 5.PCR循环法测序为什么在大规 模测序中得到广泛的应用？
• 只需少量模板即可产生清晰可辨的序列条带； • 能提高测序反应产生的信号，降低了操作的
复杂性，且聚合酶用量少； • 可在小量制备的模板上进行筛选反应； • 测序反应可在高温下进行； • 双链闭环DNA可以直接作为反应模板应用，
不用做预先碱变性处理；
• 将标记DNA分为G、A+G、C+T、C四个反应 体系
• 用不同的化学试剂处理不同的反应体系，随机断裂 DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放 射性标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混 合物
• 电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱， 即可读出DNA序列
• 精确度？
• 反应在精心控制的条件下进行，以确保每 一个DNA分子平均只有一个碱基被修饰， 使每组反应得到长度从一个到数百个核苷 酸不等的末端标记的分子。
• 4.双脱氧链终止法测序的主要试剂 有哪些？
① 引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8 到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚体或形成 发卡样结构
② 模板 ③ DNA聚合酶 ④ 2′，3 ′-双脱氧核苷三磷酸 （ 2′, 3 ′-dideoxynucleoside triphosphate, ddNTP ） ⑤ 放射性标记dNTP
• 2.自动化测序仪 以酶学测序反应或放标 测序产物为基础，微机处理。
• 3.热循环测序 使极少数测序产物线性放 大。
• 4.测序商品化 60--180￥，搞定
思考题
• 1.DNA序列测定有哪几种类型？简叙它们各 自使用的范围和特点。
• 双脱氧链终止法：
• 该方法需要单链模板和特异寡核苷酸， 并需获得大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 的Klenow 片段的高质量酶制剂，而随着M13噬菌体和 噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成引物 容易获得及测序反应日期完善，双脱氧链终 止法如今远比化学降解法应用的广泛。
• 一句话：由于PCR循环测序法能够简单、 快速地检测特定序列，因此，该法在大规 模测序中得到广泛的应用。
生命基地091
DNA序列测定的应用？
• 分析基因组核苷酸排列序列 • 分析基因序列 • 基因定点诱变的基础 • 基因工程载体构建中DNA序列定位和排
序的基础
• 确定DNA序列中蛋白质的编码区
测序技术的最近发展
• 1.商品化测序试剂盒 解决了质粒问题， 节约了时间，但缺乏灵活性。
O
O
O
HO P O P O P O
A,C,G or T O
OH
OH
OH
1' dNTP
γ
β
α
3'
2'
OH H
O
Owenku.baidu.com
O
HO P O P O P O
A,C,G or T O
OH
OH
OH
γ
β
α
3'
1' ddNTP 2'
H
H
• 3.化学降解法测序的基本原理是什么？ 如何提高其测序精确度？
• 基本原理：
• 用放射性核素标记待测DNA一侧末端
PCR法
• 只需少量模板即可产生清晰可辨的序列条 带；
• 测序反应可在高温下进行。
• 2.双脱氧链终止法测序的基本原理 是什么？
• 在模板指导下，聚合酶不断将dNTP加 到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成 出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷 酸核苷(ddNTP）,由于双脱氧核糖的3’位 置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP 形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相 同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾 的一系列长短不一片段的混合物。采用聚 丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸 的单链DNA，从而读取DNA的核苷酸序列。
化学降解法：
• 重现性好，所用试剂简单，易于掌握； • 所测长度比Sanger法短一些，对放射性标记
末端250个核苷酸以内的DNA序列效果较好； • 序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应
所生成的拷贝； • 可对合成的寡核苷酸进行测序，用以分析
诸如甲基化等DNA修饰的情况，通过化学 保护及修饰干扰实验来研究DNA的二级结 构及蛋白质-DNA相互作用。 • 比较繁琐费时，过长序列有困难
• 5.PCR循环法测序为什么在大规 模测序中得到广泛的应用？
• 只需少量模板即可产生清晰可辨的序列条带； • 能提高测序反应产生的信号，降低了操作的
复杂性，且聚合酶用量少； • 可在小量制备的模板上进行筛选反应； • 测序反应可在高温下进行； • 双链闭环DNA可以直接作为反应模板应用，
不用做预先碱变性处理；
• 将标记DNA分为G、A+G、C+T、C四个反应 体系
• 用不同的化学试剂处理不同的反应体系，随机断裂 DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放 射性标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混 合物
• 电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱， 即可读出DNA序列
• 精确度？
• 反应在精心控制的条件下进行，以确保每 一个DNA分子平均只有一个碱基被修饰， 使每组反应得到长度从一个到数百个核苷 酸不等的末端标记的分子。
• 4.双脱氧链终止法测序的主要试剂 有哪些？
① 引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8 到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚体或形成 发卡样结构
② 模板 ③ DNA聚合酶 ④ 2′，3 ′-双脱氧核苷三磷酸 （ 2′, 3 ′-dideoxynucleoside triphosphate, ddNTP ） ⑤ 放射性标记dNTP
• 2.自动化测序仪 以酶学测序反应或放标 测序产物为基础，微机处理。
• 3.热循环测序 使极少数测序产物线性放 大。
• 4.测序商品化 60--180￥，搞定
思考题
• 1.DNA序列测定有哪几种类型？简叙它们各 自使用的范围和特点。
• 双脱氧链终止法：
• 该方法需要单链模板和特异寡核苷酸， 并需获得大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ 的Klenow 片段的高质量酶制剂，而随着M13噬菌体和 噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成引物 容易获得及测序反应日期完善，双脱氧链终 止法如今远比化学降解法应用的广泛。
• 一句话：由于PCR循环测序法能够简单、 快速地检测特定序列，因此，该法在大规 模测序中得到广泛的应用。