DNA序列测定(精)

未知DNA序列互补的引物。M13噬菌体重组子的通用测序引物一
般长15-29bp。这些引物同样也可用于PUC质粒的DNA进行“双 链”测序，并且已经商品化。
第六节
DNA序列测定
一、DNA序列测定
即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项 重要的技术。 1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个 氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70年 代后期，Sanger和Maxam----Gilbert等人又建立了核酸序列测 定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和Maxam----Gilbert化学 裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段，使核酸序列 测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过 核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。
（一）序列分析的目的，2种： 1、确证性测序 通过测定对突变进行定位和鉴定，应用时比 较野生型基因上同源区和测定的突变体的相应序列的差异。（已知 基因序列） 2、从头序列 目的是提供一段DNA准确的核苷酸序列。（未 知基因序列） （二）测定在生物、医学领域相应应用，2个方面： 1、对已知基因序列检查，特别是有遗传倾向的病例检测相关 基因有无突变，有助于阐明疾病发病机理及建立相应诊疗方案。 2、对已经克隆的未知序列进行测定，从而阐明该基因的一级 结构，如人类基因组计划中大量的工作是要阐明克隆片段的核苷酸 的排列顺序。
二、DNA序列测定工作原理
在四种反应体系中，寡聚核苷酸分别终止于不同 位置的A、T、G或C碱基，将待测DNA片段转变成一 系列放射性核素标记的单链DNA片断，并使其一端为
一固定的末端，而另一端由于长度不同，成为一系列
相差1个碱基的连续末端。经电泳分离，放射自显影， 可直接读出DNA的序列。
三、核酸序列分析的目的意义和策略（具体方法）
简便、迅速、应用广 不需酶促反应，可以 泛。 对寡核苷酸测序。
1、高负荷，1块胶可测 16个样品；2、机读不 需放射自显影；3、安 全不用同位素；4、简 单迅速。
Fra Baidu bibliotek
五、测序的基本过程
不管是上述哪一种方法，测序基本过程如下： 1、制备待测DNA序列模板； 2、酶促或化学反应将其转变“等差数列” （n=1）
植物材料：样品处理，液氮 2、试剂：
细胞提取液：NaCL, Tris-HCL, EDTA,SDS，KCL，β-巯基乙醇，
65 ℃水浴，20min 离心：4 ℃，5 000 rpm ,10min RNase: 37℃ ,30min 等体积酚/氯仿抽提，10 000 rpm ，10min, 4 ℃ (重复) 沉淀（-20 ℃ ，1-2 h）、洗涤，离心，干燥 TE回溶，低温保存或电泳检测（0.3%凝胶，下层铺1%支持胶）。注 意
3、PAGE
4、读序
六、测序技术的最近发展
1、商品化测序试剂盒 决了质粒问题，节省了时间，
但缺乏灵活性。
2、自动化测序仪 3、热循环测序 4、测序商品化 以酶学测序反应或（和）放标测 使极少数测序产物线性放大。 60.-180.￥，搞定。
序产物为基础，微机处理。
七、DNA序列测定的应用
分析基因组核苷酸排列序列 分析基因序列
第五节 DNA的提取
一、DNA的提取
1、材料：动物、植物、微生物 2、试剂：
组织匀浆液：NaCL, Tris-HCL, EDTA, 低温
离心：4 ℃，5 000 rpm ,1min 裂解液： NaCL, Tris-HCL, EDTA，蛋白酶K,55℃,过夜 RNase: 37℃ ,1h 等体积酚/氯仿抽提，10 000 rpm ，10min, 4 ℃ (重复) DNA水相，例外情况 沉淀（-20 ℃ ，1-2 h）、洗涤，离心，干燥 TE回溶，低温保存或电泳检测（0.3%凝胶，下层铺1%支 持胶）。 注意事项
四、测序的常用方法
DNA序列测定常用方法有如下 3 种： 1、末端终止法 使用特异性引物与单 链模板DNA退火， 在DNA聚合酶作用 下进行延伸反应，用 ddNTP终止，用 PAGE区分长度仅相 差1个核苷酸的 ssDNA，从而完成测 序的方法。
优点
2、化学裂解法
3、DNA测序自动化
用化学试剂在A、G、 类似末端终止法，所不 C、T处特定的裂解 同的是用荧光染料标记， DNA片段，产生一簇 计算机自动读出。 各种长度的短链，经 过PAGE放射自显影可 直读DNA顺序。
（三） Sanger双脱氧链终止法的原理
在DNA合成时，利用ddNTP与dNTP竞争掺入到新生的DNA链 上使链终止的原理。即在A、C、G、T 4种反应体系中，分别加入 不同的ddNTP，其他试剂相同，经酶促合成反应，生成具有相同的
5′末端，而3′不同的DNA片段的混合物。经电泳分离，放射自显影，
直接读出DNA的核苷酸序列。
二、试
（一）引物
剂
酶促测序反应中利用一个与模板特定序列互补的合成寡核苷
酸作为DNA合成的引物。 在许多情况下可将靶DNA片段克隆于M13噬菌体或噬菌粒载
体，以取得单链DNA分子作为模板。也可用Sanger法测定变性双
链DNA模板序列（如变性质粒DNA）。以上两种情况都可以采用 能与位于靶DNA侧翼的载体序列相退火的通用引物，不必取得与
基因定点诱变的基础
基因工程载体构建中DNA序列定位和排序的基础
确定DNA序列中蛋白质的编码区
方法一
Sanger双脱氧末端终止法
一、原 理
（一）DNA复制的4个基本条件 1、ssDNA模板 2、ddNTP 3、带有3’-OH末端的单链寡核苷酸引物 4、4种dNTP （二）链终止剂（chain-reminator）----2，3-二脱氧核糖核酸酶 当3’-OH由于脱氧或被取代，下一个核苷酸不能通过5’磷酸形成3’， 5’磷酸二酯键，使链的延伸反应终止在这个异常的核苷酸处。如果用相 同的4组引物-模板混合物，每一组加4种dNTP，其中1种用32P（或35S） 标记，加1种ddNTP，每组将产生一种特异性的以ddNTP为末端的不同 长度的核苷酸链，经PAGE分离，即可读出被测定的全部顺序（dNTP 和ddNTP竞争）。