实验三蛋白质的盐析分离和凝胶层析
分离活性蛋白实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握活性蛋白的分离纯化技术；2. 了解不同分离纯化方法的基本原理和操作步骤；3. 通过实验验证分离纯化效果。
二、实验原理活性蛋白分离纯化技术主要包括以下几种方法：盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法、亲和层析法等。
本实验采用凝胶层析法对活性蛋白进行分离纯化。
凝胶层析法是根据分子大小和形状的不同，通过凝胶孔径大小进行分离的一种方法。
凝胶层析柱内填充有具有不同孔径的凝胶，样品溶液通过凝胶层析柱时，分子大小不同的蛋白会以不同的速度通过凝胶层析柱，从而达到分离的目的。
三、实验材料1. 活性蛋白样品；2. 凝胶层析柱；3. 凝胶层析介质（如Sephadex G-75）；4. 洗脱缓冲液；5. 蛋白质标准品；6. 蛋白质检测试剂；7. 显微镜等。
四、实验步骤1. 样品制备：将活性蛋白样品用适量缓冲液溶解，调节pH值至7.0-8.0。
2. 凝胶层析柱的准备：将凝胶层析介质用洗脱缓冲液充分浸泡，使其充分膨胀，然后装入凝胶层析柱中。
3. 样品上样：将制备好的活性蛋白样品通过层析柱，使其通过凝胶层析介质。
4. 洗脱：使用洗脱缓冲液缓慢冲洗凝胶层析柱，收集洗脱液。
5. 检测：将收集到的洗脱液进行蛋白质检测，确定活性蛋白的洗脱峰。
6. 收集活性蛋白：根据检测结果，收集活性蛋白洗脱峰。
7. 活性蛋白纯化：将收集到的活性蛋白进行进一步的纯化处理，如透析、浓缩等。
五、实验结果与分析1. 活性蛋白样品在凝胶层析柱中分离出多个峰，表明活性蛋白在样品中存在多个组分。
2. 通过蛋白质检测，确定活性蛋白的洗脱峰，收集该峰。
3. 通过进一步的纯化处理，活性蛋白纯度得到提高。
六、实验讨论1. 凝胶层析法是一种简单、高效的活性蛋白分离纯化方法，适用于多种蛋白质的分离。
2. 实验过程中，样品制备、凝胶层析柱的准备、洗脱等步骤对分离纯化效果有重要影响。
3. 通过本实验，掌握了活性蛋白的分离纯化技术，为后续的活性蛋白研究奠定了基础。
蛋白质分离纯化
蛋白质的沉淀
当盐浓度增加到一定浓度时：
➢ 一方面盐离子同水结合，降低溶液中 自由水的浓度，使得蛋白质没有足够 的水维持溶解状态，破坏了维持蛋白 质亲水胶的水化膜 ，蛋白质溶解度降 低。
➢ 另一方面加入的盐离子部分中和了蛋 白质分子相互排斥的电荷，破坏蛋白 质亲水胶体的稳定因素，蛋白质相互 聚集沉淀
1 盐析
[1] 逐滴：边摇边缓慢滴入 [2] 混匀：盖子拧上在手心或桌上磕动 ✓不完全流出式刻度吸管：有“红色彩环”， 当液体流出后，再停留15秒并转动。 ✓清洗刻度吸管：自来水7次蒸馏水3次 ✓注意不要污染洗耳球。
1 盐析法
定义：盐析是指溶液中加入大量中性无机盐以破
坏蛋白质的稳定因素，而使蛋白溶解度降低并使之 从溶液中沉淀析出的现象。
凝胶回收
检测直至无NH4+为止，柱再生完毕，凝 胶倒回到原来的锥形瓶回收，留待再用。 立刻洗净层析柱。
6、合并样品：
将含蛋白最高且无NH4+的几管蛋白，用滴管合并在 一个EP管中,此即为已脱盐后的γ—球蛋白溶液。 将此EP管，冷冻保存在-20℃或-70℃冰箱。 ➢作好标记：班级，姓名，样品名，日期。
4 检测蛋白质、NH4+的方法
检测蛋白质
磺基水杨酸： 白色絮状沉淀-有蛋白质出现
检测NH4+
奈氏试剂： 棕黄色沉淀-含有NH4+
实验步骤
1 盐析 2 层析 3 检测
1 盐析
[5]洗涤：轻轻沿管壁滴入，倾斜并旋转离心管 [6]溶解沉淀：振摇
上午任务 顺利结束！
下午1:00正式开始
2 层析
装柱 上样 加洗脱剂 收集
原理：
破坏蛋白质的稳定因素：水化膜、电荷层。
中性盐： (NH4)2SO4、 Na2SO4、 NaCl 优点：蛋白质不变性
实验三 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定
实验三血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定【实验目的】一.掌握层析技术的基本原理及应用二.了解层析技术的分类三.掌握凝胶层析和离子交换层析的原理【实验原理】一、层析技术1.层析法层析法也称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术,是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。
将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。
2.依据混合物中各组分理化性质的差异—分子大小、酸碱性、吸附力、分子形状、分子极性、分子亲和力以及分配系数等。
3.基本原理固定相—固定不动。
流动相—对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。
分离原理：待分离混合物中各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、再吸附、再解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。
4．凝胶层析(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析)①定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
②基本原理：固定相：凝胶，不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒内部都具有很多细微的小孔，如同筛子一样，故称分子筛。
包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。
流动相：洗脱液。
样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，小分子能进入凝胶孔内部，做不定性扩散运动，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶孔内部，只能在颗粒间移动，作垂直向下运动，流程短，先流出→大小分子彼此分开。
③影响因素*层析柱的选择及装填：柱大小—分离样品量凝胶型号—分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。
凝胶分离范围之外的分子，难以分离。
如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子。
*洗脱液：溶解待分离物质，不变性*加样量：1%～5%*凝胶的再生5. 离子交换层析离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子的亲和力不同，借以分离混合物中各种离子的一种层析技术。
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化方法根据分子大小不同进行分离纯化蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。
根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。
透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。
超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。
它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。
由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。
所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。
当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。
例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。
使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。
常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。
可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。
密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。
蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。
凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。
凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。
分离纯化蛋白质的方法及原理
分离纯化蛋白质的方法及原理(一)利用分子大小1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。
方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馆水中进行涉及的问题：如何加快透析过程(1)加大浓度差，及时更换透析液(2)利用磁力搅拌器常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。
而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。
结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来(二)利用溶解度差别4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。
5、盐析与盐溶：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析（二）根据电荷不同6、SDS-PAG瞳称十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。
电泳时SDS蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。
所以SDS-PAGB用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。
7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。
氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的杀和力，决定杀和力的因素有：（1）主要是静电吸引力（2）氨基酸侧链同树脂之间的疏水作用氨基酸与阳离子交换树脂间的静电引力大小次序依次是：碱性氨基酸R2+冲性氨基酸R+敏性氨基酸R（X因此洗脱顺序应该是：酸性氨基酸中性氨基酸碱性氨基酸为使氨基酸从树脂上洗脱下来采用逐步提高pH和盐浓度的方法。
球蛋白分离实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法；2. 掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法；3. 通过实验，了解球蛋白的特性及其分离纯化过程；4. 验证实验结果，提高实验操作技能。
二、实验原理1. 盐析法：利用蛋白质在不同浓度的盐溶液中溶解度差异，通过沉淀和溶解的方式实现蛋白质的分离。
在实验中，清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中（常用硫酸铵）溶解度不同，清蛋白溶解，球蛋白沉淀。
2. 凝胶层析法：根据蛋白质与无机盐类之间分子量的差异，通过凝胶颗粒的网孔分离蛋白质。
分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔，从而达到去盐的目的。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：血清、硫酸铵、Sephadex G-25凝胶柱、醋酸纤维素薄膜、染色剂、缓冲液等。
2. 实验仪器：离心机、电泳仪、凝胶层析仪、紫外检测仪、移液器、烧杯、试管等。
四、实验步骤1. 盐析法分离球蛋白（1）取一定量的血清，加入等体积的半饱和硫酸铵溶液，充分混匀。
（2）将混合液在4℃下静置过夜。
（3）将混合液以3000r/min离心10分钟，收集沉淀。
（4）将沉淀用少量去离子水洗涤，重复洗涤两次。
（5）将洗涤后的沉淀溶解于适量去离子水中，得球蛋白粗制品。
2. 凝胶层析法纯化球蛋白（1）将Sephadex G-25凝胶柱用去离子水充分浸泡，使其充分膨胀。
（2）将球蛋白粗制品加入凝胶柱中，让其自然流出。
（3）收集流出的蛋白质溶液，得纯化后的球蛋白。
3. 球蛋白鉴定（1）将纯化后的球蛋白用醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定其纯度。
（2）观察电泳图谱，判断球蛋白的纯度。
五、实验结果与分析1. 盐析法分离球蛋白通过实验，观察到清蛋白溶解于硫酸铵溶液中，而球蛋白沉淀，说明盐析法可以有效地分离清蛋白和球蛋白。
2. 凝胶层析法纯化球蛋白通过凝胶层析法，观察到蛋白质在凝胶柱中分离，纯化后的球蛋白分子量较小，表明凝胶层析法可以有效地去除无机盐，纯化球蛋白。
分离蛋白质的方法
分离蛋白质的方法蛋白质是细胞组成的重要成分之一，具有多种功能，包括结构支持、运输物质、催化反应等。
为了研究蛋白质的结构、功能和相互作用，科学家们需要将蛋白质从混合复杂的生物样本中分离出来。
下面将介绍几种常见的蛋白质分离方法。
1. 盐析法（salting out）：盐采用其离子效应使溶液中的蛋白质凝聚沉淀，从而实现分离。
在盐析过程中，可以根据蛋白质的溶解特性选择适当的盐，并调节溶液pH值和离子强度。
最常用的盐是硫酸铵，其通过降低溶液中的溶剂活性从而促使蛋白质沉淀。
盐析方法适用于大多数蛋白质，但对于疏水性蛋白质效果较好。
2. 柱层析法（chromatography）：柱层析是一种流动相（mobile phase）和固定相（stationary phase）相互作用的分离技术，主要通过蛋白质与固定相之间的亲和性差异实现分离。
具体而言，柱层析可以根据蛋白质的大小、电荷、亲和性等特性，选择适当的柱填料和流动相，使不同的蛋白质在柱中有选择性地吸附和洗脱。
常用的柱层析方法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
3. 电泳法（electrophoresis）：电泳是利用蛋白质在电场中的迁移率差异进行分离的技术。
根据蛋白质的电荷、质量、形状等特性，可选择不同类型的电泳方法。
常见的电泳方法有凝胶电泳、等电聚焦、二维电泳等。
其中，凝胶电泳是最常见的方法之一，可以通过调节凝胶浓度和类型，从而实现按照分子大小分离蛋白质的目的。
4. 离心法（centrifugation）：离心是通过调节离心速度和时间，利用不同蛋白质的沉降系数差异来分离蛋白质的方法。
离心可分为不同类型，如差速离心、密度梯度离心等。
差速离心适用于分离不同大小和形状的蛋白质，而密度梯度离心常用于分离不同密度的蛋白质。
此外，还有一些其他的分离方法，如过滤、萃取、固相萃取等。
这些方法可以根据研究的具体需求和样本的特性进行选择和组合，以实现高效、纯度较高的蛋白质分离。
常用的蛋白质纯化方法和原理
常用的蛋白质纯化方法和原理蛋白质的纯化是生物化学研究中非常重要的一步，纯化蛋白质可以用于结构解析、功能研究、动态过程研究等各种生物学实验。
常用的蛋白质纯化方法有盐析法、凝胶过滤法、离子交换色谱法、亲和色谱法、逆渗透法和层析法等。
下面将对这些方法的原理和步骤进行详细阐述。
1. 盐析法盐析法是根据蛋白质在溶液中的溶解性随盐浓度的变化而变化的原理进行蛋白质的纯化。
该方法是利用蛋白质在高盐浓度下与水结合能力降低，使其从溶液中沉淀出来。
应用盐析法时，需要先调节溶液的盐浓度使蛋白质溶解，然后逐渐加入盐使其过饱和，蛋白质便会析出。
最后通过离心将蛋白质的沉淀物分离，得到纯化的蛋白质。
2. 凝胶过滤法凝胶过滤法是利用凝胶的pores 来分离蛋白质的一种方法。
凝胶通常是聚丙烯酰胺（也称作Polyacrylamide）或琼脂糖。
研究者将蛋白质样品加入到过滤膜上，较小的蛋白质能够通过pores，较大的分子则被排出。
通过选择不同大小的凝胶孔径，可以根据蛋白质的大小来选择合适数目的过滤膜。
凝胶过滤法需要进行缓冲液体积的连续换流，将蛋白质与其他杂质分离开来。
3. 离子交换色谱法离子交换色谱法是利用蛋白质与离子交换基质之间静电吸引力的不同而分离的方法。
离子交换基质通常是富含正离子或负离子的高分子材料。
在离子交换色谱法中，样品溶液在特定的pH 下流经离子交换基质，带有不同电荷的蛋白质能够与基质发生反应，吸附在基质上。
为了获得纯化蛋白质，需要通过梯度洗脱，逐渐改变缓冲液pH 或离子浓度，使吸附在离子交换基质上的蛋白质逐渐释放出来。
4. 亲和色谱法亲和色谱法是利用蛋白质与特定的配体相互作用特异性进行分离的方法。
配体可以是天然物质，如金属离子、辅酶或抗体，也可以是人工合成的结构。
在亲和色谱法中，样品溶液经过含有配体的固定相，与配体发生特异性相互作用，蛋白质与其它组分分离。
然后可以通过改变某些条件（如pH、温度或离子浓度）来洗脱纯化的蛋白质。
蛋白提纯的实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质提纯的基本原理和实验操作技术。
2. 学习使用盐析法、凝胶层析法等方法对蛋白质进行提纯。
3. 熟悉蛋白质纯度鉴定方法，如醋酸纤维素薄膜电泳法。
二、实验原理蛋白质提纯是指从混合物中分离出目标蛋白质的过程。
根据蛋白质的性质差异，如分子量、溶解度、电荷等，采用不同的分离方法进行提纯。
1. 盐析法：利用蛋白质在高浓度中性盐溶液中的溶解度差异进行分离。
在高浓度盐溶液中，蛋白质的溶解度降低，可形成沉淀。
通过离心分离，得到含有目标蛋白质的粗制品。
2. 凝胶层析法：根据蛋白质分子量的大小，利用凝胶柱分离不同分子量的蛋白质。
分子量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒的网孔，而分子量较小的蛋白质能进入凝胶颗粒的网孔，从而实现分离。
3. 醋酸纤维素薄膜电泳法：利用蛋白质在电场中的迁移速度差异进行分离。
根据蛋白质的等电点，调节溶液pH值，使蛋白质在电场中迁移至相应位置，从而实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：血清、硫酸铵、Sephadex G-25凝胶、醋酸纤维素薄膜、考马斯亮蓝R-250染料、硝酸、氢氧化钠、丙酮等。
2. 仪器设备：离心机、凝胶层析柱、电泳仪、紫外灯、分析天平、移液器、烧杯、试管等。
四、实验步骤1. 盐析法提纯蛋白质（1）取一定量的血清，加入硫酸铵至饱和，搅拌均匀，静置过夜。
（2）将混合物离心，取沉淀部分，用少量去离子水溶解。
（3）用透析法去除硫酸铵。
2. 凝胶层析法提纯蛋白质（1）将Sephadex G-25凝胶柱装好，用去离子水平衡。
（2）将溶解的蛋白质溶液加入凝胶柱，控制流速。
（3）收集洗脱液，检测蛋白质纯度。
3. 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定蛋白质纯度（1）将蛋白质样品点样于醋酸纤维素薄膜上。
（2）将薄膜放入电泳槽中，加入电泳缓冲液。
（3）通电，观察蛋白质迁移情况。
（4）将薄膜取出，用考马斯亮蓝R-250染料染色，观察蛋白质条带。
五、实验结果与分析1. 盐析法提纯蛋白质通过盐析法，成功从血清中提取出目标蛋白质，沉淀量较大，纯度较高。
蛋白质分离和纯化技术的研究和应用
蛋白质分离和纯化技术的研究和应用蛋白质是生物体内最基本的分子，其担负着细胞结构与功能、物质转运、信号传递等重要生理功能。
由于生物样品中蛋白质种类众多、含量差异较大，为了深入揭示蛋白质的生物学功能和结构特性，必须对蛋白质进行精确分离和纯化。
本文将介绍蛋白质分离和纯化技术的研究和应用。
一、蛋白质分离技术蛋白质分离是指将复杂的蛋白质混合物进行分离，得到不同种类的纯化蛋白质的过程。
在蛋白质分离的基础上，再进行进一步纯化，能够更好地揭示蛋白质的生物学特性。
（一）凝胶电泳凝胶电泳是当前最常用的蛋白质分离技术之一。
它基于蛋白质的电荷、大小、形状和亲疏水性等性质，利用电场将蛋白质分子沿着凝胶移动，实现分子大小的分离。
凝胶电泳具有分离效果好、操作简单易行、样品消耗量小以及可视化等优点。
（二）液相色谱液相色谱（Liquid chromatography）是一种通过化学亲和性、分子大小、极性与非极性等属性分离物质的分离技术。
常用的液相色谱有透析液相色谱、醚基、硅烷基、反相、离子交换、凝胶过滤等类型。
其中反相色谱在蛋白质分离中尤为重要，它基于不同蛋白质在疏水性基质表面的分配系数不同，以蛋白质的亲水性为基础进行分离。
二、蛋白质纯化技术蛋白质纯化是指在获得蛋白质的基础上，通过不同的纯化技术去除其中的杂质，得到纯度高的蛋白质分子。
蛋白质的纯化技术主要分为两类：非特异性纯化和特异性纯化。
（一）非特异性纯化非特异性纯化是指利用物理化学性质对样品进行分步纯化，将目标分子与混杂物质逐步分离开来的方法。
常用的非特异性纯化技术有盐析、凝胶过滤和透析等。
其中，盐析技术是常用的一种非特异性纯化技术，它利用富集目标蛋白质对盐的结合能力高于混杂蛋白质的特性，将混杂蛋白质和目标蛋白质分离。
（二）特异性纯化特异性纯化是指通过蛋白质与配体、抗体等生物学活性团之间的特异作用进行分离纯化的方法。
常用的特异性纯化技术包括亲和层析、免疫亲和层析等。
其中，亲和层析是一种重要的特异性纯化技术，它通过识别目标蛋白质与固定于固相材料上的亲和基团之间的特异性互作来分离纯化蛋白质。
蛋白质纯化实验技术报告
蛋白质纯化实验技术报告蛋白质是生物体内最基本的组成成分之一，它在维持生命的各个方面都起着重要的作用，因此，研究蛋白质的纯化技术具有重要的科学意义和应用价值。
本文将从蛋白质的纯化目的、方法选择、实验步骤和结果分析等方面进行详细介绍。
一、纯化目的二、方法选择蛋白质的纯化方法多种多样，常用的包括盐析、凝胶过滤、离子交换、亲和层析、逆流层析等。
在选择方法时，需要根据蛋白质的特性、溶液条件和设备条件等因素进行综合考虑。
三、实验步骤1.细胞破碎和初步纯化：将含有目标蛋白质的细胞悬液经离心分离细胞碎片，得到上清液，进行初步纯化。
2.过滤和沉淀：使用滤膜或沉淀物去除杂质，得到蛋白质溶液。
3.层析纯化：根据蛋白质的性质选择适当的层析柱，如离子交换柱、亲和柱等，进行层析纯化。
4.打破和再层析：对于较复杂的蛋白质混合物，可以使用还原剂或表面活性剂等打破蛋白质复合物，然后再次进行层析纯化，以提高纯化效果。
5.纯化评价：使用聚丙烯酰胺凝胶电泳或质谱等方法对纯化后的蛋白质样品进行评价，确认其纯度和活性。
四、结果分析根据实验结果，可以评估所选纯化方法的有效性和适用性，判断所得纯化样品的纯度和活性。
同时，还需对纯化条件进行优化，以进一步提高纯化效果。
五、结论本实验采用了其中一种纯化方法成功地获得了目标蛋白质的高纯度和高活性样品，并对其进行了初步的理化性质分析。
结果表明，所选的纯化方法具有较高的有效性和适用性，可以应用于进一步的研究和应用。
综上所述，蛋白质纯化实验是一项复杂而重要的工作，需要根据蛋白质的特性和实验条件等因素进行综合考虑，以选择合适的纯化方法。
通过详细的实验步骤和结果分析，可以得出纯化效果的评价和结论，并为进一步的研究提供有价值的参考。
血清球蛋白提纯实验报告
一、实验目的1. 掌握血清球蛋白的提取和纯化方法；2. 熟悉盐析法、凝胶层析法等分离纯化技术；3. 了解血清球蛋白的生物学功能和应用。
二、实验原理血清球蛋白是人体免疫系统中的一种重要蛋白质，具有多种生物学功能。
本实验采用盐析法和凝胶层析法对血清球蛋白进行提取和纯化，通过比较纯化前后球蛋白的生物学活性，验证实验结果的可靠性。
三、实验材料1. 血清样本：取健康人血清，低温保存；2. 试剂：硫酸铵、醋酸纤维素薄膜、凝胶层析柱、染色剂等；3. 仪器：离心机、电泳仪、凝胶成像仪等。
四、实验步骤1. 盐析法提取血清球蛋白（1）取一定量血清样本，加入适量的硫酸铵，搅拌均匀；（2）静置沉淀，离心分离，收集沉淀物；（3）将沉淀物溶解于适量的去离子水中，得到初步纯化的血清球蛋白溶液。
2. 凝胶层析法纯化血清球蛋白（1）将凝胶层析柱装满Sephadex G-25凝胶；（2）将初步纯化的血清球蛋白溶液加入凝胶层析柱，收集流出的溶液；（3）收集含有血清球蛋白的洗脱液，进行蛋白浓度测定。
3. 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定血清球蛋白纯度（1）制备醋酸纤维素薄膜，将其固定在电泳槽中；（2）取一定量的血清球蛋白溶液，加入适量电泳缓冲液，制成样品；（3）进行电泳，观察血清球蛋白的迁移情况，分析纯度。
五、实验结果与分析1. 盐析法提取血清球蛋白：实验结果表明，通过盐析法可以有效地提取血清球蛋白，提取率约为80%。
2. 凝胶层析法纯化血清球蛋白：实验结果显示，经过凝胶层析法纯化后，血清球蛋白的纯度得到了显著提高，纯度达到90%以上。
3. 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定血清球蛋白纯度：电泳结果显示，纯化后的血清球蛋白在醋酸纤维素薄膜上呈现出明显的单一条带，证明纯化效果良好。
六、实验结论本实验采用盐析法和凝胶层析法对血清球蛋白进行了提取和纯化，实验结果表明，该方法能够有效地提高血清球蛋白的纯度，为后续的生物学研究和应用奠定了基础。
七、实验讨论1. 实验过程中，盐析法提取血清球蛋白的效率较高，但纯度相对较低。
蛋白质分离提纯的一般原则
蛋白质分离提纯的一般原则1. 前处理把蛋白质从原来的组织或溶解状态释放出来，保持原来的天然状态，并不丢失生物活性。
常用的方法：匀浆器破碎、超生波破碎、纤维素酶处理以及溶菌酶等。
超声波破碎法：当声波达到一定频率时，使液体产生空穴效应使细胞破碎的技术。
超声波引起的快速振动使液体局部产生低气压，这个低气压使液体转化为气体，即形成很多小气泡。
由于局部压力的转换，压力重新升高，气泡崩溃。
崩溃的气泡产生一个振动波并传送到液体中，形成剪切力使细胞破碎。
2．粗分级分离可用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。
这些方法的特点是简便、处理量大，3．细分级样品的进一步纯化。
样品经粗分离以后，一般体积较小，杂蛋白大部分已被除去。
进一步纯化，一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。
必要时还可选择电泳、等电聚焦等作为最后的纯化步骤。
结晶是最后的一步分离纯化的方法：1．分子大小；2.溶解度；3.电荷；4.吸附性质；5.对配体分子的生物亲和力等。
(一)根据分子大小不同的纯化方法1. 透析利用蛋白质分子不能通过半透膜，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖等分开。
2. 密度梯度离心。
蛋白质颗粒的沉降系数不仅决定于它的大小，而且也取决于它的密度。
3. 凝胶过滤利用蛋白质分子大小，因为凝胶过滤所用的介质是凝胶珠，其内部是多孔的网状结构。
当不同的分子大小的蛋白质分子流过凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子进入珠内的网状结构，而被排阻在凝胶珠之外随溶剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外，比网孔小的分子能不同程度底自由出入凝胶珠的内外，由于不同大小的分子所经路径不同而得到分离。
大分子先被洗脱下来。
小分子后被洗脱(二)利用溶解度差别的纯化方法1．等电点沉淀和PH的控制蛋白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而聚集沉淀。
因此在其他条件相同时，它的溶解度达到最底点，利用等电点分离蛋白质是一种常用的方法。
实验三 凝胶层析法脱盐和分离蛋白质(0806)
实验三Sephadex G-25凝胶层析法脱盐和离子交换柱层析分离菠萝蛋白酶一、Sephadex G-25凝胶层析法脱盐（一）目的和要求掌握凝胶层析法的原理及操作技术。
（二）原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。
脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。
前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。
凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatography）、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。
它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。
其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。
网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。
人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。
凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。
分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。
这样被分离物质即被按分子的大小分开。
生化实验盐析法实验报告
一、实验目的1. 了解盐析法在蛋白质分离纯化中的应用原理。
2. 掌握盐析法的基本操作步骤。
3. 学会通过盐析法对蛋白质进行分离纯化。
4. 分析实验结果，探讨盐析法在蛋白质分离纯化中的优缺点。
二、实验原理盐析法是一种利用盐离子与蛋白质分子间的相互作用，使蛋白质从溶液中沉淀出来的方法。
当盐浓度增加时，盐离子与蛋白质分子争夺水分子，使蛋白质分子之间的氢键、疏水作用等相互作用减弱，导致蛋白质分子聚集并沉淀。
通过调节盐浓度，可以使不同蛋白质在不同盐浓度下沉淀，从而实现蛋白质的分离纯化。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质样品：如鸡蛋清、牛奶蛋白等。
- 盐：如NaCl、KCl等。
- pH调节剂：如NaOH、HCl等。
- 水浴锅、移液器、离心机、pH计等。
2. 实验试剂：- 0.1mol/L KCl溶液。
- 1mol/L NaCl溶液。
- 0.1mol/L HCl溶液。
- 0.1mol/L NaOH溶液。
四、实验步骤1. 准备蛋白质样品：取一定量的蛋白质样品，加入适量的0.1mol/L KCl溶液，搅拌均匀。
2. 调节pH值：使用pH计检测溶液的pH值，如需调节，用0.1mol/L HCl或NaOH溶液进行调节。
3. 盐析：向蛋白质溶液中加入1mol/L NaCl溶液，边加边搅拌，观察蛋白质沉淀现象。
4. 离心：将沉淀的蛋白质离心，收集沉淀物。
5. 洗涤：向沉淀物中加入适量的0.1mol/L KCl溶液，搅拌，静置，再次离心，收集沉淀物。
6. 溶解：将洗涤后的沉淀物加入适量的0.1mol/L KCl溶液，溶解。
7. 分析：通过紫外-可见分光光度计检测蛋白质溶液的吸光度，分析蛋白质的纯度。
五、实验结果与分析1. 实验结果：- 加入1mol/L NaCl溶液后，蛋白质溶液中出现白色沉淀。
- 离心后，沉淀物为白色固体，溶解后溶液呈透明状。
- 紫外-可见分光光度计检测结果显示，蛋白质溶液的吸光度与蛋白质浓度呈线性关系。
实验三 血清清蛋白的分离及电泳鉴定
实验二血清清蛋白的分离及电泳鉴定一、实验目的1．掌握盐析法、凝胶层析、分离提纯蛋白质的原理和方法。
2．掌握醋酸纤维薄膜电泳分离蛋白质的原理和方法。
二、实验原理血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成，各行使其重要的功能。
本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离，并用电泳技术观察蛋白质分离教果。
1．蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：水化膜和表面电荷。
当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白质分子沉淀析出的方法很多，根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重金属盐法以及生物碱试剂法等。
盐析法是以中性盐如硫酸铵((NH４)２SO4)等对蛋白质作用破坏蛋白质表面水化膜而使蛋白质相互聚集而析出。
不同的蛋白质沉淀需要的中性盐浓度不同，在不同盐浓度下，蛋白质溶解度不同。
球蛋白在半饱和状态下发生沉淀，而请蛋白在完全饱和状态下沉淀，利用此特性可把蛋白质分段沉淀下来，此种盐析法称分段盐析。
盐析后蛋白质沉淀经水溶后，最大特点是保持蛋白质生物学活性，因此，盐析法是研究蛋白质分子的结构和功能的最常用方法。
除盐析法，有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、柱层析法和超速离心法等也是蛋白质分离的常用方法。
2．水溶后的蛋白质含有高浓度中性盐，需要有脱盐过程去除蛋白质遗留的中性盐，常用方法有：透析法脱盐和凝胶层析法脱盐。
本实验采用凝胶层析法脱盐，在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质与盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱；反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。
分段收集蛋白质洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。
3．蛋白质分离效果可用电泳方法检测，根据电泳图谱与未分离前蛋白质溶液和标准蛋白质比较，判断蛋白质的分离纯化的效果。
实验三血清球蛋白的分离纯化及鉴定七年制
实验三血清γ球蛋白的分离纯化及鉴定七年制
9
盐析步骤
取离心管一支加入血清 2ml
加入2ml 0.9%氯化钠摇匀
边搅拌混匀边缓慢滴加饱和(NH4)2SO4 4ml
静置10min，再离心（5000转/分）10min
上清液（主要含清蛋白） 倾去
沉淀用1ml 0.9%氯化钠搅拌溶解
逐滴加饱和(NH4)2SO4 2ml,摇匀
26
操作
将脱盐后的球蛋白加于DEAE柱上（方法同 凝胶过滤），用0.0175 mol/l pH 6.3 NH4Ac 缓冲液洗脱，流速10滴～15滴/分，用小试管连 续收集流出液（约1.0 ml/管），用20%磺基水杨 酸溶液检查蛋白质分布情况，收集含量最高的部 分，浓缩作纯度鉴定。用该缓冲液洗脱下来的是 γ－球蛋白。
实验三血清γ球蛋白的分离纯化及鉴定七年制
21
⑤.层析后洗脱液检测
¡ 白色比色板,洗净备用。 ¡ 一块在各孔滴加奈氏试剂（检测NH4+）,另一
块滴加20%璜基水杨酸（检测蛋白质）。 ¡ 不用滴管,避免污染,直接倒… ¡ 用“-”表示无现象，用“+”, “++”,
“+++”等表示颜色深浅
⑥ 回收凝胶
实验三血清γ球蛋白的分离纯化及鉴定七年制
实验三血清γ球蛋白的分离纯化及鉴定七年制
17
（1）完全被排阻的极端大分子，Ve=Vo，Kd=0
（2）中等分子，Ve=Vo+Kd·Vi，0<Kd<1
（3）完全渗透的小分子，Ve=Vo+Vi， Kd=1
实验三血清γ球蛋白的分离纯化及鉴定七年制
18
操作步骤：
▲ Sephadex G-25的准备 ▲ 装柱（15~20cm）
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
可编辑ppt
6
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定技术
• 材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
• 破细胞（匀浆器，研钵，超声波，反复冻融，化学方法，酶 解等）
• 蛋白质提取（根据物质的性质，水、盐溶液、稀酸、稀碱、有 机溶剂）
• 蛋白质分级分离（盐析分级分离、有机溶剂分级分离、等电点 分离）
• 进一步纯化（透析、柱层析：分子筛、离子交换、亲和层析、 HPLC）
可编辑ppt
8
二、有机溶剂沉淀分离
有机溶剂沉淀出的蛋白质沉淀比盐析沉淀出的蛋白质沉淀易于过 滤或离心分离，分辨率好，但容易使蛋白质变性，通常在低温下 进行。
三、选择性沉淀法（等电点、热变性、酸 碱变性等）
四、吸附法 五、重金属盐沉淀法
可编辑ppt
9
蛋白质的进一步纯化（细分级）
• 一、透析和超过滤
• /~cmg/
• / • 赵永芳. 生物化学技术原理及应用.北京. 科学出版
社.2002 • 沈同 王镜岩.生物化学.高等教育出版社.2002
可编辑ppt
5
２、蛋白质的盐析分离和凝胶层析脱盐
• 蛋白质的盐析分级分离 • SephadexG-25脱盐 • 盐离子的跟踪检测 • ＵＶ检测蛋白质
可编辑ppt
15
凝胶层析原理
• 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等 。
• 对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全
被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体
积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进
入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的
体积为内水体积）。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程
越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中
等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较
大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介
于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大
到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
• 二、层析（色谱）分离
• 1、气相色谱（色谱仪）源自• 2、液相色谱：纸层析和薄层层析（分配层析）、柱 层析（分子排阻、离子交换、亲和层析、吸附层析等）
• 3、高效液相色谱（色谱仪）
• 两位英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱 （层析），他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。
可编辑ppt
10
4学时
9月18日
蛋白质的盐析分级分离及凝胶层析脱盐 6学时
9月25日 醋酸纤维膜电泳鉴定蛋白质
6学时
10月9日
10月16 日
10月23 日
10月30 日
蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法和Fulin酚法） 8学时
蛋白质等电点的测定-等电聚焦
8学
时
丹磺酰化分析蛋白质N-末端氨基酸 I
6
学时
丹磺酰化分析蛋白质N-末端氨基酸 II
生物化学实验
Biochemical Experiment
可编辑ppt
1
实验成绩评分方法
• 实验预习情况（10%） • 实验操作情况（30%） • 实验报告情况（30%） • 实验考试成绩（20%） • 实验素质（遵守实验室规则和道德行为）
（10%）
可编辑ppt
2
本学期实验课安排
9月11日 生化实验常规仪器的使用
2、盐的选择：通常采用中性盐，硫酸铵、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等。 3、硫酸铵浓度的计算与调整： （1）加硫酸铵饱和液：V=V0（S2—S1）/（1—S2）； （2）加固体硫酸铵：t=G（S2—S1）/（1—AS2） V为所加饱和硫酸铵体积； V0 为原溶液体积； S2 为需达到的硫酸铵饱
和度； S1 为原溶液硫酸铵饱和度；G和A为常数，0 时G为507， A为0.27；20 时，G为533，A为0.27。t为每升加入的克数。
一些常用的蛋白质纯化中的仪器
机械细胞破碎仪
可编辑ppt
超声波细胞破碎仪 11
• 色谱工作站
WINDOWS 98 作 为色谱分析的数据采 集和处理，后端采用 数据库工具 MS-SQL 在网络上进行分析结 果的存档、检索及打 印等。
可编辑ppt
12
• 高效液相色谱仪
可编辑ppt
13
气 相 色 谱 仪
可编辑ppt
16
可编辑ppt
17
凝胶层析载体
• 用作凝胶的载体物质有交联葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼脂糖等。 使用最多的是交联葡聚糖。
• 交联葡聚糖的商品名为Sephadex,是由链状葡聚糖通过交联 剂1—氯代—2，3—环氧丙烷交联而成。交联剂添加越多， 孔径越小，吸水量也越小；反之越大。以G-x表示型号，后 面的数字可以看出交联度，数字越小，胶联度越大。
6
学时
11月6日 猪肝DNA的制可编备辑ppt
6学时
3
11月13日 DNA定量和纯度测定
6学时
11月20日 DNA变形和复性以及Tm值得测定
6学时
11月27日 蔗糖酶的制备及各步比活力的测定
8学时
12月4日 底物浓度对酶活性的影响及km值测定
8学时
12月11日 正交法寻找蔗糖酶的最适反应条件
8学时
12月18日 氨基转换反应的定性鉴定
6学时
12月25日
LDH在不同组织中的表达分析-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 10学时
2007年1月 综合设计实验（考试）
6学时
可编辑ppt
4
有关网址和参考书目
• /molebio/biochem_ books.htm
• /biochemistry/bioc8 00/biocindx.htm
• 鉴定（电泳：薄层电泳（纸，NC膜）、凝胶电泳（PAG， 琼脂，淀粉）；结构分析；活性分析；呈色反应）
• 含量测定（fonlin酚法、考可编马辑斯ppt亮蓝G250法）
7
蛋白质的分级分离（粗分级）
一、盐析沉淀分离
1、盐溶和盐析现象：低盐浓度下蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而增加； 盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而减小析 出。
可编辑ppt
14
蛋白质的盐析分离原理
用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白 质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影 响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和， 结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。经透析或 用水稀释时又可溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。 分子量大的蛋白质（如球蛋白）比分子量小的（如白蛋白） 易于析出。改变盐浓度，使不同分子量的蛋白质分别析出。