实验三蛋白质的盐析分离和凝胶层析

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凝胶层析载体
• 用作凝胶的载体物质有交联葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼脂糖等。 使用最多的是交联葡聚糖。
• 交联葡聚糖的商品名为Sephadex,是由链状葡聚糖通过交联 剂1—氯代—2，3—环氧丙烷交联而成。交联剂添加越多， 孔径越小，吸水量也越小；反之越大。以G-x表示型号，后 面的数字可以看出交联度，数字越小，胶联度越大。
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蛋白质的盐析分离原理
用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白 质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影 响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和， 结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。经透析或 用水稀释时又可溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。 分子量大的蛋白质（如球蛋白）比分子量小的（如白蛋白） 易于析出。改变盐浓度，使不同分子量的蛋白质分别析出。
• 二、层析（色谱）分离
• 1、气相色谱（色谱仪）
• 2、液相色谱：纸层析和薄层层析（分配层析）、柱 层析（分子排阻、离子交换、亲和层析、吸附层析等）
• 3、高效液相色谱（色谱仪）
• 两位英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱 （层析），他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。
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蛋白质提取、分离、纯化及鉴定技术
• 材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
• 破细胞（匀浆器，研钵，超声波，反复冻融，化学方法，酶 解等）
• 蛋白质提取（根据物质的性质，水、盐溶液、稀酸、稀碱、有 机溶剂）
• 蛋白质分级分离（盐析分级分离、有机溶剂分级分离、等电点 分离）
• 进一步纯化（透析、柱层析：分子筛、离子交换、亲和层析、 HPLC）
一些常用的蛋白质纯化中的仪器
机械细胞破碎仪
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超声波细胞破碎仪 11
• 色谱工作站
WINDOWS 98 作 为色谱分析的数据采 集和处理，后端采用 数据库工具 MS-SQL 在网络上进行分析结 果的存档、检索及打 印等。
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• 高效液相色谱仪
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气 相 色 谱 仪
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二、有机溶剂沉淀分离
有机溶剂沉淀出的蛋白质沉淀比盐析沉淀出的蛋白质沉淀易于过 滤或离心分离，分辨率好，但容易使蛋白质变性，通常在低温下 进行。
三、选择性沉淀法（等电点、热变性、酸 碱变性等）
四、吸附法 五、重金属盐沉淀法
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蛋白质的进一步纯化（细分级）
• 一、透析和超过滤
4学时
9月18日
蛋白质的盐析分级分离及凝胶层析脱盐 6学时
9月25日 醋酸纤维膜电泳鉴定蛋白质
6学时
10月9日
10月16 日
10月23 日
10月30 日
蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法和Fulin酚法） 8学时
蛋白质等电点的测定-等电聚焦
8学
时
丹磺酰化分析蛋白质N-末端氨基酸 I
6
学时
丹磺酰化分析蛋白质N-末端氨基酸 II
6
学时
11月6日 猪肝DNA的制可编备辑ppt
6学时
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11月13日 DNA定量和纯度测定
6学时
11月20日 DNA变形和复性以及Tm值得测定
6学时
11月27日 蔗糖酶的制备及各步比活力的测定
8学时
12月4日 底物浓度对酶活性的影响及km值测定
8学时
12月11日 正交法寻找蔗糖酶的最适反应条件
8学时
• http://cti.itc.virginia.edu/~cmg/
• http://www.bio-soft.net/ • 赵永芳. 生物化学技术原理及应用.北京. 科学出版
社.2002 • 沈同 王镜岩.生物化学.高等教育出版社.2002
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２、蛋白质的盐析分离和凝胶层析脱盐
• 蛋白质的盐析分级分离 • SephadexG-25脱盐 • 盐离子的跟踪检测 • ＵＶ检测蛋白质
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凝胶层析原理
• 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等 。
• 对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全
被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体
积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进
入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的
生物化学实验
Biochemical Experiment
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实验成绩评分方法
• 实验预习情况（10%） • 实验操作情况（30%） • 实验报告情况（30%） • 实验考试成绩（20%） • 实验素质（遵守实验室规则和道德行为）
（10%）
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本学期实验课安排
9月11日 生化实验常规仪器的使用
12月18日 氨基转换反应的定性鉴定
6学时
12月25日
LDH在不同组织中的表达分析-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 10学时
2007年1月 综合设计实验（考试）
6学时
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有关网址和参考书目
• http://www.bioon.com/molebio/biochem_ books.htm
• http://www.kumc.edu/biochemistry/bioc8 00/biocindx.htm
体积为内水体积）。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程
越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中
等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较
大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介
于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大
到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
• 鉴定（电泳：薄层电泳（纸，NC膜）、凝胶电泳（PAG， 琼脂，淀粉）；结构分析；活性分析；呈色反应）
• 含量测定（fonlin酚法、考可编马辑斯ppt亮蓝G250法）
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蛋白质的分级分离（粗分级）
一、盐析沉淀分离
1、盐溶和盐析现象：低盐浓度下蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而增加； 盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而减小析 出。
2、盐的选择：通常采用中性盐，硫酸铵、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等。 3、硫酸铵浓度的计算与调整： （1）加硫酸铵饱和液：V=V0（S2—S1）/（1—S2）； （2）加固体硫酸铵：t=G（S2—S1）/（1—AS2） V为所加饱和硫酸铵体积； V0 为原溶液体积； S2 为需达到的硫酸铵饱
和度； S1 为原溶液硫酸铵饱和度；G和A为常数，0 时G为507， A为0.27；20 时，G为533，A为0.27。t为每升加入的克数。