第六章 荧光光谱法.

• 荧光发射通常发生于S1*最低振动能级，与激发至 哪一个电子激发态无关→荧光光谱形态与λex无关
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基本原理
3）荧光光谱与激发光谱互为镜像 • 电子基态振动能级分布与激发态相似→ ΔE相同 • 小峰间Δλ与振动ΔE有关，强度与跃迁几率有关
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基本原理
蒽的能级跃迁
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基本原理
S0→S2*
蒽的激发光谱及荧光光谱
Molecular Fluorometry
有些物质的分子在用紫外-可见光激发时，能发 射荧光，由此建立的分析方法
优点 1. 灵敏度非常高：检出限可达10-10~10-12g/ml 2. 选择性好
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基本原理
分子荧光的产生
荧光光谱的特征
影响荧光强度的因素
基本原理
分子荧光的产生 1. 分子的电子能级与激发过程 2. 荧光的产生
• τf的计算-作图法（p135）
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基本原理
2）荧光效率 （fluorescence efficiency）
• 激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收 激发光的光子数之比，常用φf表示：
发射荧光的光子数 f 吸收激发光的光子数
• φf ：0~1 • φf 大→有荧光发射
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基本原理
• 例如: 荧光素钠在水中φf =0.92 荧光素在水中φf =0.65 蒽在乙醇中φf =0.30 菲在乙醇中φf =0.10
356 404 0.36
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基本原理
3）刚性结构与共平面效应
• 同样的长共轭分子： 分子刚性和共平面性↗ ，荧光率↗ ，荧光波长↗
8-羟基喹啉
8-羟基喹啉镁芴
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基本原理
4）取代基效应 ①增加分子π电子共轭程度-含孤电子对的杂原子基团 →荧光波长长移 ② 减弱分子的π电子共轭性-吸电子基团 →荧光减弱甚至熄灭 ③对π电子共轭体系作用较小 →对荧光的影响不明显
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基本原理
3）产生荧Leabharlann Baidu的条件
分子必须有强UV-Vis吸收 有一定的荧光效率
否 则 能量以无辐射跃迁形式释放（内转换 与外转换的速度很快） →无荧光发射
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基本原理
2. 影响荧光强度的结构因素 （内部因素） 1）跃迁类型
2）共轭效应（长共轭结构）
3）刚性结构与共平面性效应
4）取代基效应
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基本原理
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基本原理
3. 影响荧光强度的外部因素 1）温度的影响 2）溶剂的影响 3）pH值的影响 4）荧光熄灭剂的影响 5）散射光的影响
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基本原理
1）温度： 温度升高→荧光物质的荧光效率和荧光强度下降
原因-分子运动速率↗ →碰撞概率↗ →无辐射跃迁↗
2）溶剂： 极性↗ ，荧光波长↗ ，荧光强度↗
原因-π→π*的ΔE↘→ 跃迁几率↗ →紫外和荧光波长↗
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基本原理
荧光熄灭法（fluorescence quenching method） 荧光物质中加入某种熄灭剂后，荧光强 度减小与荧光熄灭剂的浓度呈线性关系
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基本原理
影响荧光强度的因素
1. 荧光产生的条件 2. 影响荧光强度的结构因素 3. 影响荧光强度的外部因素
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基本原理
1. 荧光产生的条件 1）荧光寿命（fluorescence life time） • 除去激发光源后，分子荧光强度降低到激发时最 大荧光强度的1/e（~37%）所需的时间 • 常用τf表示 • 荧光物质重要的发光参数之一
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基本原理
1. 分子的电子能级与激发过程
M=2S+1=1（S=0）
M=2S+1=3（S=1）
单重态
（singlet state）
激发态
三重态
（triplet state）
禁阻跃迁 基态 单重态
基本原理
各个不同 振-转能级
光致发光的分子能级示意图
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基本原理
2. 荧光的产生 电子：激发态 → 基态 辐射跃迁和无辐射跃迁（热能形式） 振动弛豫 内部能量交换 荧光的发射（辐射） 外部能量交换 体系间交叉跃迁 磷光的发射（辐射）
激发 光谱
发射 光谱
发射荧 光中各 波长相 对强度
基本原理
激发λ、ε 荧光λ
图形
激发光谱
发射光谱
变
不变
不变
变
F~λex图
F~λem图
作用： 1. 鉴别荧光物质 2. 选择适当测定波长
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基本原理
激发光谱及荧光光谱 A-激发光谱；F-荧光光谱
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基本原理
2. 荧光光谱特征 斯托克斯位移 荧光光谱形状与λex无关
1）跃迁类型 • 分子结构中存在共轭的π→π*跃迁，也就是K带 强吸收时，才可能有荧光发生
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基本原理
2）共轭效应（长共轭结构） • π电子共轭程度↗： 荧光强度（荧光效率）↗ 、荧光波长↗（长移） eg: 苯 萘 蒽
λex(nm) λem(nm) φf
205 278 0.11
268 321 0.29
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基本原理
荧光的光谱特征
1. 激发光谱和发射光谱 2. 荧光光谱特征
基本原理
1. 激发光谱和发射光谱 （excitation spectrum and emission spectrum）
固定发射波长 扫描激发波长
不同激发 波长引起 某一波长 荧光发射 相对效率
荧光： 先激发 后发射
固定激发波长 扫描发射波长
第六章 荧光光谱法
1 基本原理 2 荧光分光光度计
3 分析方法
4 应用与示例
要求
掌握基本原理 熟悉仪器基本构造 了解定量方法
Fluorescence
FL 物质分子/原子吸收光子能量被激发，然后从激 发态最低振动能级返回到基态时所发射出的光
Fluorometry
根据物质的荧光谱线位置（波长）及强度进行 物质鉴定和物质含量测定的方法
荧光光谱与激发光谱互为镜像
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基本原理
1）斯托克斯位移（Stokes shift, 1852年）
• 溶液荧光光谱中，荧光（发射）光谱波长总大于 激发光谱波长的现象 • 说明在激发与发射之间存在能量损失 振动弛豫 内部转换
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基本原理
2）荧光光谱形状与λex无关
• 内转换和振动弛豫使振动激发态电子快速降至S1* 的最低振动能级→荧光发射光谱只有一个发射带
粘度↗ ，荧光强度↗（和温度有关）
原因-分子碰撞概率↗ →无辐射跃迁↗
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基本原理
3）pH值的影响 荧光物质本身是弱酸或弱碱有较大影响
4）荧光熄灭剂： ①引起荧光熄灭的物质 ②荧光熄灭（猝灭）指荧光物质分子与溶剂/溶 质分子相互作用引起荧光强度降低的现象 ③荧光熄灭的形式：
a. 碰撞-荧光自熄灭（溶液浓度过高时） b. 生成不发光配位化合物 c. 荧光物质氧化