第二章 兽医生物制品菌(毒)种的选育与构建

■ 弱菌 （毒）种的主要特征是致病力极微弱或无致 病力，免疫原性优良，能使免疫动物获得坚强的 免疫力。
■ 由于 DNA 上核苷酸碱基的改变，而导致遗传性 状突变的结果。
27
（二）弱菌（毒）种选育
弱毒（菌）种的选育
自然弱毒株的分离
同源 动物
异源 动物
人工诱变致弱
化学 途径
物理 途径
生物 途径
亚
高
适毒力强， 抗原性好， 性状稳定的菌毒株， 经增殖后进行冻干保存， 冻干菌种于 4℃保存， 冻干病毒毒种于零下 20℃以下， 可保存多年。
冻干菌/毒种一经动物传代，即应重新分离、鉴定和 检测后使用。
26
（二）弱菌（毒）种选育
■ 弱菌 （毒）种用于弱毒活疫苗，部分诊断制品和 抗血清的制造。
22
强菌（毒）种选育
②抗原性测定 反应原性多采用血清学方法， 以抗体滴度或效
价表示。 免疫原性多采用定量原强菌（毒）株的菌（毒）
液攻击免疫动物， 以保护率表示。
均应设对照，否则无效
23
强菌（毒）种选育
③稳定性测定 ■ 毒力 （致病力）和抗原性还要进行稳定性测定，
以证明后代特性不变， 才有使用价值， 并参与筛 选择优。
■ 提高稳定性的方法：挑选和纯化
■ 如羊痘鸡胚化毒种在经过羊体传代2-4代复 壮、纯化后方能用于疫苗制备。
17
4. 良好的反应原性和免疫原 性
■ 要求菌（毒）种具有良好的免疫原性，接种后能诱发机体的 体液免疫和细胞免疫，并持续较长的时间，使免疫动物获得 强效的免疫力。
■ 一般来说，动物接种后产生80%以上的保护即认为具有良好 的免疫原性。
38
3. 初选依据
■ 细菌菌落特征的变异 ■ 病毒蚀斑的变异 ■ 对温度敏感性变异 ■ 对药物敏感性变异 ■ 对营养要求变异 ■ 对宿主动物易感性变异
39
我国一些弱毒株的育成路线与方法
40
硝
温
易感动
基 胍
紫 外 线
物或细 胞；杂 交减毒
28
1. 自然弱毒株的选育
（1）利用病原的自然弱毒株:由于自然强毒株在 长期的自然因素作用下引起遗传基因突变， 从而形成了与祖代形状不同的生物株。
如巴斯德从巴氏杆菌的陈旧培养物中分离到禽霍 乱弱毒菌株。
机率低
29
（2）选择同源不同种的微生物种：具有一定交叉免 疫原性，而天然宿主又不相同的微生物株作为疫苗株。 如：
11
12
13
14
美国菌种保藏中心（ATCC）
15
2. 生物学特性明显
■ 菌种的形态特征、培养特性、免疫学特性明显，易于鉴别； ■ 毒种的形态、增殖培养病变、免疫学特性明显； ■ 菌种和毒种人工感染动物后的临床表现、病理变化、引起的
细胞病变具有特征。
16
3. 遗传性状稳定
■ 菌种和毒种在保存、传代和使用过程中，受各种因素影响而 变异，因此保证其遗传性状稳定是保障生物制品质量的重要 因素之一。
■ 生物诊断用的菌（毒）种少量注入动物体内就能诱发强烈免 疫反应，产生既特异又灵敏的诊断用品。
18
5. 可靠的安全性
■ 菌（毒）种的安全性与两方面因素有关： 1. 菌（毒）种残余的毒力，如弱毒疫苗。 2. 混有强毒或其他病原体。 致病力进行测试。
灭活苗必须彻底灭活！
19
四、菌种与毒种选育技术
（一）强菌（毒）种选育 • 强菌（毒）种广泛用于诊断制品，抗病血清， 灭活疫苗和疫苗制品
9
三. 兽医生物制品菌（毒） 种标准
菌（毒）种是生物制品质量的关键。 制备的疫苗必须是安全、有效的，诊断试剂必须敏感和特异， 因此这些菌（毒）种除了毒力标准不同外，均需符合一定的标 准。
10
1.来源（历史）清楚，资料完 整
■ 流行地区、动物种、流行资料清楚； ■ 分离鉴定资料完整； ■ 传代、保藏、生物学特性检查方法明确。
种扩散罪是指从事实验、保藏、携带、运输传染病菌种、毒种的人员， 违反国务院卫生行政部门的有关规定，造成传播染病菌种、毒种扩散， 后果严重的行为。
3
生物制品用菌（毒）种生物安全分 类
■ 第一类病原微生物，是指能够引起人类或动物非常严重疾病 的微生物，以及中国尚未发现或已经宣布消灭的微生物。
■ 口蹄疫病毒、高致病性禽流感病毒、猪水 泡病病毒、非洲猪瘟病毒、非洲马瘟病毒、 牛瘟病毒、小反刍兽疫病毒、牛传染性胸 膜肺炎丝状支原体、牛海绵状脑病病原、 痒病病原。
反应原性
免疫原性
血清学试验 攻毒保护试验
筛选出毒力强、抗原性好、生长稳定、纯净的毒株
冻干、冷冻或冷藏保存
21
强菌（毒）种选育
①致病力测定（毒力测定） ■ 常用易感实验动物或本动物：
■ 最小致死量（MLD）； ■ 半数致死量（LD50）。
■ 鸡胚或易感细胞：
■ 鸡胚半数致死量（CELD50）； ■ 鸡胚半数感染量（CEID50）； ■ 细胞半数感染量（TCID50）。
6
生物制品用菌（毒）种生物安全分类
■ 第四类病原微生物，是指通常不会引起人类或动物疾病的微 生物。
■ 是指危险性小、低致病力、实验室感染机会少的 兽用生物制品、疫苗生产用的各种弱毒病原微生 物以及不属于第一、二、三类的各种低毒力的病 原微生物。
7
二. 分类
（一）按照菌（毒）种的毒力分类 1. 强毒菌（毒）种 是指具有强大致病力的菌种，一般免疫原性良好，常用于制造某些灭活 疫苗、抗血清以及疫苗效力检验。
干燥 ■ 狂犬病病毒
狂犬病弱毒疫苗
32
（3）生物途径选育
■ 通过生物途径选育的弱毒株，其生物稳定性极佳， 但过程比较长。
■ 至目前为止， 用于预防人类和家畜传染病的活疫 苗的菌种和病毒种，大部分都以这种方式培育， 在动物传染病的控制与消灭过程中， 这类疫苗起 着重要的作用。
33
① 适应非易感动物 ■ 优点：动物来源广、饲养管理方便、成本低、易
■ 第三类病原微生物，是指能够引起人类或动物疾病但一般情 况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限， 实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防 措施的微生物。
■ 多种动物共患病病原微生物：低致病性流感病 毒、伪狂犬病病毒、破伤风梭菌、气肿疽梭菌、 结核分支杆菌、副结核分支杆菌、致病性大肠 杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌等。
4
生物制品用菌（毒）种生物安全分 类
■ 第二类病原微生物，是指能够引起人类或者动物严重疾病， 比较容易直接或间接在人与人、动物与人、动物与动物之间 传播的微生物。
■ 猪瘟病毒、鸡新城疫病毒、狂犬病病毒、 绵羊痘/山羊痘病毒、蓝舌病病毒、兔病毒 性出血症病毒、炭疽芽孢杆菌、布氏杆菌。
5
生物制品用菌（毒）种生物安全分类
的效力检验，也用于人工育成弱菌（毒）株的菌（毒）种，以及微生 物学与免疫学、动物传染病等实验室研究。 • 分离于疫病流行区的典型病例。
20
四 菌种与毒种选育技术
（一）强菌（毒）种筛选程序和内容
菌（毒）分离
纯粹性实验
致病力实验
抗原性实验
原动物 实验动物 LD50
TCID50
鸡胚 细胞
EID50 ELD50 稳定性实验
于连续传代及操作简单。
34
35
② 适应细胞 ■ 采用同源或异源动物组织的原代细胞。
36
37
③ 杂交减毒 ■ 两种遗传性状不同的菌（毒）种，在传代培育中
进行自然杂交，以导致不同菌（毒）株间基因发 生交换而育成有使用价值的弱毒株。 ■ 如流感病毒温度敏感株（抗原性低）与流行株 （毒力强）在混合培养传代中进行杂交，育成抗 原性强毒力低的弱毒株。
■“牛痘” 。 ■ 火鸡疱疹病毒作为预防鸡马立克氏病毒疫 苗株 ■ 牛病毒性腹泻病毒接种预防猪瘟感染。
30
2. 人工方法诱发突变弱毒株的选育
（1）化学途径 ■ 化学诱变剂：亚硝基胍------1% ■ 例如：即支原体疫苗株，肺炎支原体突变株
31
（2）物理途径选育
高温 ■ 炭疽强毒菌株
炭疽弱毒疫苗
2. 弱毒菌（毒）种 是指对动物无致病力而具有一定免疫原性的菌种，主要用于制造弱毒疫 苗。
8
（二）按照菌（毒）种的用 途分类 1. 生产用菌（毒）种
是指用于生产生物制品的菌（毒）种，包括疫苗、抗毒素、类毒素、抗 血清及诊断用品的菌、毒种。 2. 检定用菌（毒）种 是指用于检定生物制品效力等菌（毒）种。还包括用于检定血清交叉反 应的菌（毒）种。 3. 工具用菌（毒）种 是指生物制品生产中作为工具使用的菌种。如基因工程表达抗原使用的 载体大肠杆菌、酵母菌等。 4. 标准菌株或参考菌株：不直接用于生产。
生物制品的流程
菌种的选育与构建 种子批的建立 前临床试验
疫苗规模化生产 III期临床试验
疫苗的生产
II期临床试验
I期临床试验
1
第二章 兽医生物制 品菌（毒）种的选
育与构建
2
一 概述
■ 菌（毒）种：直接用于制造和检定生物制品的细菌、支原体、立克次 体或病毒等。
■ 来源途径合法，并经国务院药品监督管理部门批准。 ■ 根据《中华人民共和国刑法》第三百三十一条规定，传染病菌种、毒