流式细胞仪分选共23页文档
流式细胞仪细胞分选的操作步骤
细胞分选的简要操作步骤一、上样前的准备FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。
1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。
3L 70%乙醇（用无菌蒸馏水配制）5L无菌蒸馏水5L无菌PBS2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。
盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗涤。
安好鞘液筒。
3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。
4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。
5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。
6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。
7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。
9、从Acquire menu选择SortSetup。
在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。
按液流控制键RUN。
10、在Setup 方框中打叉，点击Acquisition Control 菜单中Acquire。
11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min ），点击Pause, Abort。
12、再重复上述步骤2次，共需要1h。
13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直至洗净桶内壁残余乙醇。
14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。
安好鞘液筒。
15、在收集管接口处安装2支新的收集管。
16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。
17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。
18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause Abort。
19、再重复上述步骤2次，共需要1h。
20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。
安好鞘液筒。
21、在收集管接口处安装2支新的收集管。
22、放上一支装有无菌PBS的进样管。
23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。
流式细胞仪分选细胞的原理
流式细胞仪分选细胞的原理一、仪器原理流式细胞仪是一种利用流体动力学原理，结合光学和电子仪器技术，对细胞进行快速检测、分类和分选的仪器。
其主要原理是通过细胞在液体中的流动来实现对细胞的分选和分类。
二、流式细胞仪的组成流式细胞仪主要由液体系统、光学系统和电子系统三部分组成。
1.液体系统：液体系统包括进样系统、流动系统和废液系统。
进样系统负责将待检样品引入流动系统；流动系统则通过液体的流动将细胞送到光学系统进行检测；废液系统则负责将已经检测过的样品排出。
2.光学系统：光学系统由激光器、光学镜头、滤光片和光电倍增管等组成。
激光器产生的激光经过光学镜头聚焦后，照射到流动的细胞上，细胞反射、散射或荧光发射的光信号被光学镜头收集并通过滤光片进行过滤，最后由光电倍增管转化为电信号。
3.电子系统：电子系统主要由数据采集卡、计算机和控制软件组成。
数据采集卡负责将光电倍增管转换的电信号进行放大和数字化处理，然后传输给计算机；计算机通过控制软件对数据进行处理、分析和展示。
三、细胞的分选原理流式细胞仪的分选功能是通过细胞的特征参数来进行判断和分选的。
1.散射光信号分选：散射光信号是细胞受到激光照射后，由于细胞的大小、形状和内部结构的不同，产生的光信号。
通过检测散射光信号的强度和角度，可以判断细胞的大小和形态，从而实现对细胞的初步分选。
2.荧光信号分选：荧光信号是细胞在受到特定荧光染料激发后发射的光信号。
通过检测细胞的荧光强度和荧光颜色，可以判断细胞内特定荧光标记物的存在与否，从而实现对特定细胞类型的分选。
3.双参数联合分选：双参数联合分选是指根据细胞的两个或多个特征参数进行综合分析和判断。
比如可以根据细胞的大小和形状、荧光强度和颜色等参数进行综合判断，实现对多种细胞类型的准确分选。
四、应用领域流式细胞仪广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物研发等领域。
1.生物医学研究：流式细胞仪可以对细胞的免疫表型、细胞周期、细胞凋亡等进行快速检测和分析，帮助科研人员深入了解细胞的生理和病理过程。
流式细胞仪细胞分选的操作步骤
细胞分选的简要操作步骤一、上样前的准备FACSCalibur可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。
1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。
●3L 70% 乙醇（用无菌蒸馏水配制）●5L 无菌蒸馏水●5L 无菌PBS2、在干净的鞘液筒中加入3L 70% 乙醇。
盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗涤。
安好鞘液筒。
3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。
4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。
5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。
6、放上一支装有70 % 乙醇的进样管。
7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。
9、从Acquire menu选择SortSetup 。
在Sort Gate菜单中选择步骤７设定的分选门。
按液流控制键RUN。
10、在Setup方框中打叉，点击Acquisition Control菜单中Acquire。
11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。
12、再重复上述步骤2次，共需要1h。
13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL 无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直至洗净桶内壁残余乙醇。
14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。
安好鞘液筒。
15、在收集管接口处安装2支新的收集管。
16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。
17、点击Acquisition Control菜单中Acquire。
18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。
19、再重复上述步骤2次，共需要1h。
20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L 无菌PBS，盖紧盖子。
安好鞘液筒。
21、在收集管接口处安装2支新的收集管。
22、放上一支装有无菌PBS的进样管。
23、点击Acquisition Control菜单中Acquire。
Flow Cytometer Sorting Technology 流式细胞分选
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食管癌细胞系-17 SP（分选后）--Aria II
21
MoFlow XDP
22
实际案例分析
23
实际案例分析
24
Another sort . . .
25
Sorting results: pure or not ?
Signal
Noise
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实际案例分析
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实际案例分析
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实际案例分析
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CD4： L CD19： FL CD8： R CD56： FR
30
CD4： L
31
CD19： FL
32
CD8： R
33
CD56： FR
34
CD45RO4: CD45RA4: CD45RO8: CD45RA8:
L FL R FR
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谢谢！
一、分选速度
二、分选纯度
三、分选得率
四、分选活性
5
分选参数设定
一、分选速度： 1、DDF，液滴振荡频率 Nozzle＝70um，DDF＝90KHz (60-100)，SP=70Psi (60-70)
Nozzle＝100um，DDF＝30KHz (20-35)，SP=20Psi(15-25)
Nozzle＝85um，DDF＝45KHz (40-50)， SP=30-45Psi Nozzle＝130um，DDF＝10-15KHz，SP=10Psi
44
14
分选参数设定
Claim: “High purity and yield is maintained and is independent of the event rate” at event rates up to 100Ke/s
流式细胞仪分选课件
TETRAMER 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
抗原递呈细胞（APC）携带抗原片段通过与TCR复合物结合，在APC和T细胞的 MHC相容和其它共刺激分子的相互作用下激活T细胞并产生细胞免疫效应。 MHC-四聚体染色技术用于抗原特异性T细胞分析的原理在于体外模仿上述抗 原递呈的过程来实现对特异性T细胞的鉴定，通过流式细胞仪这种高通量分 析仪器对标本中这群细胞进行分析
相应地，CD8+T细胞也可以分 为Tc1和Tc2
Th1细胞：介导细胞免疫、细 胞毒性T细胞的生长和活化 、巨噬细胞的活化、介导 迟发型过敏反应。其功能 亢进将导致炎症慢性迁延 ，器官特异性自身免疫病 ，急性排异反应和接触性 皮炎等的发病和免疫病理 损伤。
Th2细胞 ：介导体液免疫，促 进B细胞的生长、活化和分 化，是IgG1和IgE类抗体的 转换因子，其功能亢进将 导致特异性过敏反应，参 与高IgE综合症和嗜酸性粒 细胞增多症。
对AIDS病人的诊断、疗效和预后有重要的指导意 义，一般认为CUTOFF值为200/ul.
绝对计数是加入浓度已知的标准微球与标本一起 测定，流式细胞仪控制软件在设置后能自动计算 出浓度
对任何细胞群体都可以进行绝对计数
Th1Th2细胞因子分泌细胞测定 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
1. 肿瘤的早期诊断。 2. 肿瘤的良恶性判断。 3. 观察细胞的增殖状态及周期分布。 4. 疗效监测
细胞功能分析 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
1.吞噬功能试验 2.氧爆发试验 3.根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同将CD4+或 CD8+分为介导细胞免疫的I型细胞和介导体液 免疫的II型细胞. 4.药物泵的功能检测 5.NK细胞的肿瘤杀伤活性检测 6.血小板的粘附,聚集功能检测
分选型流式细胞仪的工作原理
分选型流式细胞仪的工作原理分选型流式细胞仪（sorting flow cytometer）是一种用于细胞分选和分析的高级仪器。
它基于流式细胞仪原理，通过将细胞悬浮液以单个细胞为单位通过检测点，实现对细胞的分选和分析。
本文将详细介绍分选型流式细胞仪的工作原理。
分选型流式细胞仪主要由光学系统、流体系统、信号采集系统和控制系统四个部分组成。
光学系统包括激光器、衍射光学系统和荧光光学系统，用于激发和检测细胞中的荧光标记物。
流体系统包括进样系统和分选系统，用于将细胞引入仪器并进行分选。
信号采集系统包括光敏元件和信号处理电路，用于检测和采集光学信号。
控制系统包括仪器控制软件和数据处理软件，用于控制仪器运行和处理采集到的数据。
在分选型流式细胞仪中，细胞悬浮液首先通过进样系统引入仪器。
进样系统通常采用压力驱动的方式，将细胞悬浮液注入进样装置，然后通过微细管道将细胞单个引入检测点。
进样时，仪器会根据预设的参数对细胞进行分类，将目标细胞和非目标细胞分开。
当细胞通过检测点时，激光器会对细胞进行激发，激发光线经过衍射光学系统和荧光光学系统后，被光敏元件接收。
衍射光学系统通过多个透镜和光栅，将光线聚焦到细胞上，使细胞中的荧光标记物发射出的光线进入荧光光学系统。
荧光光学系统通过滤光片和光学透镜，将目标波长的荧光信号聚焦到光敏元件上。
光敏元件通常是一种高灵敏度的光电二极管或光电倍增管，用于将光信号转换为电信号。
信号处理电路对电信号进行放大、滤波和数字化处理，然后传输到控制系统进行进一步处理。
控制系统根据预设的参数，对采集到的数据进行分析和判断，判断细胞的类型和特征。
根据判断结果，控制系统可以对细胞进行分选。
分选系统通过电磁阀和压力控制装置，将目标细胞和非目标细胞分开。
当控制系统判断某个细胞为目标细胞时，会通过信号控制电磁阀，开启对应的通道，使目标细胞通过分选系统，进入收集装置。
而非目标细胞则会被排除到废液中。
分选型流式细胞仪的工作原理基于光学原理和电子技术，通过对细胞的荧光标记物进行激发和检测，实现对细胞的快速分选和分析。
流式细胞仪细胞分选的操作步骤
细胞分选的简要操作步骤一、上样前的准备FACSCalibur可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。
1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。
●3L 70% 乙醇（用无菌蒸馏水配制）●5L 无菌蒸馏水●5L 无菌PBS2、在干净的鞘液筒中加入3L 70% 乙醇。
盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗涤。
安好鞘液筒。
3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。
4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。
5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。
6、放上一支装有70 % 乙醇的进样管。
7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。
9、从Acquire menu选择SortSetup 。
在Sort Gate菜单中选择步骤７设定的分选门。
按液流控制键RUN。
10、在Setup方框中打叉，点击Acquisition Control菜单中Acquire。
11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。
12、再重复上述步骤2次，共需要1h。
13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL 无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直至洗净桶内壁残余乙醇。
14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。
安好鞘液筒。
15、在收集管接口处安装2支新的收集管。
16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。
17、点击Acquisition Control菜单中Acquire。
18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。
19、再重复上述步骤2次，共需要1h。
20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L 无菌PBS，盖紧盖子。
安好鞘液筒。
21、在收集管接口处安装2支新的收集管。
22、放上一支装有无菌PBS的进样管。
23、点击Acquisition Control菜单中Acquire。
流式单细胞分选技术
流式单细胞分选技术流式单细胞分选技术是一种用于研究和分析单个细胞的高效方法。
它可以将细胞从复杂的混合样本中分离出来，并对其进行快速和准确的分类。
这项技术在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用前景。
在过去的几十年中，随着单细胞研究的兴起，研究人员逐渐意识到细胞之间的差异可能比我们想象的要大得多。
传统的细胞分析方法通常是对大量细胞进行群体研究，而忽略了个体细胞的差异。
然而，每个细胞都是独特的，其功能和表型可能受到多种因素的影响。
因此，单细胞分选技术的出现填补了这一研究空白。
流式单细胞分选技术的基本原理是通过细胞悬浮液在流式细胞仪中以单个细胞的形式通过激光束。
根据细胞的特异性标记，如细胞表面标记物或荧光染料，流式细胞仪可以快速检测并分辨不同细胞类型。
根据检测到的信号，流式细胞仪可以将目标细胞捕获并分离出来，从而实现单细胞的分选。
流式单细胞分选技术的关键在于细胞的特异性标记。
常用的标记方法包括荧光染料标记、抗体标记、基因表达标记等。
通过选择适当的标记方法，研究人员可以根据需要选择特定类型的细胞进行分选。
这种技术不仅可以用于分离不同类型的细胞，还可以分离具有不同表型的同一类型的细胞，如肿瘤细胞中的不同亚群。
流式单细胞分选技术的应用广泛。
在生物医学研究中，它可以用于研究细胞的发育和功能，揭示细胞的多样性和异质性。
在肿瘤学研究中，它可以用于分离和分析肿瘤细胞亚群，帮助了解肿瘤的发生和发展机制。
此外，流式单细胞分选技术还可以应用于临床诊断，如癌症早期诊断和预测治疗效果。
尽管流式单细胞分选技术在细胞研究领域取得了巨大的进展，但仍面临一些挑战。
首先，细胞样本的准备和处理过程可能会影响到分选的结果。
其次，目前的流式细胞仪的分辨率和速度仍有限，无法满足大规模单细胞分选的需求。
此外，单细胞的高通量分选和分析需要更复杂的数据处理和分析方法。
总的来说，流式单细胞分选技术为研究人员提供了一种高效、准确和全面的分析单细胞的方法。
流式细胞分析分选原理
精选课件
1
流式细胞术的原理
• 流式细胞术（FCM）是一 种能对单个细胞、分子和 生物颗粒（微生物）进行 多参数快速检测的新型分 析和分选技术。近几年随 着多种单克隆抗体的成功 制备和多种荧光素的应用。 FCM逐步运用于对疾病诊 断和治疗监测的临床检验 常规工作。
精选课件
2
流式细胞仪与显微镜
光源
通过的光谱
615-645 nm light
精选课件
29
Source light
Absorbance filter
Certain colors absorbed
精选课件
Passed light
30
精选课件
31
525 BP
488 DL
550 DL 488 BK
575 BP 600 DL
620 BP 640 DL
精选课件
21
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
精选课件
22
Fluorescence emitted by each fluorochrome is usually detected in a unique fluorescence channel.
The specificity of detection is
• FS----Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光 检测器
• FS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形 状及 optical homogeneity 有关
• FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性
如:大小
精选课件
13
流式细胞仪分析技术
二、数据显示方式
直分析方图 • 单参数直方图 • 双参数直方图:点图 双参数直方图: 二维等高图 假三维等高图 • 三参数直方图 • 多参数分析 设门分析: 设门分析:REGION和GATE设置 和 设置
（一）单参数直方图
由一维参数(散射光或荧光) 由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数 (COUNT)构成，反映同样散射光或荧光 构成， 构成 强度的颗粒数量的多少。 强度的颗粒数量的多少。
细 胞 相 对 数 量
信道 (channel )
单参数直方图
（二）双参数直方图
• 双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测 双参数直方图： 量细胞的两个测量参数， 量细胞的两个测量参数，根据这两个参数 就可以确定细胞在图上的表达位置。 就可以确定细胞在图上的表达位置。 • 双参数信号通常采用对数信号，最常用的 双参数信号通常采用对数信号， 通常采用对数信号 是点密图，在图中，每个点代表一个细胞， 是点密图，在图中，每个点代表一个细胞， 点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光 强度的颗粒数量的多少。 强度的颗粒数量的多少。
（一）分选基本原理
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动 流动室振动 液流断裂成液滴
空白液滴 不充电 弃去
含细胞的液滴 充电 偏转落入收集器
（二）分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。
液中细胞的含量成正比。 液中细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞 分选纯度：
FS） 激光束照射细胞时， 前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 (0.5° 10° 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细 胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比
AriaII操作手册-分选
FACSAri aⅡ流式细胞仪一、开机准备（一）准备液路1.将流式细胞仪的上盖打开；2.开启计算机，等待所有程序载入。
3.开主机电源Mainpower（右图），从电脑桌面上双击打开FACSDiva软件，输入密码BDIS。
打开激光开关laser power（根据实验需要进行选择）；开启实验所需激光器电源。
4.确认液流车中各种液体的液面水平（鞘液、废液、去离子水、漂白剂、乙醇），倒空废液或加满其他液体（下图）。
5.从软件的Cytometer菜单上选择Fluidic Startup(射流启动)，点击OK确认。
将出现如下窗口：6．将液路和气路管道从酒精桶断开，连接到鞘液桶；完成后点Done；7．将Closed-loop 喷嘴（闭环喷嘴）插入流动室；完成后点Done；会出现右侧窗口，提示液流开启进行中；8．达到100%，移去Closed-loop喷嘴，完成后点Done；9．按照实验要求，插入直径合适的喷嘴（喷嘴直径应该是分选颗粒直径的3-6倍）；10．然后点OK，完成整个过程；11．从菜单上选择Sort(分类)sort setup,确认setup模式与喷嘴大小匹配。
（二）开液流1．打开液流窗口的液流；♦点击软件界面上（如下图）的按钮打开分选液流窗口（如下图）♦点击分选液流窗口的按钮(stream 的前面按钮)，开启液流2．打开分选仓前的门，检查液流。
液流应为一条细线落入废液槽正中(可通过调整红色标志的键)；（如果液流不稳，检查流动室中是否有气泡，将液流关闭，10秒钟后再开，排除气泡。
）3．关上分选仓前的门。
（三）设定液流断点1.调整液流震幅（Ampl），使断滴位于窗口上方1/3处。
（Ampl不要超过70，如果超过，检查流动室是否有气泡；确认鞘液压力和震动频率是否合适）；2.确认卫星液滴与大液滴融合，应该在断滴的6滴之内融合（红色箭头数起，左图的左侧合格，右侧不合格），如果没有融合，重新安装喷嘴。
二、建立实验模板1.在软件界面左侧Browser面板下，依次点击New Folder、Experiment、Specimen （均可重命名），单击Specimen左侧“+”符号，显示下方的Tube，点击左侧灰色指示箭头，使之变成绿色（当前指示）。
流式细胞仪分析49页PPT文档
同的散射光。在入射光束与液柱垂直的方
向有荧光检测系统和散射光感受系统，用
于收集荧光信号和侧向散射光信号，前向
散射光感受器在前向小角探测接受前向光
信号。
2020/3/26
检验本科
7
被接收的光电信号被光电倍增管转换成电 压脉冲和积分脉冲，使信号放大，该信号 进入计算机系统进行数据转换、储存、分 析、处理，按不同的检测设计采用相应软 件程序对结果进行综合分析，并以图像和 数据显示于荧光屏上。
流式细胞仪产生分析的电信号主要是 光散射信号和荧光信号，流式细胞仪依据 细胞流经光照射区时电压讯号的强弱来分 析和分选细胞。（图5）（图10）
2020/3/26
检验本科
8
二、散射光的测定
细胞对光的散射是细胞在未遭 受任何破坏情况下固有的特性。
2020/3/26
检验本科
9
㈠ 前向散射光（FS）
由激光束前方的FS检测器收集，FS信 号的强弱与细胞的体积大小成正比，用于 检测细胞或其他粒子物质的表面属性。 （图11） （图6）
选择不同的单克隆抗体及荧 光染料就可以利用流式细胞仪同 时测定一个细胞上的多个不同特 征。
流式细胞仪的检测原理中最 重要的一点就是检测荧光的特定 发射波长。
2020/3/26
检验本科
13
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
㈠ 光信号测量
线性放大器用于测量信号强度变化范围 较少或代表生物学线性过程的信号。
对数放大器用于测量信号强度变化范围 大且光谱信号较复杂的信号。
（图13）
流式细胞仪中最常用于单抗标记的荧光 染料是FITC、PE、ECD或PeCy5。
2020/3/26
检验本科
14
㈡ 荧光补偿 （图8）
流式细胞仪检测技术与质量控制-文档资料
流式细胞仪检测技术与质量控制-文档资料介绍流式细胞仪是一种常见的生物学实验仪器，可用于快速分析、定量和分选单个细胞。
它以极高的灵敏性和精度，使其成为现代生命科学中最重要的工具之一。
流式细胞仪的应用范围非常广，包括细胞免疫学、药理学、细胞周期分析、基因表达分析等等。
本文档旨在介绍流式细胞仪的基本工作原理、检测技术和质量控制方法。
工作原理流式细胞仪通过吸收、散射和荧光等特定光学信号来检测和分析细胞。
它的核心组成部分是荧光染料和激发光源，荧光染料可以与特定的细胞分子结合，形成能够发射荧光的复合物，激发光源可以激活荧光染料的荧光信号。
当样品通过流式细胞仪时，细胞和细胞复合物被单独地呈现在流体中，并且被一个聚光镜系列扫描，采集特定的光学信号。
通过分析该信号，流式细胞仪可以确定每个单一细胞的荧光特性。
检测技术荧光检测流式细胞仪常用的检测方法是荧光检测。
它需要将荧光染料与特定的细胞分子结合，形成能够发射荧光的复合物。
流式细胞仪将样品置于聚光镜下，激发光源激活荧光染料的荧光信号，然后通过聚光镜采集荧光信号。
荧光检测既可以用来鉴定单个表面标记物，也可以用于检测内部标记。
散射检测散射检测是流式细胞仪的另一种找出单个细胞的方式。
散射检测基于细胞对激光束的散射表现，散射强度既可以用来区分不同类型的细胞，也可以用于估计细胞的大小、形状和结构。
生物素-亲合素检测生物素-亲合素检测是流式细胞仪常用的一种检测方法。
生物素-亲合素检测通过不同的化学偶联对荧光染料进行标记，使得检测定量更加精确。
质量控制流式细胞仪的检测结果受多种因素的影响，因此需要严格的质量控制程序来保证检测结果的准确性和可靠性。
质量控制程序包括实验前的设备校准和实验后的数据分析。
设备校准设备校准是流式细胞仪保证检测结果准确性和可靠性的关键。
光学器件需要定期校准，以确保检测的性能和准确性。
每个荧光探针必须进行校准，以确保正确的基线水平和探针强度。
数据分析数据分析是流式细胞仪质量控制的另一关键步骤。
流式细胞仪细胞分选的操作步骤
细胞分选的简要操作步骤一、上样前的准备FACSCalibur可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。
1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。
●3L 70% 乙醇（用无菌蒸馏水配制）●5L 无菌蒸馏水●5L 无菌PBS2、在干净的鞘液筒中加入3L 70% 乙醇。
盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗涤。
安好鞘液筒。
3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。
4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。
5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。
6、放上一支装有70 % 乙醇的进样管。
7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。
9、从Acquire menu选择SortSetup 。
在Sort Gate菜单中选择步骤７设定的分选门。
按液流控制键RUN。
10、在Setup方框中打叉，点击Acquisition Control菜单中Acquire。
11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。
12、再重复上述步骤2次，共需要1h。
13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL 无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直至洗净桶内壁残余乙醇。
14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。
安好鞘液筒。
15、在收集管接口处安装2支新的收集管。
16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。
17、点击Acquisition Control菜单中Acquire。
18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause，Abort。
19、再重复上述步骤2次，共需要1h。
20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L 无菌PBS，盖紧盖子。
安好鞘液筒。
21、在收集管接口处安装2支新的收集管。
22、放上一支装有无菌PBS的进样管。
23、点击Acquisition Control菜单中Acquire。
流式细胞仪分选细胞原理
流式细胞仪分选细胞原理一、流式细胞仪的工作原理流式细胞仪是一种用于细胞分析和排序的仪器，它能够对细胞进行快速、准确的检测和分选。
其工作原理主要包括细胞的流动、激光的激发和检测系统。
1.细胞的流动在流式细胞仪中，细胞悬浮液会通过细胞注射器被注入到仪器中，并通过细胞流动系统进行流动。
细胞流动系统通过精密的泵和管道系统，将细胞以恒定的速率引入到检测区域。
2.激光的激发流式细胞仪中通常使用激光作为激发光源。
激光束经过透镜系统对细胞进行激发。
激光的波长会根据不同的实验需求进行选择。
3.检测系统流式细胞仪的检测系统主要包括散射光检测、荧光信号检测和电阻信号检测。
散射光检测：细胞在激光激发下，会散射光线。
流式细胞仪通过散射光的方向和强度来分析细胞的大小和形态特征。
荧光信号检测：通过给细胞标记荧光染料，流式细胞仪可以检测细胞中特定分子的荧光信号。
这种荧光标记可以用于检测细胞表面标记物、细胞内蛋白或核酸的表达水平等。
电阻信号检测：流式细胞仪还可以通过电极来检测细胞的电阻信号。
这种信号可以用于测量细胞的大小和形状。
二、细胞分选的过程细胞分选是流式细胞仪的重要应用之一，它可以根据细胞的特定特征进行分选和收集。
1.设定分选参数在进行细胞分选之前，需要设定分选的参数。
通常可以选择荧光信号和散射光等参数进行分选，以实现对特定类型的细胞的分选。
2.细胞的识别和分类流式细胞仪会根据设定的参数对细胞进行识别和分类，将细胞分为阳性和阴性细胞。
这种分类可以根据荧光信号的强度或散射光的特征来实现。
3.分选和收集细胞根据设定的分类结果，流式细胞仪会根据细胞的特征进行分选。
通常有两种分选方式：一种是通过电极产生电位差，将阳性细胞和阴性细胞分别引向不同的收集区域；另一种是通过气压或电极产生流体力，将阳性细胞和阴性细胞分别喷射到不同的收集管中。
4.后续实验分选完成后，收集到的细胞可以用于后续的实验。
比如可以进行细胞培养、基因测序、蛋白质分析等。
流式细胞仪分选共25页文档
56、死去何所道，托体同山阿。 57、春秋多佳日，登高赋新诗。 58、种豆南山下，草盛豆苗稀。晨兴 理荒秽 ，带月 荷锄归 。道狭 草木长 ，夕露沾我衣 。衣沾 不足惜 ，但使 愿无违 。 59、相见无杂言，但道桑麻长。 60、迢迢新秋夕，亭亭月将圆。
31、只有永远躺在泥坑里的人，才不会再掉进坑里。——黑格尔 32、希望的灯一旦熄灭，生活刹那间变成了一片黑暗。——普列姆昌德 33、希望是人生的乳母。——科策布 34、形成天才的决定因素应该是勤奋。——郭沫若 35、学到很多东西的诀窍，就是一下子不要学很多。——洛克
流式细胞仪.doc
流式细胞仪主要技术指标1、流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～5000个细胞，大型机可达每秒上万个细胞。
2、流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上＜600个荧光分子，两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。
3、前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小，一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～0.5μm。
4、流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，一般流式细胞仪能够达到＜2.0%，这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。
5、流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。
流式细胞仪原理流式细胞术（FCM）就是对在高速流动的鞘液包括下的细胞、粒子进行分析和分选的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧光标记的。
其特点是测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进行多参数测量，另一特点是在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，这就是分选技术。
一、流式细胞术的概念流式细胞术(FCM)就是对在高速流动的鞘液包括下的细胞、粒子进行分析和分选的技术，这种细胞或粒子是经过特异荧光标记的。
其特点是测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞，且可进行多参数测量，另一特点是在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，这就是分析技术。
二、流式细胞仪的工作原理待测细胞被制成单个细胞的悬液，经特异性荧光染料染色后放入样品管中，在清洁气体的压力下进入流动室。
流动室内充满鞘液，鞘液的作用有二：一是约束样品使之在喷嘴中心以提高测量精度；二是防止样品靠近喷孔壁以避免堵塞喷孔。
在这种约束作用下，细胞排成单列一个跟随一个地在鞘液包括下由流动室下面的喷嘴中心喷出，形成细胞液柱。
液柱与入射的高度聚焦的激光束相交，此时，细胞上的荧光染料被激发而产生特异性荧光。
在与入射激光和液柱都垂直的方向设置有荧光测量系统，包括透镜、光阑、滤片、检测器等，将细胞的荧光信号变成电信号输出到计算机，用专用软件进行分析。
流式细胞仪分析技术
前向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
流式细胞仪分析技术
侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞 时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结 构属性。
流式细胞仪分析技术
侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
流式细胞仪分析技术
波长 • 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 • 透镜组：形成平行光，除去室内光 • 滤片：长通、短通、带通 • 光电倍增管：FS, SS（散射光），
FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
流式细胞仪分析技术
光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
➢新鲜实体组织单细胞悬液的制备
• 机械法 • 酶处理法 • 化学试剂处理法 • 表面活性剂处理法
➢单细胞悬液的保存
• 深低温保存法（一年） • 乙醇或甲醇保存法（2周） • 甲醛或多聚甲醛保存法（2月）
流式细胞仪分析技术
二、常用的荧光染料与标记染色
适用条件:
• 有较高的量子产额和消光系数 • 对488nm的激发光波长有较强的吸收 • 发射光波长与激发光波长间有较大的波长差 • 易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性
胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。 与分选速度成反比。
流式细胞仪分析技术
第二部分 数据的显示与分析
• 参数：FS,SS,FL • 数据显示方式 （单参数直方图 、双
参数散点图 、二维等高图 、假三维 等高图 、三参数散点图 ） • 设门分析技术
流式细胞仪分析技术
一、 参数