下呼吸道分泌物中细菌的分离与鉴定
痰和呼吸道分泌物标本采集规范
痰和呼吸道分泌物标本采集规范一、微生物学【概述】痰标本采集方便，无创伤性，临床应用广泛，对病原学诊断具有重要价值。
痰标本的正确采集、处理是临床细菌检验成功的关键，标本采集与处理的规范化是准确、及时向临床提供重要的感染信息的基础。
目前咳痰标本仍是最常用、最简单的采样方法，必须指导或辅助患者深咳痰，及时送检，并通过镜检筛选合格标本。
损伤性采样技术仅在选择病例(抗生素治疗反应不佳；可疑特殊病原体感染，如寄生虫、痰菌阴性肺结核、混合感染或二重感染等)使用。
【操作方法】1、咳痰标本采集要求患者在清晨用药前留取，因为晨痰量多，且含菌量也多。
留取前刷牙，用清水漱口3次，以除去口腔内大部分杂菌，之后用力咳痰。
咳痰较困难者可用3％～5％氯化钠溶液雾化蒸气吸入进行导痰；对咳嗽乏力或昏迷患者，可用普通吸痰管经鼻腔或口腔吸引下呼吸道分泌物；对不能咳痰的婴幼儿或病重患者，如须采集痰标本做结核杆菌培养，可插胃管抽吸胃液标本送检，也可留取12～24h痰液，经漂浮浓集后检查，以提高结核杆菌检出率。
若做细菌或真菌培养，痰液必须盛于无菌容器内送检。
观察痰量应留取24h痰液，必要时在容器内加入少许防腐剂。
2、咽拭子采样上呼吸道感染可通过咽拭子获取标本。
标本采集前数小时内不得用消毒药物漱口或涂抹病灶局部。
用咽拭子采集标本时应小心、认真、准确，避免触及舌、口腔黏膜和唾液，以防污染。
如咽拭子标本发现致病菌，如肺炎链球菌、流感杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌等，且数量较多时，提示有该菌所致感染存在。
3、纤维支气管镜抽吸采样以利多卡因做咽喉部局部麻醉后，插入纤维支气管镜(纤支镜)，达到肺炎病灶引流支气管内，纤支镜吸引口依次连接标本采集瓶或试管及负压吸引装置，用负压将下呼吸道分泌物经纤支镜吸人标本采集瓶内送检。
气管切开或气管插管患者也可用普通无菌吸痰管直接经人工气道插至大约叶支气管水平，接负压装置将痰液经吸痰管吸入标本采集瓶内。
纤支镜直视下可准确采集病灶部位的分泌物，但插入时纤支镜顶端和内孔常受咽喉部正常菌群污染，所以纤支镜吸引物常规培养结果不能完全代表肺部感染的病原体。
临床细菌培养鉴定流程及报告.介绍
3．分离培养 ⑴一般培养: 用定量接种环或无菌微量 加样器取尿液0.001ml或0.01ml(已使用 抗生素患者),接种于血平板和麦康凯/中 国兰平板,不能定量时需用倾碟法记数， 35～37℃培养18～24小时。 (2)特殊培养: 对临床要求真菌、淋病奈 瑟菌及结核菌等培养者，根据细菌所需 条件接种相应特殊培养基，放臵相应条 件下进行培养。
(三 ) 尿 尿路感染是指尿道内有大量微生物繁殖 而引起的尿路炎症。从肾脏排泌出来的 尿液正常情况下是无菌的，如果在尿液 中分离出细菌（排除污染因素）即为菌 尿，同时伴有感染症状者称为尿路感染。 根据感染部位可分为上尿路感染（肾盂 肾炎）及下尿路感染（膀胱炎），男性 还可出现前列腺炎。
1.尿中常见分离菌
⑵采血时间及采血量 采血培养应该尽量在使
用抗菌药之前进行，在24小时内采集2～3份血
培养（一次静脉采血注入到多个培养瓶中应视
为单份血培养）。对间歇性寒战或发热应在寒 战或体温高峰到来之前0.5～1小时，采集血液， 或于寒战或发热后1小时进行。成人采血量8～ 10ml，儿童1～5ml。血液和肉汤之比1：5 ～1：
(2)标本采集 a.清洁中段尿 最好是晨尿，是临床上 最常留取尿标本的方法 b.耻骨上膀胱穿刺法 是评估膀胱内细 菌感染的“金标准” c.直接导尿法 d.小儿收集包 e.留臵导尿
(3)标本运送 标本采集后应及时送检， 2小时内进行接种，否则应臵4～8℃冰箱 保存，冷藏保存标本时间不得超过8小时。
(2)报告方式 初步报告：在分离出细菌后，进行革兰 氏染色，作出初步报告。 最终报告：有意义的阳性结果报告，应 报告菌落计数、细菌种名及药敏结果。 无意义的阳性结果报告，报告菌落 数、革兰氏染色形态特征，并注明是纯 培养或是混合菌生长。 阴性结果报告:应报告无菌生长和菌落计 数＜1000cfu/ml或 ＜100cfu/ml尿。
痰液及下呼吸道分泌物培养简易操作规程
、痰液及下呼吸道分泌物培养标准操作流程1 观察标本合格后操作。
一般为晨痰，再留取痰之前刷牙、反复漱口，应从气管深部咳出痰，吐进无菌容器内送检。
涂片白细胞小于10，上皮细胞大于25为不合格痰，相反白细胞大于25，上皮细胞小于10-25为合格痰标本。
2 点燃酒精灯，尽量保证无菌中间。
3 接种环灭菌—待冷却后—取痰液—接种到血平板、中国兰平板（或麦康凯平板上）。
平板划线分离培养：（1）用接种环将标本涂布在平板第一区域并作数次划线，在第二三区依次用接种环划线。
（2）每划一区域应将接种环烧灼一次，冷却后再划下一区域，每一区域得划线应接触上一区域得接种线2-3次使菌量逐渐减少以形成单个菌落。
（3）划线完毕将平板加盖倒置（琼脂平板得底部向上）于35°C培养18-24小时。
4观察菌落特征涂片染色，确定阳性菌、阴性菌、球菌还就是杆菌后鉴定种属。
5 做药敏试验-------报告结果。
便培养标准操作流程1、收取有粘液或脓血、稀水粪便标本。
2、点燃酒精灯，尽量保证无菌中间。
3、接种环灭菌—待冷却后—取粪便—接种到血平板、SS平板、中国兰平板（或麦康凯平板上）。
平板划线分离培养：（1）用接种环将标本涂布在平板第一区域并作数次划线，在第二三区依次用接种环划线。
（2）每划一区域应将接种环烧灼一次，冷却后再划下一区域，每一区域得划线应接触上一区域得接种线2-3次使菌量逐渐减少以形成单个菌落。
（3）划线完毕将平板加盖倒置（琼脂平板得底部向上）于35°C培养。
4培养18-24小时后观察菌落特征涂片染色，确定阳性菌、阴性菌、球菌还就是杆菌后鉴定种属。
5 做药敏试验-------报告结果。
尿培养标准操作流程1 收取晨尿第一泡清洁中段尿。
（把外阴用肥皂清洗一遍，再用清水清洗两遍，待干或用干净布擦干）用导尿管得病号需新换导尿管后取标本2 点燃酒精灯，尽量保证无菌中间。
3 接种环灭菌—待冷却后将标本混匀，用定量接种环取尿液1ul(大约一接种环）—接种到血平板，接种环灭菌---待冷后取标本接种到中国兰平板（或麦康凯平板上）。
细菌标本采集规范
临床微生物学标本采取和处理的规范化要求正确的采取、处理与运送用于细菌培养的标本是临床细菌检验成功的关键.标本采取与处理的规范化是准确、及时地向临床提供重要的临床感染信息的基础；而标本采取与处理不当将严重影响检验结果,给临床以误导，延误对患者的正确治疗。
为此，我们提出初步的参考意见，并希望在实践中不断完善。
一、血液细菌培养标本的采集和处理临床上疑为败血症、脓毒血症或其他血液感染的患者,需做血液细菌培养以明确病原。
1．采集方法:静脉采血，以无菌操作方法抽取血液后,直接注入血培养瓶中，轻轻颠倒混匀，以防血液凝固.如果同时作需氧和厌氧培养，应先将标本接种到厌氧瓶中,再注入需氧瓶，严格防止将空气注入厌氧瓶中。
2。
采血时间以及血培养份数:在患者发热期间越早越好,最好在抗菌治疗前，用药前24小时内采集2～3次血液标本,可使细菌检出率高达99％.对间歇性寒战或发热的患者,应在寒战或体温高峰到来之前0。
5～1小时采血，亦可在寒战或发热后1小时采集血液标本。
特殊感染患者采血培养时应遵循以下原则：（1）可疑急性发热性菌血症、败血症患者：应在使用抗菌药物之前，在24小时内从不同部位采集2~3份血液标本培养.(2)可疑细菌性心内膜炎患者、感染性心内膜炎患者：在1～2小时内采集3份血标本培养,如果24小时后阴性,再采集两份血标本培养。
(3）不明原因发热患者：先采集2～3份血标本，抽血间隔60 min，24~36小时后体温升高之前，再采集2份血标本进行培养。
因为1次血培养不足以说明问题,可能会遗漏阳性结果。
（4）可疑菌血症但血培养持续阴性时;应改变血培养方法,以获得罕见或苛养的微生物。
（5）在急性发热性疾病如脑膜炎、细菌性肺炎,需马上做抗菌治疗;或急性骨髓炎、化脓性关节炎等要紧急手术的患者,应立即从两臂分别取2份标本.3。
采血部位:采血部位通常为肘静脉。
疑为亚急性心内膜炎的患者，以肘动脉或股动脉采血为宜。
疑为细菌性骨髓炎或伤寒患者，在病灶或髂前（后）上棘处严格消毒后抽取骨髓。
细菌分离鉴定（完整版）
细菌分离鉴定细菌分离鉴定[细菌分离鉴定]细菌分离鉴定目的要求：熟悉临床标本中常见的病原性细菌的分离鉴定方法，细菌分离鉴定。
实验内容：一、脓汁、咽拭子等标本中病原性细菌的分离与鉴定(一)标本采集1.脓拭子：用无菌棉签蘸取患处深部脓液或分泌物少许，置入无菌空试管内，送检。
2.痰拭子：用消毒容器收集病人痰液，用无菌棉签挑取脓稠痰块，置入无菌空试管内，送检。
3.咽拭子：嘱病人把口张大，用压舌板压住舌根，用无菌棉签迅速蘸取咽部分泌物，置入无菌空试管内，送检。
4.血标本：疑为败血症患者，在严格无菌操作下，静脉采血，床旁直接加入含50ml的肉汤瓶内，立即摇匀后送培养。
5.脑脊液：对疑似流脑患者，作腰椎穿刺取脑脊液，立即行直接床旁接种(送检过程中应注意保温)。
6.尿道、阴-道分泌物：对可疑淋病患者，男性可从尿道取材，取材时导尿管应进入尿道1cm～2cm，如为刚排尿，应等待1h左右;女性则可以从宫颈口取分泌物，当内窥器插入宫颈口后应稍等片刻，再旋转取出，取材应立即送检，不可放置冰箱。
(二)分离鉴定程序待检标本可直接做涂片染色检查鉴定，必要时可做分离培养、生化反应及致病性鉴定。
常见的致病性球菌检查程序如下。
直接涂片、革兰染色、镜检(形态、排列、染色性)脓、痰、咽拭子分泌物、脑脊液观察菌落性状、溶血性、色素血琼脂平板→涂片、染色、镜检↑挑取可疑菌落生化反应血液、穿刺液→肉汤培养基纯分离致病性测定↓药敏试验如培养液混浊时可涂片、染色、镜检(三)常见临床标本的检查方法1．脓拭子在脓汁中除了球菌外，也有杆菌存在，例如革兰阳性的有炭疽杆菌、白喉杆菌、结核杆菌、枯草杆菌等，革兰阴性的有大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌等，此外尚可有真菌、放线菌、螺旋体等。
材料(1) 标本：脓拭子(2) 培养基：血琼脂平板(3) 兔血浆、白色滤纸片、无菌生理盐水、载玻片方法脓汁→革兰染色→镜检↓↑血琼脂平板→观察菌落形态及溶血情况↓致病力试验(1)将脓拭子作革兰染色，镜检(先作培养再涂片以免污染)，鉴定材料《细菌分离鉴定》()。
2024年高级卫生专业技术资格考试微生物检验技术(094)(正高级)试卷及答案指导
2024年高级卫生专业技术资格考试微生物检验技术(094)(正高级)模拟试卷(答案在后面)一、多项选择题（本大题有30小题，每小题1分，共30分）1、以下哪些属于微生物检验技术的基本步骤？（）A. 样品采集与处理B. 微生物分离纯化C. 微生物鉴定D. 药物敏感试验E. 报告撰写2、在微生物分离纯化的过程中，以下哪种方法常用于分离革兰氏阳性菌？（）A. 霍夫曼平板法B. 沙氏平板法C. 肉汤培养法D. 培养基稀释法E. 稀释涂布平板法3、下列关于细菌培养基的选择与配制的说法正确的是：A. 所有细菌的培养都使用相同的培养基B. 选择培养基时需要考虑目标菌株的营养需求和生长条件C. 培养基配制完成后无需灭菌即可使用D. 鉴定肠道致病菌常用SS琼脂作为选择性培养基E. 血平板常用于初次分离培养细菌4、关于抗生素敏感性试验，以下叙述正确的是：A. 抗生素敏感性试验仅对革兰氏阳性菌有意义B. MIC（最小抑菌浓度）法可以定量测定细菌对抗生素的敏感度C. 纸片扩散法适用于所有临床分离菌株的药敏测试D. 抗生素敏感性试验的结果可以直接指导临床用药E. 在进行药敏试验前，必须确保菌悬液浓度符合标准5、下列关于细菌形态学的描述中，正确的是（）A. 革兰氏染色法可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌B. 细菌的形态学观察主要用于细菌的鉴定C. 细菌的形态学观察包括细菌的大小、形状、排列等D. 细菌的形态学观察可以用于判断细菌的致病性6、以下关于细菌生理学的描述中，错误的是（）A. 细菌的生长繁殖需要营养物质、水分、适宜的温度和pH值B. 细菌的新陈代谢包括同化作用和异化作用C. 细菌的同化作用包括自养和异养D. 细菌的异化作用包括光合作用和化能作用7、关于细菌L型的描述，下列哪些是正确的？A. 细菌L型是指在某些条件下细菌细胞壁缺陷而形成的形态B. L型细菌可以通过常规培养基生长C. 它们通常在高渗透压培养基上生长D. L型细菌对青霉素类抗生素敏感E. 由于细胞壁的缺失，L型细菌可以在不利环境下存活8、关于真菌的基本特征，以下哪几项说法是准确的？A. 真菌属于原核生物界B. 大多数真菌通过产生孢子的方式繁殖C. 酵母菌是一种单细胞形式的真菌D. 所有真菌都是多细胞有机体E. 真菌能够进行光合作用9、以下哪些微生物属于革兰氏阴性菌？A. 肠杆菌属（如大肠杆菌）B. 铜绿假单胞菌C. 链球菌属（如肺炎链球菌）D. 霍乱弧菌 10、以下哪些指标可以用来判断细菌的耐药性？A. 最小抑菌浓度（MIC）B. 敏感性试验结果C. 药物敏感度指数D. 耐药基因检测11、下列关于细菌的细胞壁成分及其功能的说法，哪几项是正确的？A. 肽聚糖是所有细菌细胞壁的主要成分。
呼吸道标本细菌学检验操作规程SOP
呼吸道标本细菌学检验操作规程（一）目的：规范呼吸道标本细菌学检验,确保检验结果准确可靠。
（二）适用范围及操作人员：呼吸道标本培养和涂片检检查；检验科工作人员。
（三）支持性文件：《WST805-2022临床微生物检验基本技术标准》、《下呼吸道感染细菌培养操作指南》、《全国临床检验操作规程》。
（四）标本类型：痰、咽拭、支气管肺泡灌洗吸出液、支气管冲洗液或刷子、肺穿刺液等。
（五）标本采集时间：尽量在抗生素使用前采集。
（六）标本采集方法:1、咳痰：适用于肺部感染患者,特别是重病监护室(ICU)及住院的社区获得性肺炎(CAP)、慢性阻塞性肺疾病急性加重(AECOPD)、肺脓肿(咳痰非最适标本)、可疑细菌性病原体引起的肺部感染患者。
咳痰前,患者用无菌生理盐水漱口;指导患者咳出深部痰,勿留取唾液和鼻咽腔分泌物。
2、气管吸出物：仅当气管插管的患者出现肺炎症状时(如发热或浸润),可采集气管吸出物标本。
从气管中吸痰，用无菌容器留取送检。
3、支气管肺泡灌洗液：利用纤维支气管镜向小支气管和肺泡中注入无菌生理盐水灌洗,在40mL～80mL回收的灌洗液中包含约1mL支气管末梢和肺泡中的分泌物;弃去前段可能污染的部分,收集其余部分后立即送检。
4、保护毛刷标本：将纤维支气管镜插入亚段支气管可疑感染部位,经支气管镜刷检孔推出双层套管中的毛刷(远端填塞聚乙二醇),刷取脓性分泌物,采样后将毛刷回收入双层套管并退出纤维支气管镜,用无菌剪刀剪断毛刷,置于含lmL生理盐水的无菌容器中(仅供需氧培养),快速送检。
5、气管穿刺法在环甲膜下穿刺抽取痰液，收集标本，适用于厌氧菌培养。
6、棉拭采集法用无菌棉拭子轻轻擦拭病人鼻咽部黏膜，留取标本，置无菌试管内送检。
（七）标本拒收标准：1、申请单姓名、科别、床号与标本的标签不符。
2、痰标本呈水样或唾液样。
3、痰涂片白细胞<10／低倍视野，上皮细胞>25／低倍视野。
4、标本容器溢漏，无瓶盖。
5、痰标本留取放置时间太长，超过2小时。
下呼吸道感染细菌培养操作规范
4.5质量控制 4.5.1革兰染色 4.5.2抗酸染色 4.5.3培养基 4.5.4试剂 4.5.4.1每批号、每周需做质控的试剂 4.5.4.2每批号、每次试验需做质控的试剂
3
5.1革兰染色报告 5.1.1痰标本报告原则（见表1） “痰/气管吸出物标本涂片革兰染色结果解释” 5.1.2 BAL细胞离心涂片报告
1
内容
1.口咽部定植菌群变化对肺部感染的重要影响
肺部感染的影响因素 (定植菌变化：健康人G+
免疫、基础病/住院、用抗菌药物 G-b )
2.肺部感染的常见机制
主要机制：吸入定植菌；吸入气溶胶；血播性； 附录A:“下呼吸道感染的主要类型及主要病原菌”
3.痰涂片对下呼吸道感染病原菌诊断的重要作用
痰培养：敏感性低 / 培养+ 涂片：提高特异性和敏感性
4.支气管纤维镜标本定量培养的临床意义
特异性82%～91%，诊断价值远高于痰标本； 附录B :“适合诊断的病原及检验项目”
5.下呼吸道感染细菌培养的局限性
培养结果假阴性、假阳性的原因
汇总表 汇总表
2014/5/9
针对医疗机构微生物实验室 针对痰 (细菌) 培养项目：
常规细菌培养方法检测下呼吸道感染病原菌的检验流程 本规范的特色： （1）明确下呼吸道标本适合诊断的病原和检验项目； （2）要求细菌培养项目需同时做革兰染色涂片； （3）规范痰培养/气管吸出物的定性培养程序、气管镜采集标本的定
3.1 标本采集 3.1.1 咳痰 3.1.2 气管吸出物
注：仅当出现肺炎的临床表现（如发热或浸润）时采集气管吸出物标本， 否则勿培养气管吸出物，因气管在插管24h后即有定植菌，培养结果 可能与疾病不符。
3.1.3 血培养 注：当下呼吸道感染患者伴有高热症状时，送检血培养（具体参考血培养
痰液及下呼吸道分泌物培养简易操作规程
.痰液及下呼吸道分泌物培养标准操作流程1 观察标本合格后操作。
一般为晨痰，再留取痰之前刷牙、反复漱口，应从气管深部咳出痰，吐进无菌容器内送检。
涂片白细胞小于10，上皮细胞大于25为不合格痰，相反白细胞大于25，上皮细胞小于10-25为合格痰标本。
2 点燃酒精灯，尽量保证无菌中间。
3 接种环灭菌—待冷却后—取痰液—接种到血平板、中国兰平板（或麦康凯平板上）。
平板划线分离培养：（1）用接种环将标本涂布在平板第一区域并作数次划线，在第二三区依次用接种环划线。
（2）每划一区域应将接种环烧灼一次，冷却后再划下一区域，每一区域的划线应接触上一区域的接种线2-3次使菌量逐渐减少以形成单个菌落。
（3）划线完毕将平板加盖倒置（琼脂平板的底部向上）于35°C培养18-24小时。
4观察菌落特征涂片染色，确定阳性菌、阴性菌、球菌还是杆菌后鉴定种属。
5 做药敏试验-------报告结果。
便培养标准操作流程1.收取有粘液或脓血、稀水粪便标本。
2.点燃酒精灯，尽量保证无菌中间。
3.接种环灭菌—待冷却后—取粪便—接种到血平板、SS平板、中国兰平板（或麦康凯平板上）。
平板划线分离培养：（1）用接种环将标本涂布在平板第一区域并作数次划线，在第二三区依次用接种环划线。
（2）每划一区域应将接种环烧灼一次，冷却后再划下一区域，每一区域的划线应接触上一区域的接种线2-3次使菌量逐渐减少以形成单个菌落。
（3）划线完毕将平板加盖倒置（琼脂平板的底部向上）于35°C培养。
4培养18-24小时后观察菌落特征涂片染色，确定阳性菌、阴性菌、球菌还是杆菌后鉴定种属。
5 做药敏试验-------报告结果。
尿培养标准操作流程1 收取晨尿第一泡清洁中段尿。
（把外阴用肥皂清洗一遍，再用清水清洗两遍，待干或用干净布擦干）用导尿管的病号需新换导尿管后取标本2 点燃酒精灯，尽量保证无菌中间。
3 接种环灭菌—待冷却后将标本混匀，用定量接种环取尿液1ul(大约一接种环）—接种到血平板，接种环灭菌---待冷后取标本接种到中国兰平板（或麦康凯平板上）。
下呼吸道感染微生物检验的标本留取和运送的要求
下呼吸道感染微生物检验的标本留取和运送的要求发布时间：2021-03-22T02:36:38.082Z 来源：《健康世界》2020年16期作者：李晓英[导读] 下呼吸道感染是目前危害大众健康的严重疾病之一，据调查，该病的致死率位列全球疾病死因的第四位，全球每年因下呼吸道感染而死亡的人数占全球总死亡人数的4.83%左右，对于这种危害性极高的疾病，我们需要及时发现、及时治疗，才能够保证患者的生命安全。
李晓英成都锦江大观医院四川成都 610000下呼吸道感染是目前危害大众健康的严重疾病之一，据调查，该病的致死率位列全球疾病死因的第四位，全球每年因下呼吸道感染而死亡的人数占全球总死亡人数的4.83%左右，对于这种危害性极高的疾病，我们需要及时发现、及时治疗，才能够保证患者的生命安全。
而感染性疾病的诊断金标准为病原学诊断，只有了解药敏结果和病原学结果才能够合理选择抗菌药物，正确用药，以此来避免细菌耐药现象的发生，但是病原学诊断结果正确与否，取决于标本的管理，故临床医护人员应该知晓下呼吸道感染微生物检验标本在留取和运送方面的要求，为接下来的微生物检验和临床诊断奠定可靠的基础。
一、下呼吸道感染微生物检验标本类型下呼吸道感染微生物检验标本主要有两种，其一是纤维支气管镜采集的标本，经过纤维支气管镜获取到的支气管肺泡灌洗液和保护性毛刷更适合做细菌定量培养，当潜在的致病菌菌落数高于阈值时，诊断下呼吸道感染的特异度即可达到82%至91%。
纤维支气管镜获取到支气管灌洗液只用于诊断由严格致病菌引起的肺炎，如结核分支杆菌、军团菌，内源性真菌引起的感染，对其他病原菌的检查效果比较差。
其二就是痰标本，分自然咳痰和诱导痰，自然咳痰适合定性培养，且必须结合痰涂片判断标本的质量，提高感染病原菌诊断的特异性和敏感性。
诱导痰不能通过细菌的浓度判断是否有意义，只适用于检测结合分支杆菌以及卡式肺孢子菌，对其他病原菌的检查效果比较差。
相对来讲，纤维支气管镜的诊断价值远高于痰标本。
细菌鉴定中应注意的问题
细菌鉴定中应注意的问题细菌是自然界中数量最大、分布最广、种类最多的病原体，其不仅代谢活力强，繁殖也非常快，并且易于变异，这些特性使得临床进行细菌鉴定时面临着较大的困难。
虽然临床在微生物检验方面不断更新技术、采取各种质量控制措施，但细菌鉴定过程中依然存在许多问题，检验人员若是不加以注意，将很难获得正确的鉴定结果，自然也谈不上对患者病情的准确诊断和有效治疗。
本文试分析阐述细菌鉴定各个环节中应该注意的一些问题。
一、标本采集环节我国有超过8成的医院在细菌标本的采集上存在问题。
以痰液标本为例，大部分痰液标本不合格的原因都是标本中存在除了痰液之外的其他呼吸道分泌物，这些分泌物污染了痰液标本，使其达不到痰液标本要求的质量标准，检验人员不得不将不合格的标本打回，由采集人员再次采集标本，这不仅浪费时间，还会给患者带来不适。
再以尿液标本为例，临床检验要求尿液标本应为患者晨起后的新鲜中段尿，若是刚刚排出的尿液，容易受到膀胱、尿道下段等泌尿器官中其他菌群的污染。
此外，对于术后感染分泌物或外伤分泌物，应采集深部的分泌物，医院要求细菌常规培养不得检出厌氧菌，否则会影响对厌氧菌的诊断准确性，若是采集浅表位置的分泌物，标本将会与空气接触，进而被污染。
此外，细菌标本应确保采集足量，以免需要二次采集。
二、标本送检环节细菌鉴定结果不仅与标本采集质量有关，与送检环节是否合乎规范也有密切联系，送检的过程中若是保存的容器开放，与外界空气和微生物接触，将会导致标本被污染。
此外，尿液标本应在采集后尽快送交实验室进行检验，以免因为尿液营养丰富而在较长的时间内有细菌大量繁殖，导致鉴定结果出现偏差。
血液标本也要尽快送检，若是保存时间过长、保存环境温度过高，血液标本将有可能发生凝血、溶血、变质等问题，也会影响鉴定结果的准确性。
三、分离鉴定环节（一）分离培养环节在进行细菌的分离培养时，应该基于标本的来源、病原菌可能的类型来选择适合的孵育环境和培养基，若有特殊需要，还需要选择特殊的培养基。
下呼吸道感染细菌学检验操作规范(1)
下呼吸道感染细菌学检验操作规范(1)下呼吸道感染细菌学检验操作规范近年来，下呼吸道感染病例不断增加，给医疗卫生事业带来了严峻的挑战。
为了确保下呼吸道感染病例的快速、准确、可靠的检测和诊断，制定下呼吸道感染细菌学检验操作规范，将有助于提高检验水平和工作效率，本文将针对细菌学检验操作规范进行详细介绍。
一、检验前准备1. 确定样本种类：本次检验需使用的下呼吸道标本种类有：痰、咽拭子或喉拭子等。
2. 样本采集：根据患者的情况进行样本采集，采集时要求患者咳嗽并咳出深部痰液，若患者不配合，则可采用吸痰管等工具进行痰液采集。
同时也可以采用喉拭子或者咽拭子进行标本采集。
3. 样本处理：对采集的样本，应及时送到检验室进行处理，加工前需要做出相应的标签，记录样本采集时间、采集标本证号、病人基本信息等。
二、操作流程1. 样本处理(a) 痰液标本处理方法：对于痰液标本，先进行分液处理，即分离痰液中的黏液、脓液、红细胞和有机杂质等。
然后以0.9%氯化钠溶液洗涤一次，摇匀后进行离心（5000r/min，10min）。
(b) 咽拭子或喉拭子标本处理：将采集的咽拭子或喉拭子样本转移到含有0.9%氯化钠溶液的离心管中，然后离心（5000r/min，5min），离心后取上清液进行下一步检验。
2. 检测**(a) 涂片制备：将上述处理后的纯化液采用无菌钢丝圈或无菌载玻片刷取标本并均匀涂在两张干净的干燥擅菌片上，干燥后送至乙醇固定。
(b) 染色：采用Gram染色方法进行染色，首先用碘酒凝固后，将菌片在床头火上迅速脱色，用80%乙酸洗去多余的碘酒和颜料，再冲洗水清洗，细心观察染色质量，必要时要反复染色。
(c) 细菌形态观察：观察染色后菌的形态。
非典型革兰氏染色细胞如需观察需通过进一步检验的手段，如选择恰当的培养基及培养条件等。
(d) 培养：将涂片标本在含有相应营养物质的培养基上培养，观察菌落的形态及生理生化特性，以进行分类鉴定。
常用的培养基及相应的菌种分类可参见《常用细菌分类鉴定表》。
呼吸道感染患者痰菌分离及药敏分析
２ ２ 几 种主要 致病 菌对 常见 抗 生素的 耐药情 况 ．
见 表 ２ 。
ＡＴＣ ２ ９ ２ 肺 炎克 雷 伯菌 ＡＴ Ｃ ０ ６ ３ 购 自卫 Ｃ ５２， Ｃ ７０ ０ ，Fra bibliotek４ ２
ＪＪｎｎ ｄ Ｕｎｖ Ｆ ｂ ｒ ａ ｙ２ １ Ｖｏ． ３， ． ｉｉｇ Ｍｅ ｉ ， ｅ ｅ ｕ ｒ ０ ０， １３ Ｎｏ １
微 生物 全 自动 分 析 仪 、 量 生 化 反 应 管 和 ＡＰ 鉴 微 Ｉ
定 系统对 分 离菌 株进 行 鉴 定 。按 全 国临 床检 验 操
作 规程ｎ 进 行分 离培 养 ， 用 ＶＩ Ｋ３ 采 ＴＥ ２微 生物 全
自动分析 仪 及 Ｋ－ Ｂ纸 片 法 进 行 药 敏 试 验 ， 格 按 严 照 ＮＣ Ｌ Ｃ Ｓ药 敏试 验 规 定 标 准 进 行 。Ｋ Ｂ纸 片 由 — 北 京天坛 药物 技术开 发公 司提 供 。 标 准质控 菌株 ： 金黄 色葡 萄球 菌 ＡＴＣ ２ ９ ３ Ｃ ５２ ，
量： 状上皮细胞＜１ 鳞 Ｏ个 ， 白细胞 ＞ ２ ５个 ／ Ｐ， Ｌ 或
鳞状 上皮 细胞 与 ＷＢ Ｃ之 比＜ １ ２ ５ 为 合 格 痰 标 ：． ， 本 。不合格 的痰标 本 重新 留痰 。
１ ２ 方 法 ．
合 格痰 标 本 采 用 常 规 分 离 培 养 及 ＶＩ Ｋ３ ＴＥ ２
Ｇ一 中依 次为铜 绿假 单胞 菌 、 菌 大肠埃 希 菌 、 炎 克 肺
雷 白杆 菌 、 曼 不 动杆 菌 、 麦 芽 杆 菌 、 沟杆 菌 鲍 嗜 阴 等 ， 菌 中 依 次 为 金 黄 色 葡 萄 球 菌 、 绿 色 链 球 Ｇ 草 菌 ， 菌 中主要 为 白色 念珠 菌 。（ 真 见表 １ ）
病原体分离与鉴定实验技术
病原体分离与鉴定实验技术病原体分离与鉴定是微生物学研究中的重要环节，其结果对于疾病的诊断、预防和治疗具有重要意义。
本文将介绍一些常用的病原体分离与鉴定实验技术。
一、细菌的分离与鉴定1. 样本采集与处理首先，我们需要从患者的体液、组织或病灶中采集样本。
常见的样本包括血液、尿液、痰液、伤口分泌物等。
采集后，样本需要进行适当的处理，如离心沉淀、过滤等，以获取纯净的菌种。
2. 培养与分离将经过处理的样本接种于含有适宜营养物质的培养基上，并进行适当的培养条件，如温度、湿度等控制。
通过观察培养的菌落形态、色素、气味等特点，选择单个菌落进行分离。
3. 形态学鉴定通过显微镜观察菌体的形态特点，如形状、大小、结构等，可以初步判断细菌的分类。
4. 生理生化鉴定细菌具有各种代谢特点，可通过测定其对营养物质的利用能力、产酶能力、产气或产酸能力等特性，进行病原菌的初步鉴定。
5. 血清学鉴定血清学鉴定是通过观察病原菌与抗血清或其他特定蛋白质结合反应，来确定病原菌的种属或亚种属。
该方法常用于鉴定沙门菌、流感嗜血杆菌等。
二、病毒的分离与鉴定1. 细胞培养法病毒的分离最常用的方法之一是细胞培养法。
将待测样本接种于合适的细胞系，并观察细胞的形态变化、细胞的病变以及病毒是否复制等现象，可以初步判断是否存在病毒感染。
2. 核酸扩增技术核酸扩增技术是近年来病毒鉴定的重要方法之一。
通过PCR、实时荧光定量PCR等技术可以快速、准确地检测病毒的核酸序列，从而进行病毒的鉴定。
3. 血清学检测病毒感染后，机体会产生特异性的抗体。
通过血清学检测，可以检测患者血清中是否存在特定病毒的抗体，从而进行病毒鉴定。
三、真菌与寄生虫的分离与鉴定1. 样本采集与处理对于真菌和寄生虫的分离与鉴定同样需要采集患者的组织、分泌物等样本，样本的处理与细菌类似，需要消毒、离心等步骤。
2. 培养与分离将样本接种于含有适宜营养物质的培养基上，并进行适当的培养条件控制，如温度、湿度等。
下呼吸道感染细菌学检验操作规范-V1
下呼吸道感染细菌学检验操作规范-V1正文：下呼吸道感染细菌学检验操作规范一、前言下呼吸道感染是常见疾病，在临床中必要时需进行细菌学检验。
准确、规范的检验操作能够提高检验结果的准确性和可靠性，为临床诊疗提供科学依据。
本规范是根据相关理论和实践理念，依据实验室质量控制标准及操作规程，对下呼吸道感染细菌学检验进行规范。
二、样本采集1. 选择合适的采集时间：应在晨起后采集，因为上呼吸道分泌物可能污染下呼吸道样本。
2. 检验前禁食禁水：样本采集前应禁食2-3小时。
3. 涂片制备：应该选择新鲜样本制作涂片，将样本从气管插管或支气管导管中采集，避免口咽部分泌物污染。
用无菌取样管采集后制作涂片，将涂片空气干燥并标记好患者姓名及编号。
4. 样本保存：采集后应立即送至实验室，避免长时间储存，同时应保持样本的温度和湿度。
三、实验室检验1. 样本处理：接收样本后应先进行标本登记，然后进行样本处理。
将样本进行深部咳痰涂片和培养，同时进行革兰染色和氧化酶试验等检验。
2. 培养条件：样本应在充足的氧气供应下进行培养，同时应选择适当的温度和时间进行培养。
3. 培养基选择：根据感染细菌科类别，选择适宜的培养基进行培养。
4. 取样及分离：分离出完整菌落后，应进行鉴定。
不同菌种应进行适当的检验，如荚膜、氧化酶及糖发酵等试验。
5. 结果解释及报告：根据结果及时进行结果解读，避免结果误判和报告失误。
四、实验室质量控制1. 内部质控：实验室应制定内部质量控制程序及相应的质控标准，并按时进行检验。
2. 外部质控：实验室应积极参加外部质量控制项目，及时反馈质量问题并进行改进。
3. 仪器设备的维护和保养：实验室仪器设备的维护与保养相当重要，应按照规定的程序进行保养，避免操作失误和仪器损坏。
五、安全措施1. 实验室人员应严格遵守规范操作，如戴手套、口罩，保证实验室的卫生和安全。
2. 避免细菌感染和交叉污染，在操作过程中应严格遵守操作规程和卫生要求。
下呼吸道标本结果报告
下呼吸道标本结果报告
一、标本类型：下呼吸道标本包括痰液、支气管肺泡灌洗液等。
二、检验项目：
外观：观察标本的颜色、性状、有无血丝、脓性分泌物等。
细胞学检查：计数白细胞、红细胞、鳞状上皮细胞、柱状上皮细胞等，了解炎症程度和细胞类型。
微生物学检查：检测细菌、病毒、真菌等微生物，明确感染的病原体类型。
抗原检测：针对某些特定病原体，检测其抗原成分，以明确诊断。
抗体检测：检测血清中针对某些病原体的抗体，了解感染情况及免疫状态。
细菌培养：对痰液或支气管肺泡灌洗液进行细菌培养，明确病原菌的种类及药敏试验，指导临床用药。
结核分枝杆菌检查：对疑似肺结核患者进行痰液或支气管肺泡灌洗液的结核分枝杆菌检查，明确诊断。
其他特殊检查：根据临床需要，进行其他相关的特殊检查，如分子生物学检测等。
三、报告形式：下呼吸道标本结果报告应以书面形式出具，包括检验项目、结果、参考值、结论等内容。
如有异常
结果，应在结论中注明，并给出相应的建议和处理方案。
四、报告时限：一般情况下，下呼吸道标本的微生物学检查、细菌培养等项目需要一定时间进行培养和鉴定，因此报告时限可能会有所延长。
具体时限应根据实验室实际情况而定，一般会在24-48小时内出具报告。
如有特殊情况，应及时通知相关医生或患者。
下呼吸道感染细菌学检验操作规范
（一）标本采集方法
2.支气管镜采集法、防污染毛刷采 集法、环甲膜穿刺经气管吸引法、经胸 壁针穿刺吸引法和支气管肺泡灌洗法， 均由临床医生按相应操作规程采集，但 必须注意采集标本时尽可能避免咽喉部 正常菌群的污染。
（一）标本采集方法
呼吸困难 呼吸急促或哮喘，常伴有胸痛。
真杆菌、丙酸杆菌、乳酸杆菌
3.小儿取痰法 用弯压舌板向后 尚合格可用于细菌培养
表1 呼吸道标本中常见分离菌
革兰阳性菌
革兰阴性菌
草绿色链球菌、肺炎链球菌、 韦荣球菌
化脓性链球菌
脑膜炎奈瑟菌、其他奈瑟菌
表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、卡他、消化链球菌、消化球菌、沙雷菌、变形杆菌
肠球菌
大肠埃希菌及其他肠杆菌科细菌
真杆菌、丙酸杆菌、乳酸杆菌 百日咳鲍特菌、不动杆菌
标本标识必须唯一，并与申请单相符，未标采集时间、部位或检验要求等拒收。
6的10g/L胰酶溶液等），放置35°C待充分液化再行接种。 幼儿还可用手指轻叩胸骨柄上方，以诱发咳痰。
（二）标本验收与拒收
遇有不合格标本应及时与临床联系，反 馈不合格标本拒收的具体理由。
下呼吸道细菌学检验标本验收与拒收见 下：
1.呼吸道有大量的正常菌群存在，咽拭 子、咳痰、吸出的分泌物厌氧菌培养无意义。
（二）标本验收与拒收
2.申请单填写应完整无误。标本标识必须 唯一，并与申请单相符，未标采集时间、部 位或检验要求等拒收。
3.痰标本呈水样或唾液样，拒收。
4.涂片白细胞和鳞状上皮细胞计数：白细 胞＜10／低倍镜和鳞状上皮细胞＞25／低倍 镜，表示该标本已污染正常菌群，建议重送 标本。
（二）显微镜检查 下呼吸道细 菌学检验的标本均需涂片革兰染色进 行常规的白细胞和鳞状上皮细胞显微 镜下计数和细菌学检查，其目的是判 别送检的标本是否合适做细菌培养， 并初步判定有否病原菌、病原菌的数 量及其类别，有助于初步报告、选择 培养基和对培养结果的综合分析。
呼吸道感染病原体检测技术
感染新冠病毒后，病毒载量在症状出现前约 2 天升 至最高水平，并在 5 天内保持较高水平，然后在 7 ~ 8 天后下降，但除免疫功能低下的患者外，多数 患者的活病毒可在 7 ~ 10 天内降为零。
血液中最早出现的抗体是 SARS-CoV-2 IgM，通常 在症状出现后 5 ~ 7 天出现。并不是所有的患者都 会产生 IgM，IgM 在血液中的含量比 IgG 上升得快， 下降得早，IgM 抗体是感染大多数病原体的标志物。
标本采集
涂片染色镜检
阳性检出率
约10%
分离培养（平板
微生物鉴定（生
培养或血培养）
化鉴定）
药敏试验
先进行痰液标本质量判定， 扁平鳞状上皮细胞≥10个 而白细胞＜25/低倍镜视野 建议标本重采，用革兰染 液对痰液或支气管肺泡灌 洗液的涂片样本进行染色 后镜检，根据涂片染色结 果粗略判断革兰氏阴阳性 球杆菌？疑似哪种病菌/真 菌（念珠菌），提供临床 经验性用药和选择合适培 养基分离培养。
真菌（GM试验）
抗原检测法 血清、BALF
因素第5位
呼吸道感染居全球疾病负担前列
• 据世界卫生组织估计，2016 年ARI 已导致全球近3 0 0 万人死亡。2 0 2 1 年全球疾病负担研究 结果显
• 示，2019 年下呼吸道感染位居全球主要死亡原因的第四位，2021 年新型冠状病毒（severe acuterespiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染位居第二位，导致2019 年至2021 年间全球预期寿命下降了1.6 岁。
LI Z J, ZHANG H Y, REN L L, et al. Etiological and epidemiological features of acute respiratory infections in China[J]. Nat Commun, 2021, 12(1): 5026.［1］ GBD Demographics Collaborators. Global age-sexspecific mortality, life expectancy, and population estimates in 204 countries and territories and 811 subnational locations, 1950-2021, and the impact of the COVID-19 pandemic: a comprehensive demographic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021[J]. Lancet, 2024, 403(10440):
医院感染诊断标准
⑵颅内脓肿(包括脑脓肿、 硬膜下和硬膜外脓肿等)
⑶椎管内感染
√六、泌尿系统
√七、手术部位 1、表浅手术切口感染 2、深部手术切口感染 3、器官(或腔隙)感染
八、皮肤和软组织 1、皮肤感染 2、软组织感染 3、褥疮感染 4、烧伤感染 5、乳腺脓肿或乳腺炎
6、脐炎
病毒、结核杆菌等的感染。
6、医务人员在医院工作期间获得的感染。
不属于医院感染★
1、皮肤粘膜开放性伤口只有细菌定植而无炎 症表现。
2、由于创伤或非生物性因子刺激而产生的炎 症表现。
3、新生儿经胎盘获得(出生后48小时内发病) 的感染，如单纯疱疹、弓形体病、 水痘等。
4、患者原有的慢性感染在医院内急性发作。 注：医院感染按临床诊断报告，力求做出病
血液中性粒细胞增多伴核左移，且无其它原因可 以解释 4、T>38℃或T<36℃＋休克
诊断标准
十五、败血症或菌血症 病原学诊断： 1.血液培养分离出病原微生物。 2.血液中检测到病原体的抗原物质。 说明：入院时有经血液培养证实的败血症，在入院
后血液培养又出现新的非污染菌，或医院败血症 过程中又出现新的非污染菌，均属另一次医院感 染败血症。
病变
（要排除非感染性原因：肺栓塞、心衰、肺水肿、肺 癌等）
4、慢性气道疾患患者稳定期继发急性感染＋病原学改 变
5、慢性气道疾患患者稳定期继发急性感染＋ X线改变 （与入院时比较有明显改变或新病变）
诊断标准
二、下呼吸道感染： ★
病原学诊断：包括培养和血清免疫学检测或 病理学检测。
病人同时有上呼吸道和下呼吸道感染时，仅 需报告下呼吸道感染
流行病史：有输血或应用血制品史、不洁食物史、 肝炎接触史
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
ＳＤＡ平板，以直径３ ｌｎｍ的
无菌钻孔器在平板四周打４个孑Ｌ，分别加入１００％ 吐温４０、吐温６０、吐温８０，３５℃培养３ ｄ后观察生 长情况。（２）点种法［Ｉ训：配制０．５麦氏浓度待检菌 液，吸取菌悬液５出分别滴加于含２％吐温２０的 ＳＤＡ培养基上，３５℃培养５ ｄ，记录结果，明显生长 为阳性，不生长为阴性。 ７．七叶苷分解试验：将待检菌接种于七叶苷琼 脂斜面培养基上，并在斜面上滴ｌ滴橄榄油，３５℃ 培养３ ｄ，观察培养基的颜色变化。培养基斜面变黑 者为阳性，不变色为阴性。 ８．过氧化氢试验：滴加ＩＤ－ＡＳＥ触酶试剂ｌ滴 于吐温一科玛嘉平板上的待检菌菌落上，立即观察，
９７９５由上海华山医院抗生素研究所胡付品博
士馈赠。
２．试剂与仪器：科玛嘉念珠菌显色培养基
（ＣＨＲＯＭａｇａｒＴＭ Ｃａｎｄｉｄａ）为法国柯玛嘉产品，沙保弱
琼脂（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ
ｄｅｘｔｒｏｓｅ
ａｇａｒ，ＳＤＡ）购自北京陆桥
技术有限责任公司。糠秕马拉色菌分离培养基（筛 选平板）为加１％吐温６０的科玛嘉念珠菌显色培养 基（吐温．科玛嘉平板）。４％蓖麻油的ＳＤＡ平板，加
Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ知咖ｒ ｂｙ
Ｐａｒｋｅｒ ｉｎｋ ｓｔａｉｎｉｎｇ．ｎＩｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ａｎｄ
ｃｕｌｔｍ刮ｏｎ
ＣＨＲＯＭａｇａｒ ｍｅｄｉｕｍｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｌ％Ｔｗｅｅｎ ６０（ｗｈｉｃｈ ｗａＥ，ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ Ｃａｎｄｉｄａ ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ
ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｐｕｒｅ ｃｏｌｏｎｉｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｔａｉｎｉｎｇ，ｇｒｏｗｔｈ ｏｎ Ｓａｂｏｕｒａｕｄ ａｇａｒ ｐｌａｔｅｓ，Ｔｗｅｅｎ ｔｅｓｔ，ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｎｇ Ｅｓｃａｌｉｎ，Ｃ８ｔａｌ鹤ｅ ｔｅｓｔ，Ｔｗｅｅｎ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｃａｓｔｏｒ Ｔｈｅ ｏｉｌ ｔｅｓｔ．Ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｌ ８ｓ ｒＲＮＡｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｆｕｒｆｕｒ ｆｒｏｍ ｌｏｗｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ ｗａｓ ４７．４％（６３／１３３）ａｎｄ ６３ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｙ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍａｔｈｏｄｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ １８ｓ ｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｃａｎ ｂｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄ ｆｒｏｍ Ｃａｎｄｉｄａ ｂｙ ｄｉｒｅｃｔ ｓｍｅｓＡ＂
马拉色菌为一种嗜脂性酵母，属人体皮肤正常 的菌群，也是一种条件致病真菌。到２０世纪９０年 代中期，有学者基于形态学、超微结构、生理生化特
万方数据
史堡焦熊医堂盘查垫１２生！旦箜翌鲞箜！翅垦竖璺』！些堕鲤，叁坚塾垫！兰：！丛篁：墨垒墨 征以及分子生物学的研究，将马抟色菌分为厚皮马
拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ）、合轴马拉色菌
Ｈｏ鸭－ｔＯＯ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ
Ｃｌｉｎｉｃａｌ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂｅ日堍Ｈｏｓｐｉｔａｌ
ｏｆ ｔｈｅ
Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｉｊｉｎｇ
ｉ００７３０．Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ｃＨＥＮ Ｄｏｎｇ－ｋｅ．Ｅｍａｉｌ Ｉｖ—ｄ－ｋ＠２６３．ｎｅｔ
Ｆｒｏｍ Ｍａｒｃｈ ２０１０
１３３ ｌｏｗｅｒ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｔｒａｃｔ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｈｉｃｈ ｗｅ托ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ
ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ｔｈｅ
Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１ １， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ
・７ｌｌ・
．论著．
下呼吸道分泌物中糠秕马拉色菌的
分离与鉴定
陈东科许宏涛
【摘要】 目的对痰涂片镜检可疑为马拉色菌的标本进行马拉色菌的分离培养，并对分离菌株
进行系统鉴定。方法收集２０１０年３月至２０１ １年９月卫生部北京医院经派克墨水染色镜检可疑为 马拉色菌的下呼吸道分泌物标本１３３份，接种于含ｌ％吐温６０的科玛嘉琼脂培养基（即改良念珠菌 显色培养基），于３５℃大气环境中培养。挑取疑似菌落在含０．５％吐温４０和０．５％吐温印的沙保弱 平板上进行纯培养。采用传统的表型鉴定方法对分离菌株进行鉴定，包括染色镜检观察菌体形态及 染色性、沙保弱培养基生长试验、吐温试验、七叶苷分解试验、过氧化氢试验、吐温沉淀试验和蓖麻油 试验，可疑菌株采用１８ｓ ｒＲＮＡ基因序列分析方法对分离菌株进行菌种鉴定。结果镜检可疑的下呼 吸道分泌物中马拉色菌分离率为４７．４％（６３／１３３），６３株分离菌经传统的表型鉴定方法结合１８ｓ ｒＲＮＡ基因序列分析方法均鉴定为糠秕马拉色菌。标本直接涂片，用派克墨水染色镜下可明显区分 马拉色菌和念珠菌。结论糠秕马拉色菌在改良念珠菌显色培养基上的菌落呈粉红色，可明显区别 于其他念珠菌菌落，用改良念珠菌显色培养基可提高下呼吸道分泌物中糠秕马拉色菌的分离率。传
品。橄榄油为西班牙亿芭利橄榄油公司产品。
二、方法 １．标本筛选：痰标本经革兰染色、镜检，发现有
７个种…。近年来，随着分子生物学研究的进展尤其 是核糖体ＤＮＡ测序和随机扩增多态性分析在真菌 分型上的应用，又有皮肤马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ
ｄｅｒｍａｔｉｓ）江１、马属马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｅｑｕｉ）Ｈ Ｊ、同 本马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、大和马拉色菌 （Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｙａｍａｔｏｅｎｓｉｓ）¨Ｊ、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｎａｌ２ｚｚ［ｓｊ及
（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｙｍｐｏｄｉａｌｉｓ）、糠秕马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ
面培养基均购自杭州天和微生物试剂有限公司。触
酶试剂ＩＤ—ＡＳＥ、革兰染色液购自法国生物梅里埃公 司。派克标准墨水（Ｂｌｕｅ－Ｂｌａｃｋ ｉｎｋ）为上海派克笔 有限公司产品。蓖麻油为湖北科田药业有限公司产
ｆｕｏｒｕｒ）、钝形马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｏｂｔｕｓａ）、球形马拉 色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｇｌｏｂｏｓａ）、限制马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｒｅｓｔｒｉｃｔａ）和斯洛菲马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｌｏｏｆｆｉａｅ）
ｍｅｄｉａ）ｉｎ ｔｈｅ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｔ ３５℃．Ｔｈｅ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｃｏｌｏｎｉｅｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｏｎ ｂｅｔｈ ＳＤＡ ｐｌａｔｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．５％Ｔｗｅｅｎ ４０ ａｎｄ ＳＤＡ ｐｌａｔｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ０．５％Ｔｗｅｅｎ ６０．Ｔｈｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ
相关，常侵袭皮肤角质层引起浅部真菌病。在已公 认的马拉色菌７个种中，糠秕马拉色菌较为常见，其
最常导致的疾病为花斑糠疹，糠秕马拉色菌还可引
菌株ＡＴＣＣｌ４５２１和球形马拉色菌ＣＢＳ ９７９５做质控 对照。 ４．形态学鉴定：取分离菌株涂片，用５００
ｍｌ／Ｌ
起败血症、腹膜炎、肺炎等【８］。本研究探讨了临床
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
ｓｍｅａｌ鸭．ａｎｄ ｔｈｅｎ
ｔｏ
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅｓ
Ｔｏ
ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｅ Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ
ｆｉｌｌｆｕｒ
ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｓｕｓｐｅｃｔｅｄ ｉｎ ｓｐｕｔｕｍ
ｔｏ
ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ．ｎｅｔｈｏｄｓ
ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ｒａｔｅ
ｗｅｒｅ ａｌＳＯ ｉｄａｎｔｉｆｉｅｄ鹪Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ
ｆｌｌ咖ｒ
ｏｆ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｍｅｎ ｗｉｔｈ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
Ｐａｒｋｅｒ ｊｎｋ ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ
ｍｅｄｉａ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ
Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ危币‘，Ｗａｓ ｆｏｕｎｄ
ａ８
产生气泡则为阳性，不产生气泡为阴性。 ９．吐温沉淀试验：在加０．５％吐温４０和０．５％
吐温６０的ＳＤＡ培养基上观察马拉色菌的菌落周 围，如果出现白色沉淀圈，即为吐温沉淀试验阳性。 １０．蓖麻油试验：（１）打孔法：配制０．５麦氏浓
２％吐温２０、４０、６０、８０的ＳＤＡ，加０．５％吐温４０和
患者下呼吸道标本中糠秕马拉色菌的分离及鉴定
派克墨水染色后镜下观察形态为卵圆形出芽孢子。 ５．沙保罗培养基生长试验：将分离菌种接种于 ＳＤＡ培养基上，３５℃培养１４ ｄ，记录生长情况。 ６．吐温试验：（１）打孑Ｌ法：配制０．５麦氏浓度待 检菌液，密涂直径９０
ｌｎｍ
情况。
材料与方法 一、材料 １．标本来源：标本采自２０１０年３月至２０１１年 ９月卫生部北京医院呼吸道感染患者的气管吸痰 ４５００份。直接涂片经革兰染色镜检，镜下找到形态 疑似马拉色菌为入选标准，剔除同一患者的重复标 本，共１３３份疑似标本。糠秕马拉色菌ＡＴＣＣｌ４５２１ 由四川省人民医院喻华老师馈赠，球形马拉色菌
Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ
ｃａｐｒａｅ【６ｊ
可疑为马拉色菌（革兰染色阳性、成群圆形或卵圆 形、单出芽、芽生孢子与母孢子连接处可见颈圈样结
构）的标本，另涂片作派克墨水染色，镜检确认（念 珠菌孢子不着色）后接种马拉色菌筛选平板。 ２．菌株分离培养：挑一环镜检阳性的标本接种 于吐温科玛嘉平板上，用接种环密涂，于３５℃大气 环境，孵育２ ｄ开始观察。挑取小圆。白色至粉红 色，突起，较干燥，有特殊芳香气味的菌落涂片，用派 克墨水染色后镜检，疑似菌株在加０．５％吐温４０和 ０．５％吐温６０的ＳＤＡ平板上进行纯培养。孵育至